Name: Manipulation génétique de la souris en développement à travers lhypothalamus In utero Électroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez l'électroporation in utero dans l'hypothalamus de souris pour manipuler les gènes en développement embryonnaire. Cette méthode permet d'activer ou de réprimer des fonctions géniques spécifiques chez Mus musculus.

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Ce travail a été financé par la Fondation allemande pour la recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

1. Préparation de l&#39;ADN et verre Micropipettes pour injection <ol><li> Bonne Pipette en verre de qualité sont essentiels pour réduire le taux élevé d&#39;avortements initiale due à la perte de liquide amniotique. La procédure de tirer micropipettes de verre a été bien documenté 13,18,25. Utiliser 1,2 mm de diamètre capillaires tirée dans une Sutter classique P-97 appareil avec les paramètres P = 500; chaleur = 300; Tirer = 40; Velocity = 50; Temps = 50. Monter l&#39;extracteur avec 3 mm de filaments de «creux» (Sutter Instrument FT330B). Les filaments de taille de 2 mm ont donné pour nous des résultats moins satisfaisants. D&#39;autre part, le biseautage des pointes de micropipette ne semble pas améliorer les résultats pour nous. </li><li> Dissoudre purifié, l&#39;ADN plasmidique sans endotoxine dans PBS (Cell Culture Grade) contenant 0,1% de Fast Green à une concentration finale de 1 à 2 pg / pl. The Green rapide fera la solution injectée visible dans le ventricule cérébral embryonnaire. </li><li> Charge de 10 pi de la solution d&#39;ADN dans la micropipette de verre. </li&gt; <li> Raccorder la micropipette de verre pour le système d&#39;injection (pompe à Pico) ou d&#39;une pipette de bouche. </li></ol> 2. Anesthésie Préparer la table d&#39;opération avec un coussin chauffant et les instruments chirurgicaux. Activer les sources de lumière froide pour faciliter la visualisation des embryons. Désinfecter les outils chirurgicaux en utilisant par exemple une bille de verre stérilisateur. Trois procédures d&#39;anesthésie sont possibles pour ce protocole (voir la discussion). Ici, nous allons décrire celui que nous considérons le meilleur, en utilisant inhalation isoflurane pour l&#39;induction de l&#39;anesthésie (débit de 0,5 L / min) ainsi que la maintenance (débit de 1 l / min). <ol><li> Introduire la souris enceinte dans un petit transparent (si la souris reste visible) récipient relié à la Komesaroff Mark 5 anesthésique périphérique par une courte longueur de tube. </li><li> Remplir le vaporisateur avec de l&#39;isoflurane, puis ouvrez la bouteille d&#39;oxygène relié à l&#39;appareil. Soufflez un ou deux impulsions de isoflurane / oxygène (0,5 L / min) dans le récipient tenant la souris et montre pour la narcose à mettre po </li><li> Prenez la souris sur, couvrir les yeux avec de la pommade pour les empêcher de sécher et monter le masque d&#39;anesthésie de l&#39;écoulement sur la tête immédiatement. </li></ol> 3. Laparotomie <ol><li> Placez la souris ventre en l&#39;air sur le coussin chauffant (sinon sa température corporelle va baisser très rapidement, ce qui diminue les chances de reprise) et sécuriser son corps en place en fixant ses quatre pattes sur les côtés avec du ruban adhésif. Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie en vérifiant la perte de la réponse à la stimulation réflexe (par exemple orteil ou pincement de la queue avec une pression ferme). </li><li> Raser la surface abdominale et désinfecter avec le iodophorpovidone-iode (Braunoderm). </li><li> Faire une incision longitudinale (1 à 1,5 cm de longueur) sur la peau de l&#39;abdomen. Ensuite, couper le péritoine. Placez la gaze de coton autour de l&#39;incision. Faire une corne utérine visible et retirez-le délicatement avec une pince émoussée sur le PBS rincé gauze. Rincer l&#39;utérus avec PBS très souvent pour le garder toujours humecté (Figures 2A et 2B). Pendant toute la procédure éviter de tirer le mésomètre ou de l&#39;utérus serré, puisque haute pression à l&#39;intérieur de l&#39;utérus transmettra à l&#39;embryon augmente les chances de perte de fluide lors de l&#39;injection entraîne l&#39;avortement. </li></ol> 4. Injection d&#39;ADN dans le ventricule cérébral <ol><li> Maintenir l&#39;utérus de manière à ce que les ventricules cérébraux peuvent être visualisées. Ne pas largement repositionner un embryon qui se trouve dans une position défavorable - cela ne fera qu&#39;accroître les chances de l&#39;avortement. </li><li> En regardant la tête de l&#39;embryon, de haut, de localiser visuellement l&#39;écart ou fissure entre les deux hémisphères du cortex gauche et droite. Les hémisphères sont faciles à distinguer et les ventricules latéraux intérieur d&#39;eux (pour ne pas être la cible) peuvent généralement être perçus comme des formes un peu plus sombres. Si l&#39;embryon se trouve être parfaitement orientée pour l&#39;injection d&#39;ADN (Figures 2C et 2D), il est possible de percer la paroi utérine et entrent dans le troisième ventricule à la fois. Maintenez la micropipette de verre à 45 ° de la paroi utérine et une ponction à la fin rostrale de l&#39;écart entre les hémisphères corticaux, pénétrant pendant environ 1 mm. De cette manière, la pointe de la micropipette de verre va entrer dans le troisième ventricule cérébral (pas le ventricule latéral) (figures 2C et 2D). En moins favorablement orientés embryons, il est utile de commencer par la paroi utérine Pierce (toujours à 45 °) dans le voisinage de la tête embryonnaire, placer la pointe micropipette dans la bonne position entre les hémisphères corticaux et seulement ensuite perforer le cerveau. Injecter environ 1 pl de solution d&#39;ADN dans le troisième ventricule (une bonne injection remplit le ventricule avec du liquide vert). Répétez la même procédure avec tous les embryons d&#39;une corne utérine. Ceci permet un certain temps pour la solution d&#39;ADN à mélanger uniformément avec le fluide du ventricule et à atteindre la entire neuroépithélium. </li></ol> 5. Cibler l&#39;hypothalamus pour l&#39;électroporation <ol><li> Mettez le électroporateur et ajuster les réglages en fonction de l&#39;âge embryonnaire (E12.5 nous utilisons pour 5 impulsions rectangulaires, 50 V, 50 msec ON/950 ms OFF). Utilisation telle que le pôle positif de l&#39;électrode d&#39;aiguille en acier inoxydable (CUY550-10) et en tant que pôle négatif d&#39;une électrode plate ronde (CUY700P4L). (Il est important que les électrodes sont plus petits que l&#39;embryon, puisque le courant contraire coule juste autour de l&#39;embryon, mais pas au travers.) </li><li> Sélectionnez pour l&#39;électroporation ces embryons dont la face dorsale est en hausse (c. tourné vers l&#39;expérimentateur) (comme la plupart d&#39;entre eux sont), et jetez ceux dont l&#39;orientation est pas favorable. Il est maintenant sûr de toucher l&#39;utérus avec les doigts éthanol ou désinfectée avec des gants. Tenir l&#39;utérus avec une pince, cependant, cela nuirait à la circulation du courant au cours de l&#39;électroporation. </li><li> Percer la paroi utérine par la tête de l&#39;embryon entre le amniotic sac et le placenta en poussant vers le bas à travers elle à la pointe de l&#39;électrode à aiguille. Utilisation de l&#39;index de l&#39;autre côté en tant que bloc de poussée. Environ 5 mm de la pointe de l&#39;électrode doit être présent entre le sac amniotique et la paroi utérine, à peu près au niveau du mésencéphale (figures 2E et 2F). N&#39;oubliez pas que c&#39;est le &quot;électrode ciblage», de sorte que sa position va déterminer quelle partie de la neuroépithélium hypothalamique est le plus susceptible de se transfectées. L&#39;embryon doit être très doucement &quot;pressé&quot; entre les électrodes. </li><li> Avec l&#39;autre main, la position de l&#39;électrode, plat et circulaire en dehors de la paroi de l&#39;utérus, du côté opposé de la tête de l&#39;embryon (figures 2E et 2G). </li><li> Utilisez la pédale pour appliquer une tension (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsions rectangulaires). </li><li> Tirez doucement sur l&#39;électrode d&#39;aiguille de l&#39;utérus tout en retenant l&#39;utérus avec l&#39;index de l&#39;autre main - si amnioliquide tic est perdue par le mur percé, généralement l&#39;embryon va subir un avortement. Répétez la procédure avec tous les embryons. </li><li> Retour de la corne de l&#39;utérus dans l&#39;abdomen et répéter l&#39;injection et l&#39;électroporation dans la corne reste. </li></ol> 6. Finition de la chirurgie <ol><li> Après l&#39;injection et l&#39;électroporation de tous les embryons, placez l&#39;utérus dans l&#39;abdomen très soigneusement, positionné exactement comme ils étaient avant et humide de la cavité péritonéale avec une solution saline avant de le refermer. </li><li> Suturer le péritoine avec Catguts (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Pour la fermeture de l&#39;utilisation de la peau &quot;interrompu point&quot; methodwith un de suture plus résistant (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner AUX 07171L). </li><li> Désinfecter la surface de l&#39;abdomen avec povidone-iode (Braunoderm) et injecter un non-stéroïdien anti-inflammatoire cutanée (par exemple 100 pi d&#39;une solution à 1:10 de Rimadyl dans NaCl à 0,9%) ou, mieux encore, un opioïde comme buprenorphine (Temgesic, de 0,05 à 0,1 mg / kg de poids corporel dans NaCl à 0,9%) pour soulager la douleur. </li><li> Retirez la mère de l&#39;appareil d&#39;anesthésie et le placer dans une cage qui est chauffé par un coussin chauffant. Surveiller la souris continuellement jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement rétabli de l&#39;anesthésie. Par la suite, vérifiez les animaux tous les jours pour s&#39;assurer qu&#39;ils se remettent de la procédure, sans aucun signe d&#39;infection ou de la douleur. </li></ol> 7. Analyse des résultats <ol><li> Récolter des embryons (ou postnatals) en fonction du jour de l&#39;analyse souhaitée. Souris postnatal (vieux de 1 à 2 jour) sont tués par décapitation. </li><li> Séparez chaque embryon en fonction de la précédente annotation d&#39;électroporation. Disséquer le cerveau sous une loupe binoculaire et regarder sous le microscope de signal fluorescent vert (de la journaliste GFP) dans la région appropriée. </li><li> Le cerveau sélectionné peut être analysée &quot;frais&quot;: fixer le tissu pendant une courte période dans du paraformaldéhyde 4% et l&#39;intégrer dans agarose 4% ou dans de la gélatine-albumin, alors l&#39;article sur un périphérique vibratome type (Figure 3). Pour une analyse immunohistochimique plus détaillée (figure 4), cryo-protéger le cerveau dans une solution de saccharose à 30%, intégrer dans un milieu de montage (OCT Tissue Tek) puis réduction de 20 sections um dans un cryostat. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

A propos de l&#39;anesthésie: Depuis électroporation in utero dans l&#39;hypothalamus peut être techniquement difficile et nécessiter des temps de narcose plus, nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par administration d&#39;un mélange d&#39;oxygène et d&#39;isoflurane. Dans notre expérience, les animaux peuvent rester suffisamment anesthésiés de cette façon pendant des périodes allant jusqu&#39;à une heure au moins, la reprise de la mère est très rapide, et la survie de l&#39;embryon améliorée...

La manipulation génétique du cerveau embryonnaire de souris est une approche privilégiée pour en apprendre davantage sur la régulation du développement. La génération de lignées de souris mutantes est cependant lent et coûteux. Une méthode puissante pour introduire des modifications génétiques spécifiques dans le développement des neurones du cerveau des mammifères est en électroporation in utero. Essentiellement, la technique consiste à transfecter l&#39;ADN dans le neuroépithélium cerveau embryonnaire au moyen d&#39;impulsions électriques, puis permettre à l&#39;embryon de survivre pendant un certain laps de temps, de recueillir le cerveau et les examiner une éventuelle roman, phénotypes informatives. De cette façon, l&#39;expérimentateur peut tester des hypothèses presque immédiatement, sans les longues périodes d&#39;attente nécessaires pour la production de mutants de souris. Transfection d&#39;ADN dans des embryons en développement a commencé par électroporation in ovo sur des embryons de poulet 1. La preuve de concept essentiel pour la souris a été réalisée dans la culture <sup&gt; 2. Ce fut bientôt suivi par les premières descriptions de la technique sur la souris in utero 3,4. Le principal problème consiste à transfecter le cerveau d&#39;embryons en développement in utero sans eux ou la mère qui tue. Apprendre à effectuer la chirurgie nécessaire (laparotomie, l&#39;injection, l&#39;électroporation) nécessite une longue période de formation. Une fois que l&#39;opération a été maîtrisé au point où le taux de survie des embryons est acceptable, la prochaine question clé est: quelles structures cérébrales sont-ils accessibles? Sans surprise, les premiers articles publiés montrant les résultats obtenus avec électroporation in utero axés sur le développement cortical 5-9. Cela est encore vrai pour la plupart des publications utilisant cette technique, car la région du cerveau de souris en développement plus accessible à des procédures chirurgicales est le cortex (Figure 1). La procédure d&#39;électroporation in utero dans le cortex a été décriten version imprimée et en vidéo 10 11-14. Une modification de la technique peut être utilisée pour cibler une partie ventrale du télencéphale, les noyaux gris centraux 15. Au-delà du télencéphale, diencéphale (classiquement divisé en thalamus et de l&#39;hypothalamus) est une région du cerveau antérieur plus difficiles à atteindre. Un petit nombre de documents ciblant des rapports de sa partie dorsale et le plus accessible, le thalamus 16-19. L&#39;hypothalamus est la partie la plus ventrale du cerveau antérieur, donc celle localisée plus profondément de la surface dorsale (cortex) (Figure 1). Cette région reste un défi difficile pour les chercheurs engagés à manipuler génétiquement le cerveau de souris in utero. À notre connaissance, seuls quelques articles un rapport sur ​​les résultats de transfection in utero dans l&#39;hypothalamus de souris 20,21. Cependant, l&#39;importance fonctionnelle de l&#39;hypothalamus cannot être surestimée, car elle régule les comportements comme manger et de boire, l&#39;accouplement, la reproduction et la parentalité 22. En outre, les altérations dans le développement hypothalamique contribuent à provenir tard dans des conditions de vie comme l&#39;obésité, l&#39;hypertension, le diabète et la puberté précoce 23. Être capable de modifier génétiquement l&#39;hypothalamus au cours du développement constituerait un outil très puissant pour comprendre. Le protocole chirurgical de base pour la laparotomie de souris gravides que nous utilisons ici est similaire à celle utilisée dans les autres protocoles 11,13,14,24. Nous allons décrire ici brièvement par souci d&#39;exhaustivité. La clé de notre procédure, d&#39;autre part, sont le type d&#39;anesthésie, l&#39;endroit de l&#39;injection, le type d&#39;électrodes et de l&#39;insertion et de la position de l&#39;électrode positive par rapport à la tête de l&#39;embryon. Nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par inhalation de gaz plus simples anesthésie intrapéritonéale, puisque le premier permet l&#39;un peu plus longues périodes de narcose nécessaires pour une chirurgie difficile. Résultats d&#39;inhalation isoflurane chez une récupération plus rapide de l&#39;anesthésie, car, généralement, la mère démontre un comportement normal déjà minutes après la chirurgie. Le point d&#39;injection de la solution d&#39;ADN avec la micropipette de verre la plus simple est le ventricule latéral, ce qui est cependant tout à fait impropre à l&#39;électroporation de l&#39;hypothalamus. Injection directement dans le troisième ventricule est en effet crucial de cibler les structures diencéphaliques profondes. Il est possible de transfecter l&#39;hypothalamus de E12.0 ou E12.5 à la norme électrodes, off-the-shelf. Nous avons trouvé quelques-uns des électrodes fabriquées par Nepa Gene (Chiba, Japon) particulièrement adapté à cet effet. Grâce à notre procédure nous obtenons transfection de l&#39;ensemble neuroépithélium hypothalamique ou transfection régionale partielle en fonction de l&#39;orientation de l&#39;électrode. Ici, nous démontrons la technique par transfection du corps mamillaire, sans doutele plus profond et le plus en retrait de tous les noyaux hypothalamiques. En outre, nous montrons l&#39;analyse histologique détaillée des cellules transfectées jusqu&#39;au niveau cellulaire de la résolution. Une comparaison des électroporation in utero avec d&#39;autres approches de la transfection le développement du cerveau de la souris in utero peut être trouvée dans la section Discussion.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td><RÉACTIFS>FORTS</</td></tr><tr><td>>Acépromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anesthésique</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anesthésique</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anesthésique</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>anti-inflammatoire non stéroïdien</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>povidone-iode</td></tr><tr><td>Tampon phosphate Saline PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprénorphine)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>analgésique opioïde</td></tr><tr><td>Pommade oculaire</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dispositif d’anesthésie Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia ACN</td><td>004 903 682</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur capillaire P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Instr. de précision</td><td>VF-300</td><td>Appareil de type vibratome</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Électrode 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Électrode aiguille en acier inoxydable, pointe de 10 mm, diam. 0,5 mm</td></tr><tr><td>Électrode 2</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Couvercle Rond Plaque de platine 4 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Source de lumière froide à fibre optique</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120T-15</td><td>1,2 mm OD x 0,94 mm ID.</td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes de verre</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dispositif d’injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pompe pneumatique Pico PV820</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fil de suture enduit Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Suture péritonéale</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Suture cutanée</td></tr></tbody></table>

manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; in utero</em&gt; Électroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

La modification génétique des régions spécifiques du cerveau des mammifères en développement est une approche expérimentale très puissant. Cependant, générant des nouveaux mutants de souris est souvent d&#39;une lenteur décourageante. Il a été démontré que l&#39;accès au cerveau de souris en développement in utero à la survie post-opératoire raisonnable est possible. Pourtant, les résultats de cette procédure ont été signalés presque exclusivement pour la partie la plus superficielle et facilement accessibles du cerveau en développement, à savoir le cortex. Le thalamus, une région étroite et plus médial, s&#39;est avéré plus difficile à cibler. Transfection dans des noyaux plus profond, en particulier ceux de l&#39;hypothalamus, est peut-être les résultats les plus difficiles et donc très peu ont été rapportés. Ici, nous démontrons une procédure de cibler l&#39;ensemble neuroépithélium hypothalamique ou une partie de celui-ci (régions hypothalamiques) pour la transfection par électroporation. Les clés de notre approche sont plus narcose fois, l&#39;injection dans le troisi ventricule, et le type et le positionnement des électrodes approprié. En outre, nous montrons les résultats de ciblage et d&#39;analyse histologique du noyau hypothalamique plus en retrait, le corps mamillaire.

La plupart des neurones de l&#39;hypothalamus sont nés entre E11.5 à E15.2, selon l&#39;analyse naissance-dating chez le rat 26 traduit en développement un peu plus courte de souris 27,28. Le pic de la neurogenèse hypothalamique est atteint à E12.5 29-31. En conséquence, à l&#39;âge de transfection choisi pour la présente étude (E12.5), une grande proportion des neurones hypothalamiques peut être marqué à n&#39;importe quel niveau rostro-caudale donné. Analys...

Malgré l&#39;importance fonctionnelle et médicale de l&#39;hypothalamus,<em&gt; In utero</em&gt; Manipulation génétique de son développement a été tentée rarement. Nous montrons une procédure détaillée pour<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation dans l&#39;hypothalamus de souris et affichent des résultats représentatifs de totale et partielle (régional) transfection hypothalamique.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

L'objectif général de cette procédure est de transfecter de l'ADN plasmatique dans l'hypothalamus d'embryons de souris en développement in utero afin d'activer ou de réprimer la fonction d'un gène d'intérêt. Cette étape est réalisée en anesthésiant d'abord la souris gestante et en exposant l'utérus par laparotomie. La deuxième étape consiste à injecter la solution d'ADN dans le troisième ventricule du cerveau embryonnaire.Ensuite, l'électrode positive est positionnée à l'intérieur de l'utérus entre le placenta et la tête embryonnaire. L'électrode négative est placée sur la surface externe de l'utérus et des impulsions électriques sont appliquées. La dernière étape consiste à prélever les cerveaux embryonnaires transféctés six jours plus tard.En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour analyser les altérations phénotypiques des cellules transfectées, leur nombre, leur forme, leur position, leur expression de marqueurs, etc. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transfection virale sont, premièrement, qu'elle ne nécessite pas de précautions particulières, et deuxièmement, que le ciblage d'une région spécifique est possible. Troisièmement, avec l'électroporation in utero, le criblage des gènes candidats est plus rapide.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'injection de la solution d'ADN dans le troisième ventricule et le positionnement correct de l'électrode en aiguille exigent une habileté manuelle avancée ainsi qu'une certaine expérience. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine du développement hypothalamique, notamment celles relatives à la migration cellulaire, ainsi qu'à la manière dont les régions et noyaux individuels sont spécifiés génétiquement. Commencez cette procédure en tirant quelques micropipettes en verre de bonne qualité, car elles sont essentielles pour réduire le taux élevé d'avortements initiaux dus à la perte de liquide amniotique.Pour préparer l'ADN, dissoudre l'ADN plasmatique purifié et exempt d'endotoxines dans du PBS contenant 0,1 % de vert rapide à une concentration finale d'un à deux microgrammes par microlitre. Le vert rapide rendra la solution injectée visible dans le ventricule cérébral de l'embryon. Ensuite, charger 10 microlitres de la solution d'ADN dans la micropipette en verre.Ensuite, reliez la micropipette en verre au système d'injection ou à une pipette buccale. À cette étape, préparez la table chirurgicale avec un tapis chauffant et les instruments chirurgicaux. Allumez les sources de lumière froide afin de faciliter la visualisation des embryons. Désinfectez ensuite les instruments chirurgicaux à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre.Ensuite, anesthésiez une souris gravide à l'isoflurane. Une fois l'anesthésie administrée, appliquez un onguent sur ses yeux afin d'éviter qu'ils ne s'assèchent. Puis, placez un masque sur son visage pour maintenir l'anesthésie de façon continue.Placez maintenant la souris sur un tapis chauffant, le ventre vers le haut. Immobilisez son corps en fixant ses quatre membres avec du ruban adhésif. Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée en pinçant sa queue pour tester le réflexe de retrait.Ensuite, rasez la surface abdominale et désinfectez-la avec une solution d'iode. Pratiquez une incision longitudinale d'environ un à un centimètre et demi de longueur sur la peau abdominale. Ensuite, coupez le péritoine.Ensuite, placer un tampon de gaze de coton autour de l'incision. Rincer la gaze avec du PBS. Exposer une corne utérine en la tirant délicatement à l’aide de pinces contondantes.Évitez de tirer fortement sur le myomètre ou sur l'utérus. Une pression élevée à l'intérieur de l'utérus augmenterait les risques de perte de liquide embryonnaire lors de l'injection, entraînant un avortement. Placez ensuite la corne utérine sur une compresse rincée au PBS et rincez-la avec du PBS toutes les quelques minutes pour la maintenir humide.Maintenant, sous le microscope, maintenez l’utérus de manière à visualiser les ventricules cérébraux. N’ajustez pas excessivement la position de l’embryon qui se trouve dans une position défavorable. Cela ne ferait qu’augmenter les risques d’avortement.Observer la tête de l'embryon depuis le dessus afin de repérer l'espace correspondant à la fente entre les hémisphères corticaux gauche et droit. Les hémisphères sont faciles à distinguer, et les ventricules latéraux situés à l'intérieur apparaissent généralement comme des formes légèrement plus foncées. Si un embryon est parfaitement orienté pour l'injection d'ADN, il est possible de percer la paroi utérine et d'accéder directement au troisième ventricule.Tenez la micropipette en verre contenant l'ADN préparé précédemment à un angle de 45 degrés par rapport à la paroi utérine et percez-la à l'extrémité rostrale de la scissure interhémisphérique, en pénétrant d'environ un millimètre de profondeur. De cette manière, la pointe de la micropipette en verre pénétrera dans le troisième ventricule cérébral et non dans le ventricule latéral. Ensuite, injectez environ un microlitre de solution d'ADN dans le troisième ventricule ; en cas d'injection réussie, un liquide vert remplit le ventricule. Répétez la même procédure pour tous les embryons du même cornet utérin.Cela permettra un certain temps à la solution d'ADN de se mélanger uniformément avec le liquide ventriculaire et d'atteindre tout l'épithélium neuroépithélial. Ensuite, allumez l'électroporateur et réglez les paramètres en fonction de l'âge embryonnaire. Utilisez l'aiguille en acier inoxydable comme pôle positif et l'électrode ronde plate comme pôle négatif ; sélectionnez les embryons présentant leur face dorsale vers le haut pour l'électroporation.Ensuite, percer la paroi utérine à côté de la tête de l'embryon, entre la poche amniotique et le placenta, en enfonçant la pointe de l'électrode vers le bas à travers celle-ci. Puis utiliser l'index de l'autre main comme butée. Environ cinq millimètres de la pointe de l'électrode doivent se trouver entre la poche amniotique et la paroi utérine, au niveau du mésencéphale.Étant donné qu'il s'agit de l'électrode de ciblage, sa position déterminera quelle partie de l'épithélium neurohypothalamique est le plus susceptible d'être transfectée. Ensuite, positionnez avec l'autre main l'électrode ronde et plate à l'extérieur de la paroi utérine, du côté opposé à la tête de l'embryon. Puis, serrez délicatement l'embryon entre les électrodes.Utilisez l’interrupteur au pied pour appliquer une tension. Ensuite, retirez lentement l’aiguille électrode de l’utérus tout en maintenant l’utérus avec l’index de l’autre main. Si du liquide amniotique s’échappe par la paroi perforée, l’embryon subit généralement une abortion.Après l'injection et l'électroporation de tous les embryons, remettre très soigneusement l'utérus dans l'abdomen de la souris et le positionner exactement comme il était auparavant. Ensuite, humidifier la cavité péritonéale avec du sérum physiologique avant de la fermer. Suturer le péritoine avec du catgut chirurgical, puis suturer la peau avec un fil de suture plus résistant.Nettoyez la surface de l'abdomen avec une solution d'iode et injectez un anti-inflammatoire non stéroïdien par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Ensuite, retirez la mère de l'appareil anesthésique et placez-la dans une cage chauffée par un tapis chauffant. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle se réveille complètement de l'anesthésie, puis examinez-la quotidiennement afin de vous assurer qu'elle récupère bien de l'intervention, sans signe d'infection ni de douleur.À cette étape, récoltez les embryons ou les postnataux selon le jour d'analyse souhaité. Sélectionnez les embryons qui ont été injectés avec de l'ADN et électroporés, puis disséquez les cerveaux sous ce microscope stéréo. Vérifiez ensuite la présence d'un signal fluorescent vert dans la région appropriée.Pour analyser le cerveau de l'embryon sélectionné, fixez le tissu pendant une courte durée dans du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, incluez-le dans de l'agarose à 4 % ou dans de l'albumine gélatineuse. Puis sectionnez le cerveau au vibratome.Ces figures montrent l'hypothalamus après transfection in utero d'ADN plasmatique porteur de gènes rapporteurs fluorescents, GFP ou CFP, à E 12,5. Il s'agit d'une coupe sagittale montrant un hypothalamus transfecté de la région rostrale à la région caudale, et voici la coupe transversale avec les cellules marquées à différents niveaux selon l'axe médio-latéral. Cette coupe sagittale montre un corps mammillaire spécifiquement transfecté ainsi que l'étiquetage de son arborisation axonale caractéristique, et sur le côté électro parade de cette coupe transversale, on observe une bande marquée correspondant aux neurones nés à E 12,5.Pour analyser plus précisément les sections, des coupes horizontales parallèles au plan des prolongements gliaux radiaires émanant du recessus mammillaire ont été préparées. Les neurones ambi O issus de l'épithélium neuroépithélial transfecté au jour E 12,5 ont été identifiés au jour E 18,5 à l'aide d'anticorps dirigés contre la GFP.Dans cet exemple, l'anticorps a marqué un groupe restreint de cellules du MBO. Ce groupe était situé entre deux zones latérales et médiales non marquées du MBO, correspondant à des neurones du MBO nés avant et après le 12,5 E, ainsi qu'une double coloration avec un anticorps dirigé contre la nestine. En rouge, on observe le mode de migration de neurones individuellement marqués le long des prolongements gliaux radiaires de l'épithélium nerveux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter l'ADN dans le troisième ventricule et comment positionner l'aiguille en tant qu'électrode positive entre l'embryon, la tête et le placenta afin de cibler efficacement l'hypothalamus. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie ou l'hybridation in situ peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le phénotype des neurones transfectés.

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