Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les structures cérébrovasculaires chez les poissons zèbres embryonnaires. Ceci est accompli en collectant d’abord des œufs de poisson-zèbre fécondés et en mettant en place des conditions de traitement. Après une période de croissance de trois jours, le poisson zèbre est sacrifié fixe et un œil est soigneusement retiré avant de monter l’échantillon sur du verre de couverture.

Ensuite, le système vasculaire cérébral est imagé par microscopie confocale. Enfin, des rendus 3D du système vasculaire sont générés à l’aide d’un logiciel open source. En fin de compte, l’analyse des reconstructions est utilisée pour déterminer les effets des conditions de traitement sur la ramification et la densité des vaisseaux sanguins.

Dans le cerveau du poisson zèbre en développement. Cette technique évalue l’ensemble du système vasculaire du poisson-zèbre embryonnaire. Cela nous a permis d’étudier la biologie de la bêta-amyloïde au niveau des systèmes organiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection et l’analyse d’images sont difficiles à apprendre car elles sont techniquement difficiles. Pour commencer, élevez une souche de poisson-zèbre transgénique exprimant une protéine fluorescente verte améliorée dans les tissus souhaités à 28,5 degrés Celsius avec un cycle de 14 heures de lumière et 10 heures d’obscurité. Dans cet exemple, les poissons transgéniques qui expriment l’EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires sont élevés la nuit précédant la collecte des œufs, installent les mâles et les femelles dans des bassins d’accouplement à fond grillagé. Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez les poissons s’accoupler en vérifiant la présence d’œufs toutes les 15 minutes.

Après avoir utilisé une passoire à mailles pour recueillir les œufs et un milieu E trois pour les laver, utilisez E trois pour transférer les œufs dans des boîtes de culture de 100 millimètres et les incuber à 28 degrés Celsius pour modifier la ramification cérébrovasculaire. À partir de 24 heures après la fécondation, ajoutez un produit chimique tel qu’un inhibiteur de la gamma sécrétase solubilisé dans le DMSO. Si vous le souhaitez, ajoutez 0,03 % de PTU pour inhiber la formation de pigments.

Après avoir transféré les embryons en solution dans les puits d’une plaque de 12 puits, incubez à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de développement souhaité. Après avoir sacrifié des embryons dans des trica et les avoir fixés avec de l’aldéhyde pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Conservez les embryons dans le PBS dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.

Pour retirer l’œil de l’embryon, utilisez une aiguille en tungstène aiguisée et coupez autour du tissu reliant un œil. Ensuite, coupez les muscles et enfin le nerf optique pour retirer l’œil. Une fois l’œil retiré, retournez l’embryon sur un verre de protection, son orbite vide tournée vers le bas et touchant le verre de protection.

Ajoutez une goutte de méthylcellulose à 3 % pour maintenir l’embryon en place et pour couvrir tout l’embryon afin d’éviter la dessiccation. Lors de l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal inversé avec une image objective 20 x plan APO, l’embryon immédiatement, de nombreux systèmes d’imagerie ne pourront résoudre les structures vasculaires qu’à mi-chemin de cet échantillon. Si tel est le cas, résuscitez, suspendez l’embryon dans le PBS et remontez-le du côté controlatéral pour une imagerie plus poussée afin d’effectuer une reconstruction 3D des images cérébrovasculaires à l’aide de l’image J, qui est optimisée pour les rendus 3D.

Importez des piles confocales en allant dans plugins, loci, importateur de formats bio, puis sélectionnez le fichier confocal pour les piles Nikon, sélectionnez la pile d’affichage avec hyper pile et réglez le mode de couleur sur l’échelle de gris. Vérifiez ensuite la mise à l’échelle automatique et la division des canaux. Ces sélections ouvriront quatre panneaux de canaux distincts.

Fermez toutes les images sauf l’image 16 bits dont le nom de fichier suivi de c est égal à un. Ajustez le seuil à l’aide de l’onglet de défilement situé en bas pour rechercher une tranche qui présente la région ou la structure qui vous intéresse. Allez ensuite dans le seuil d’ajustement de l’image.

Dans le panneau qui s’affiche, faites glisser la barre supérieure vers la gauche afin que la structure soit assez bien visible sur l’arrière-plan et laissez la diapositive inférieure là où elle se trouve pour créer une nouvelle image huit bits. Sélectionnez b et w. Puis fond sombre.

Ne sélectionnez pas Calculer le seuil pour chaque image, sauf si des ajustements différents sont nécessaires pour chaque tranche. Ensuite, allez dans les plugins 3D viewer threshold zero resampling factor un ou deux, et désélectionnez les cases de couleur rouge et bleue pour créer une sortie 3D verte. Sinon, il produira un rendu blanc.

Sélectionnez ensuite Appliquer. Utilisez les commandes de la souris et du clavier pour faire pivoter, faire pivoter et zoomer l’image 3D afin d’enregistrer des images fixes à tout moment. Utilisez l’option de capture dans le menu.

La taille de la boîte d’image à l’écran dicte les dimensions en pixels de l’image produite, donc si une image haute résolution est souhaitée, agrandissez la boîte en faisant glisser le coin inférieur droit. Créez un film 3D en rotation en sélectionnant la vue et l’enregistrement Rotation à 360 degrés. Enfin, enregistrez le fichier dans l’un des nombreux formats disponibles et utilisez le lecteur multimédia open source gratuit VLC pour la visualisation 3D.

La reconstruction des structures vasculaires offre une perspective complète et visuellement intéressante du développement du poisson zèbre. On voit ici plusieurs angles de structures vasculaires dans un embryon de poisson-zèbre de six jours après la fécondation qui exprimait l’EGFP dans des cellules endothéliales de couleurs vertes ou blanches monochromes. Il peut être difficile d’apprécier l’intensité du signal, mais la pseudo-coloration fournit l’intensité de l’image à partir d’une table de correspondance, ce qui permet une meilleure perception de la profondeur des structures qui se chevauchent.

Par exemple, cette figure montre une image 3D pseudo colorée du système vasculaire chez un poisson zèbre post-fécondation de six jours après son développement. Cette technique nous a permis d’explorer les effets vasculaires de la bêta-amyloïde dans le cerveau d’un vertébré. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les réseaux vasculaires chez le poisson-zèbre embryonnaire, ce qui fournit un système économique et accessible pour étudier l’angiogenèse.