Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

L’objectif global de cette procédure est de cibler une protéine spécifique dans le tissu du rat. Pour ce faire, le tissu est d’abord isolé, fixé et intégré à la paraffine, puis sectionné et monté sur des lames. La deuxième étape consiste à déparaffiniser et à réhydrater les sections de tissu incluses dans la paraffine, puis à bloquer la peroxydase endogène.

Ensuite, les épitopes sont découverts par récupération d’antigènes. Par la suite, un blocage est effectué pour réduire la liaison non spécifique avant l’introduction des anticorps. La dernière étape consiste à détecter l’épitope spécifique par immunomarquage avec des anticorps primaires et secondaires, et à développer le signal à partir de l’anticorps secondaire marqué.

En fin de compte, le signal est visualisé à l’aide de la microscopie optique pour montrer le modèle de localisation des protéines dans les sections de tissus. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la localisation et des modèles d’expression des protéines dans le système nerveux central du rat et dans les ganglions lymphatiques périphériques, elle peut également être appliquée à d’autres organes et espèces. Pour faire la démonstration de la procédure, un technicien sera présent.

Elle s’appelle Katalin Benedek, de l’installation centrale du centre de microbiologie tumorale et de biologie cellulaire du Karolinska Institutet. Pour commencer la préparation des tissus, plongez le cerveau, la moelle épinière et les ganglions lymphatiques périphériques disséqués dans quatre pour cent de paraformaldéhyde et placez-le à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Une fois les tissus fixés, transférez-les dans du P-B-S et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur.

Pour commencer à traiter le tissu, utilisez une lame de rasoir pour couper le tissu en portions d’environ cinq millimètres. Ensuite, lancez le processus de durcissement des tissus avec un processeur d’infiltration sous vide. La procédure standard est basée sur l’immersion dans des concentrations croissantes d’éthanol, suivie de xylol et enfin de paraffine.

Ensuite, placez le mouchoir dans un moule. Versez la paraffine liquide autour de l’échantillon pour former un bloc de paraffine et conservez-le à température ambiante. Avant de sectionner le tissu, refroidissez le bloc de paraffine pendant la nuit sur la plaque froide ou au réfrigérateur.

Une fois le bloc de paraffine refroidi, placez-le dans le support fixe d’un microtome de traîneau qui peut se déplacer d’avant en arrière sur un couteau. Ensuite, ajustez le bloc et le couteau microtome à l’angle optimal, qui dépend de la géométrie du couteau ainsi que de la vitesse et de la technique de coupe. Découpez trois sections transversales de cinq microns d’épaisseur dans le bloc de paraffine.

Ensuite, transférez les sections coupées dans un récipient d’eau et montez les sections de l’eau sur une lame de verre adhésive pré-enduite commerciale. Ensuite, appuyez soigneusement la section montée contre une serviette en papier pour éliminer l’eau résiduelle et les bulles d’air potentielles. Faites sécher les lames montées pendant quelques heures dans un poêle réglé à 50 à 60 degrés Celsius.

Une fois les lames sèches, immergez-les deux fois dans du xylol pendant 15 à 20 minutes chacune. Ensuite, rincez chaque lame avec de l’éthanol à 99 %. Pour bloquer l’activité de la peroxydase endogène, incubez les sections pendant 30 minutes dans une solution de méthanol contenant 0,25 % de peroxyde d’hydrogène.

Ensuite, continuez à réhydrater les sections de tissus en les rinçant avec des solutions d’éthanol contenant de l’eau croissante. Effectuez la dernière étape de réhydratation dans de l’eau distillée. Assurez-vous de garder les sections humides jusqu’à ce que les lamelles soient montées.

Pour récupérer l’antigène, chauffez les lames à l’aide d’un cuiseur vapeur domestique et d’un tampon EDTA à pH 8,5 pendant 60 minutes. Ensuite, refroidissez les lames à température ambiante pendant environ une heure. Une fois que les lames sont froides, rincez chaque lame trois à cinq fois dans une solution saline tamponnée Tris, ou T-B-S.

Ensuite, incubez les sections de tissu à température ambiante pendant 30 minutes dans une solution bloquante contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 90 % de tampon de lavage pour bloquer toute réaction de fond non spécifique. Une fois que les sections de tissu ont été bloquées, diluez la quantité requise d’anticorps primaires dans la solution de blocage et incubez les lames dans cette solution d’anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez les lames trois à cinq fois avec un tampon T-B-S.

Ensuite, incubez les lames avec des anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Ensuite, rincez à nouveau les lames trois à cinq fois avec un tampon T-B-S. Ensuite, incubez les lames avec le complexe de peroxydase de raifort avidine, dilué de un à 100 dans la solution de blocage, pendant une heure à température ambiante.

Une fois l’incubation d’une heure terminée, rincez les lames trois à cinq fois avec un tampon T-B-S. Après avoir préparé la solution bleue rapide comme décrit dans le protocole de texte, secouez légèrement le plat et filtrez le mélange obtenu. Versez la solution sur les lames dans la cuvette en verre.

Commencez l’incubation à 37 degrés Celsius et observez le processus de développement au microscope optique toutes les 15 à 30 minutes. Une fois l’incubation terminée, rincez les lames trois à cinq fois avec un tampon T-B-S, puis transférez ensuite les lames dans un tampon P-B-S. Pour préparer la solution de développement de peroxyde d’hydrogène D-A-B, diluez d’abord un millilitre d’une solution mère D-A-B dans 49 millilitres de P-B-S.

Ajoutez 16,5 microlitres de peroxyde d’hydrogène, puis filtrez la solution. Versez la solution sur les lames et assurez-vous de contrôler le processus de développement au microscope optique afin d’éviter un bruit de fond élevé qui peut masquer le signal spécifique. Ensuite, rincez les lames trois à cinq fois avec du P-B-S, suivi d’un dernier lavage à l’eau distillée ou à l’eau du robinet.

Montez les toboggans avec des lamelles directement à partir de l’eau, à l’aide d’un support de montage aqueux. Évitez de créer des bulles d’air entre la lamelle et la glissière. Après avoir monté les sections, incubez les lames pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre au support de montage de sécher complètement.

Conservez les lames séchées à température ambiante. La double coloration de coupes de tissu ganglionnaire périphérique isolées chez le rat le septième jour après l’immunisation a révélé que les lymphocytes T CD8 positifs ne sécrétaient pas la chimiokine C-C-L 11. Alternativement, C-C-L 11 s’est avéré co-localiser avec E-D one, un marqueur de la protéine lysosomale dans les macrophages activés.

La double coloration I-H-C de la moelle épinière d’un rat a permis d’identifier la production de C-C-L onze dans le péricarya neuronal, les dendrites et les axones, mais pas dans les macrophages positifs I-B-A one et les cellules microgliales résidentes du cerveau. De plus, la majorité des macrophages positifs à E-D one et des cellules microgliales résidentes du cerveau ne sont pas non plus positifs pour C-C-L 11. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un ciblage immunohistochimique spécifique et fiable de la protéine directement dans des coupes de tissus.