Micromanipulation de l'expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d'oligonucléotides Morpholino

L'objectif général de cette procédure est d'injecter de manière microscopique des oligonucléotides morpholinos dans le ventricule cérébral du cerveau du zebrafish adulte afin d'inhiber l'activité de gènes dans les cellules radiales gliales. Cela est réalisé en anesthésiant tout d'abord le zebrafish. Ensuite, une incision est pratiquée dans le crâne, au-dessus du tubercule optique, à l'aide d'une aiguille dentelée.

Ensuite, la solution de morpholino est injectée par le site de l'incision dans le liquide céphalorachidien ventriculaire. Enfin, l'efficacité et la précision de l'injection sont vérifiées au microscope à fluorescence. En définitive, les résultats permettent d'observer un blocage trop efficace et généralisé de la production protéique à partir des gènes d'intérêt dans les cellules gliales radiales du cerveau de l'adulte de poisson zèbre grâce à l'inhibition génique médiée par le morpholino, qui peut être évaluée par des sections histologiques et des colorations immunohistochimiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les approches transgéniques ou les méthodes de délivrance basées sur l'électroporation, est que l'injection intraventriculaire chez le poussin (CVMI) est moins longue et plus efficace pour cibler l'ensemble de la population de cellules gliales radiaires. De nombreux gènes, y compris ceux modifiables, peuvent être inhibés simultanément. Pour préparer le mélange d'injection, commencez par préparer une solution mère de Morpholino à 500 Micromolaire.

À l'aide de PBS pour 10 injections, préparer 10 microlitres de mélange d'injection en combinant neuf microlitres de solution de morpholino diluée ou non avec un microlitre de colorant fluorescent traceur. Conserver à température ambiante. Utiliser un tireur d'aiguilles pour préparer des capillaires d'injection en verre selon les paramètres suivants.

Activez la source de pression et réglez la pression à 50 psi ou 3,5 bars. Réglez les paramètres du micro-injecteur comme suit : pression de maintien à 20 psi, pression d'éjection à 10 psi, valeur de période à 2,5 et 100 millisecondes.

Plage de réglage de la porte. Allumez l'éclairage annulaire et positionnez l'anneau au-dessus de la platine du microscope. Placez le support de capillaire à une position appropriée à côté du microscope.

Insérez la capillarité en verre dans le porte-capillaire et réglez l'angle d'injection à 45 degrés. À l'aide de pinces find end, cassez délicatement l'extrémité de la capillarité en verre et étalonnez la pression sortante provenant de l'orifice. En immergeant l'extrémité de l'aiguille dans l'eau du poisson et en appliquant une impulsion de pression continue, les bulles d'air doivent former une seule rangée, indiquant une pression ou une taille d'orifice optimales.

Chargez la micropipette en verre avec la solution d'injection. Pour éviter les bulles d'air, appliquez une pression afin d'éliminer l'air présent entre l'extrémité de la micropipette en verre et la solution d'injection chargée. Après avoir préparé une solution de 0,1 % de meab anesthésiant, transférez le nombre souhaité de poissons dans un récipient de transport contenant de l'eau pour poissons.

Préparez une solution anesthésique en mélangeant 200 millilitres d'eau pour poissons avec cinq millilitres de solution mère de MISP. Remplissez une boîte de Pétri à moitié avec l'anesthésique pour les injections. Incubez un poisson dans l'anesthésique jusqu'à ce qu'il cesse de bouger.

Ensuite, utilisez un filet pour le transférer dans la boîte de Pétri contenant l'anesthésique. Pour faciliter l'incision, utilisez la pince pour maintenir délicatement le poisson et orientez-le la tête légèrement inclinée vers le bas. À l'aide de la pointe d'une aiguille cannelée de calibre 30, faites une petite fente sur le crâne sans pénétrer trop profondément, car cela endommagerait le tissu cérébral.

Tout en continuant de maintenir le poisson, insérez la pointe de la capillaire en verre à travers le site d'incision d'environ un demi-millimètre, et en évitant tout contact avec le tissu cérébral, orientez-la vers le céphalon. Injectez la solution, qui doit se disperser immédiatement. Transférez le poisson dans de l'eau fraîche pour poisson et laissez-le se remettre.

Environ 30 minutes plus tard, réanesthésiez le poisson et examinez-le au microscope à fluorescence pour vérifier une distribution étendue du liquide, en vous basant sur la fluorescence rouge. Remettez le poisson dans son aquarium et réintroduisez-le dans le circuit.

Jusqu'à leur utilisation pour des analyses comportementales ou pour la préparation d'échantillons tissulaires comme illustré ici, une injection précise permet une dispersion de la solution injectée dans tout le cerveau et un ciblage efficace des cellules proches de la surface ventriculaire. Toutefois, lors d'injections où la pipette en verre transperce le tissu cérébral, un signal fluorescent intense sera observé au point d'injection. Et si la quantité injectée est insuffisante, un signal fluorescent faible sera détecté.

Cette figure montre que les morpholinos vivants peuvent pénétrer jusqu'à quelques diamètres cellulaires à l'intérieur de la surface ventriculaire, et peuvent donc cibler efficacement les cellules ventriculaires par rapport au contrôle Morpho. L'injection de morpholinos dirigés contre la PCNA réduit efficacement l'expression génique dans les cellules ventriculaires. Dans ces images d'immunofluorescence, les colorations immunohistochimiques de BRDU et de QCD après une expérience de suivi par pulse A-B-R-D-U démontrent que l'extinction de la PCNA par des morpholinos antisens entraîne une réduction significative des neurones naissants, suggérant ainsi que l'ICMV peut être utilisée pour inhiber des gènes endogènes, ce qui conduit par la suite à des conséquences fonctionnelles.

Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la réponse de neurogenèse régénérative du S adulte du cerveau des poissons.