Manipulation génétique de la souris en développement à travers l'hypothalamus

L'objectif général de cette procédure est de transfecter de l'ADN plasmatique dans l'hypothalamus d'embryons de souris en développement in utero afin d'activer ou de réprimer la fonction d'un gène d'intérêt. Cette étape est réalisée en anesthésiant d'abord la souris gestante et en exposant l'utérus par laparotomie. La deuxième étape consiste à injecter la solution d'ADN dans le troisième ventricule du cerveau embryonnaire.

Ensuite, l'électrode positive est positionnée à l'intérieur de l'utérus entre le placenta et la tête embryonnaire. L'électrode négative est placée sur la surface externe de l'utérus et des impulsions électriques sont appliquées. La dernière étape consiste à prélever les cerveaux embryonnaires transféctés six jours plus tard.

En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour analyser les altérations phénotypiques des cellules transfectées, leur nombre, leur forme, leur position, leur expression de marqueurs, etc. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transfection virale sont, premièrement, qu'elle ne nécessite pas de précautions particulières, et deuxièmement, que le ciblage d'une région spécifique est possible. Troisièmement, avec l'électroporation in utero, le criblage des gènes candidats est plus rapide.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'injection de la solution d'ADN dans le troisième ventricule et le positionnement correct de l'électrode en aiguille exigent une habileté manuelle avancée ainsi qu'une certaine expérience. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine du développement hypothalamique, notamment celles relatives à la migration cellulaire, ainsi qu'à la manière dont les régions et noyaux individuels sont spécifiés génétiquement. Commencez cette procédure en tirant quelques micropipettes en verre de bonne qualité, car elles sont essentielles pour réduire le taux élevé d'avortements initiaux dus à la perte de liquide amniotique.

Pour préparer l'ADN, dissoudre l'ADN plasmatique purifié et exempt d'endotoxines dans du PBS contenant 0,1 % de vert rapide à une concentration finale d'un à deux microgrammes par microlitre. Le vert rapide rendra la solution injectée visible dans le ventricule cérébral de l'embryon. Ensuite, charger 10 microlitres de la solution d'ADN dans la micropipette en verre.

Ensuite, reliez la micropipette en verre au système d'injection ou à une pipette buccale. À cette étape, préparez la table chirurgicale avec un tapis chauffant et les instruments chirurgicaux. Allumez les sources de lumière froide afin de faciliter la visualisation des embryons. Désinfectez ensuite les instruments chirurgicaux à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre.

Ensuite, anesthésiez une souris gravide à l'isoflurane. Une fois l'anesthésie administrée, appliquez un onguent sur ses yeux afin d'éviter qu'ils ne s'assèchent. Puis, placez un masque sur son visage pour maintenir l'anesthésie de façon continue.

Placez maintenant la souris sur un tapis chauffant, le ventre vers le haut. Immobilisez son corps en fixant ses quatre membres avec du ruban adhésif. Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée en pinçant sa queue pour tester le réflexe de retrait.

Ensuite, rasez la surface abdominale et désinfectez-la avec une solution d'iode. Pratiquez une incision longitudinale d'environ un à un centimètre et demi de longueur sur la peau abdominale. Ensuite, coupez le péritoine.

Ensuite, placer un tampon de gaze de coton autour de l'incision. Rincer la gaze avec du PBS. Exposer une corne utérine en la tirant délicatement à l’aide de pinces contondantes.

Évitez de tirer fortement sur le myomètre ou sur l'utérus. Une pression élevée à l'intérieur de l'utérus augmenterait les risques de perte de liquide embryonnaire lors de l'injection, entraînant un avortement. Placez ensuite la corne utérine sur une compresse rincée au PBS et rincez-la avec du PBS toutes les quelques minutes pour la maintenir humide.

Maintenant, sous le microscope, maintenez l’utérus de manière à visualiser les ventricules cérébraux. N’ajustez pas excessivement la position de l’embryon qui se trouve dans une position défavorable. Cela ne ferait qu’augmenter les risques d’avortement.

Observer la tête de l'embryon depuis le dessus afin de repérer l'espace correspondant à la fente entre les hémisphères corticaux gauche et droit. Les hémisphères sont faciles à distinguer, et les ventricules latéraux situés à l'intérieur apparaissent généralement comme des formes légèrement plus foncées. Si un embryon est parfaitement orienté pour l'injection d'ADN, il est possible de percer la paroi utérine et d'accéder directement au troisième ventricule.

Tenez la micropipette en verre contenant l'ADN préparé précédemment à un angle de 45 degrés par rapport à la paroi utérine et percez-la à l'extrémité rostrale de la scissure interhémisphérique, en pénétrant d'environ un millimètre de profondeur. De cette manière, la pointe de la micropipette en verre pénétrera dans le troisième ventricule cérébral et non dans le ventricule latéral. Ensuite, injectez environ un microlitre de solution d'ADN dans le troisième ventricule ; en cas d'injection réussie, un liquide vert remplit le ventricule. Répétez la même procédure pour tous les embryons du même cornet utérin.

Cela permettra un certain temps à la solution d'ADN de se mélanger uniformément avec le liquide ventriculaire et d'atteindre tout l'épithélium neuroépithélial. Ensuite, allumez l'électroporateur et réglez les paramètres en fonction de l'âge embryonnaire. Utilisez l'aiguille en acier inoxydable comme pôle positif et l'électrode ronde plate comme pôle négatif ; sélectionnez les embryons présentant leur face dorsale vers le haut pour l'électroporation.

Ensuite, percer la paroi utérine à côté de la tête de l'embryon, entre la poche amniotique et le placenta, en enfonçant la pointe de l'électrode vers le bas à travers celle-ci. Puis utiliser l'index de l'autre main comme butée. Environ cinq millimètres de la pointe de l'électrode doivent se trouver entre la poche amniotique et la paroi utérine, au niveau du mésencéphale.

Étant donné qu'il s'agit de l'électrode de ciblage, sa position déterminera quelle partie de l'épithélium neurohypothalamique est le plus susceptible d'être transfectée. Ensuite, positionnez avec l'autre main l'électrode ronde et plate à l'extérieur de la paroi utérine, du côté opposé à la tête de l'embryon. Puis, serrez délicatement l'embryon entre les électrodes.

Utilisez l’interrupteur au pied pour appliquer une tension. Ensuite, retirez lentement l’aiguille électrode de l’utérus tout en maintenant l’utérus avec l’index de l’autre main. Si du liquide amniotique s’échappe par la paroi perforée, l’embryon subit généralement une abortion.

Après l'injection et l'électroporation de tous les embryons, remettre très soigneusement l'utérus dans l'abdomen de la souris et le positionner exactement comme il était auparavant. Ensuite, humidifier la cavité péritonéale avec du sérum physiologique avant de la fermer. Suturer le péritoine avec du catgut chirurgical, puis suturer la peau avec un fil de suture plus résistant.

Nettoyez la surface de l'abdomen avec une solution d'iode et injectez un anti-inflammatoire non stéroïdien par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Ensuite, retirez la mère de l'appareil anesthésique et placez-la dans une cage chauffée par un tapis chauffant. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle se réveille complètement de l'anesthésie, puis examinez-la quotidiennement afin de vous assurer qu'elle récupère bien de l'intervention, sans signe d'infection ni de douleur.

À cette étape, récoltez les embryons ou les postnataux selon le jour d'analyse souhaité. Sélectionnez les embryons qui ont été injectés avec de l'ADN et électroporés, puis disséquez les cerveaux sous ce microscope stéréo. Vérifiez ensuite la présence d'un signal fluorescent vert dans la région appropriée.

Pour analyser le cerveau de l'embryon sélectionné, fixez le tissu pendant une courte durée dans du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, incluez-le dans de l'agarose à 4 % ou dans de l'albumine gélatineuse. Puis sectionnez le cerveau au vibratome.

Ces figures montrent l'hypothalamus après transfection in utero d'ADN plasmatique porteur de gènes rapporteurs fluorescents, GFP ou CFP, à E 12,5. Il s'agit d'une coupe sagittale montrant un hypothalamus transfecté de la région rostrale à la région caudale, et voici la coupe transversale avec les cellules marquées à différents niveaux selon l'axe médio-latéral. Cette coupe sagittale montre un corps mammillaire spécifiquement transfecté ainsi que l'étiquetage de son arborisation axonale caractéristique, et sur le côté électro parade de cette coupe transversale, on observe une bande marquée correspondant aux neurones nés à E 12,5.

Pour analyser plus précisément les sections, des coupes horizontales parallèles au plan des prolongements gliaux radiaires émanant du recessus mammillaire ont été préparées. Les neurones ambi O issus de l'épithélium neuroépithélial transfecté au jour E 12,5 ont été identifiés au jour E 18,5 à l'aide d'anticorps dirigés contre la GFP.

Dans cet exemple, l'anticorps a marqué un groupe restreint de cellules du MBO. Ce groupe était situé entre deux zones latérales et médiales non marquées du MBO, correspondant à des neurones du MBO nés avant et après le 12,5 E, ainsi qu'une double coloration avec un anticorps dirigé contre la nestine. En rouge, on observe le mode de migration de neurones individuellement marqués le long des prolongements gliaux radiaires de l'épithélium nerveux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter l'ADN dans le troisième ventricule et comment positionner l'aiguille en tant qu'électrode positive entre l'embryon, la tête et le placenta afin de cibler efficacement l'hypothalamus. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie ou l'hybridation in situ peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le phénotype des neurones transfectés.