Manipulation génétique de la souris en développement à travers l'hypothalamus In utero Électroporation

L’objectif global de cette procédure est de transfecter l’ADN plasmatique dans l’hypothalamus d’embryons de souris se développant in utero afin d’activer ou de réprimer la fonction d’un gène d’intérêt. Ceci est accompli en anesthésant d’abord la souris enceinte et en exposant l’utérus par laparotomie. La deuxième étape consiste à injecter la solution d’ADN dans le troisième ventricule du cerveau embryonnaire.

Ensuite, l’électrode positive est positionnée à l’intérieur de l’utérus entre le placenta et la tête embryonnaire. L’électrode négative est placée sur la surface utérine externe et des impulsions électriques sont appliquées. La dernière étape consiste à retirer les cerveaux embryonnaires transfectés six jours plus tard.

En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour analyser les altérations phénotypiques des cellules transfectées, le nombre, la forme, la position, l’expression des marqueurs, etc. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la transfection virale sont premièrement, elle ne nécessite pas de précautions particulières, et comme deux installations, un deuxième ciblage d’une région spécifique est possible. Et troisièmement, avec l’électroporation Ute, le criblage des gènes candidats est plus rapide.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car l’injection de la solution d’ADN dans le troisième ventricule et le positionnement correct de l’électrode de l’aiguille nécessitent une inclinaison manuelle avancée ainsi qu’une certaine expérience. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine du développement hypothalamique, en particulier celles relatives à la migration cellulaire, ainsi qu’à la façon dont les régions individuelles et le nucule sont génétiquement spécifiés. Commencez cette procédure en tirant des micro-pipettes en verre de bonne qualité, car elles sont essentielles pour réduire le taux initial élevé d’avortement dû à la perte de liquide amniotique.

Pour préparer l’ADN, dissolvez l’ADN plasmatique libre d’endotoxines purifié dans du PBS contenant 0,1 % de vert rapide jusqu’à une concentration finale d’un à deux microgrammes par microlitre. Le vert rapide rendra la solution injectée visible dans le ventricule cérébral embryonnaire. Ensuite, chargez 10 microlitres de la solution d’ADN dans la micropipette en verre.

Connectez ensuite la micro-pipette en verre au système d’injection ou à une pipette buccale. Dans cette étape, préparez la table d’opération avec un coussin chauffant et les instruments chirurgicaux Allumez les sources de lumière froide pour faciliter la visualisation des embryons. Désinfectez ensuite les outils chirurgicaux à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre.

Ensuite, anesthésez une souris enceinte avec de l’isode de fluor. Une fois la souris anesthésiée, appliquez une pommade sur ses yeux pour éviter le dessèchement. Par la suite, ajustez le masque sur son visage pour maintenir l’anesthésie en continu.

Placez maintenant la souris sur un coussin chauffant avec le ventre vers le haut. Fixez son corps en place en fixant ses quatre membres avec du ruban adhésif. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée en pinçant sa queue pour détecter le reflux.

Ensuite, rasez la surface abdominale et désinfectez-la avec une solution iodée. Faites une incision longitudinale d’environ un à un centimètre et demi de long sur la peau abdominale. Ensuite, coupez le péritoine.

Ensuite, placez de la gaze de coton autour de l’incision. Rincez la gaze avec du PBS. Exposez une corne utérine en la tirant soigneusement avec une pince émoussée.

Évitez de serrer le myomètre ou l’utérus. Étant donné qu’une pression élevée à l’intérieur de l’utérus augmentera les risques de perte de liquide embryonnaire lors de l’injection, entraînant un avortement. Placez ensuite la corne utérine sur une gaze rincée PBS et rincez-la avec du PBS toutes les quelques minutes pour la garder humidifiée.

Maintenant, au microscope, tenez l’utérus de manière à ce que les ventricules cérébraux puissent être visualisés. Ne repositionnez pas largement l’embryon qui se trouve dans une position défavorable. Cela ne fait qu’augmenter les chances d’avortement.

Regardez la tête de l’embryon par le haut pour localiser l’espace où se fissure entre les hémisphères corticaux gauche et droit. Les hémisphères sont faciles à distinguer et les ventricules latéraux à l’intérieur peuvent généralement être perçus comme des formes un peu plus sombres. Si un embryon s’avère parfaitement orienté pour l’injection d’ADN, il est possible de percer la paroi utérine et d’entrer immédiatement dans le troisième ventricule.

Tenez la micropipette en verre avec l’ADN préparé plus tôt à 45 degrés de la paroi utérine et perforez-la à l’extrémité rostrale de la fissure interhémisphérique, en pénétrant à une profondeur d’environ un millimètre. De cette façon, la pointe de la micro-pipette en verre entrera dans le troisième ventricule du cerveau et non dans le ventricule latéral. Après avoir injecté environ un microlitre de solution d’ADN dans le troisième ventricule, un liquide vert remplira le ventricule lors d’une bonne injection, répétez la même procédure avec tous les embryons de la même corne utérine.

Cela laissera un certain temps à la solution d’ADN pour se mélanger uniformément au liquide ventriculaire et atteindre l’ensemble de l’épithélium neurologique. Allumez maintenant l’électro perter et ajustez les paramètres en fonction de l’âge embryonnaire. Utilisez l’électrode à aiguille en acier inoxydable comme pôle positif et l’électrode plate ronde comme pôle négatif, sélectionnez les embryons avec le côté dorsal vers le haut pour l’électroporation.

Percez ensuite la paroi utérine à côté de la tête de l’embryon entre le sac amniotique et le placenta en enfonçant la pointe de l’électrode de l’aiguille vers le bas à travers celle-ci. Utilisez ensuite l’index de l’autre main comme bloc de poussée. Environ cinq millimètres de l’extrémité de l’électrode doivent se trouver entre le sac amniotique et la paroi utérine, à peu près au niveau du mésencéphale.

Comme il s’agit de l’électrode cible, sa position déterminera quelle partie du neuroépithélium hypothalamique est la plus susceptible d’être transfectée. Ensuite, placez l’électrode ronde et plate à l’extérieur de la paroi de l’utérus du côté opposé de la tête de l’embryon avec l’autre main. Ensuite, pressez doucement l’embryon entre les électrodes.

Utilisez l’interrupteur à pédale pour appliquer la tension. Après cela, retirez lentement l’électrode de l’aiguille de l’utérus tout en retenant l’utérus avec l’index de l’autre main. Si du liquide amniotique est perdu à travers la paroi perforée, l’embryon subira généralement un avortement.

Après l’injection et l’électroporation de tous les embryons, replacez très soigneusement l’utérus dans l’abdomen de la souris et positionnez-les exactement comme ils étaient auparavant. Humidifiez ensuite la cavité péritonéale avec une solution saline avant de la fermer. Suturez le péritoine avec de l’intestin chirurgical de chat, puis suturez la peau avec une suture plus résistante.

Désinfectez la surface de l’abdomen avec une solution iodée et injectez un anti-inflammatoire non stéroïdien par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Ensuite, retirez la mère de l’appareil d’anesthésie et placez-la dans une cage, qui est chauffée par un coussin chauffant. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie et vérifiez-la quotidiennement pour vous assurer qu’elle se remet de la procédure sans aucun signe d’infection ou de douleur.

Dans cette étape, récoltez les embryons ou les postnatals selon le jour d’analyse souhaité. Sélectionnez les embryons qui ont été injectés avec de l’ADN et électroporés et disséquez les cerveaux sous ce stéréomicroscope. Vérifiez ensuite la présence d’un signal fluorescent vert dans la région appropriée.

Pour analyser le cerveau de l’embryon sélectionné, fixez le tissu pendant une courte période dans du paraldéhyde à 4 %. Ensuite, intégrez-le dans aros 4 % ou dans de la gélatine albumine. Ensuite, sectionnez le cerveau sur le vibrato.

Ces figures montrent l’hypothalamus après transfection in utero de l’ADN plasmatique, porteur de gènes rapporteurs fluorescents, GFP ou CFP en E 12,5. Il s’agit d’une coupe sagittale montrant un hypothalamus transfecté du rostral au dorlot, et voici la coupe transversale avec les cellules marquées à différents niveaux le long de l’axe latéral médian. Cette coupe sagittale montre un corps mamillaire spécifiquement transfecté et l’étiquetage de son arbre axonal caractéristique, et du côté de l’électroparade de cette section transversale montre une bande marquée correspondant aux neurones nés le E 12.5.

Pour analyser les sections de plus près. Les sections horizontales parallèles au plan des apophyses gliales radiales émanant de la niche mamillaire ont été préparées. Les neurones ambi O nés de l’épithélium neurologique transfecté le jour E 12,5 ont été identifiés le jour E 18,5 au moyen d’anticorps contre la GFP.

Dans cet exemple, l’anticorps a marqué un groupe restreint de cellules MBO. Ce groupe a été localisé entre deux zones MBO latérales et médiales non marquées correspondant aux neurones MBO, nés avant et après E 12.5, et la coloration co avec un anticorps contre Neston. En rouge montre le mode de migration des neurones marqués individuellement sur les processus gliaux radiaux du neuro épithélium Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter l’ADN dans le troisième ventricule et de la façon de positionner l’aiguille comme électrode positive entre l’embryon, la tête et le placenta afin de cibler efficacement l’hypothalamus. En suivant cette procédure. D’autres méthodes comme l’immunohistochimie ou l’hybridation inid peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le phénotype des neurones transfectés.