Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

L’objectif global de cette procédure est de différencier les cardiomyocytes humains des cellules IPS humaines cultivées dans des conditions exemptes de nourrisseur. Ceci est accompli en plaquant d’abord les cellules IPS dans des plaques d’attache ultra basses pour former des corps embryonnaires. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les corps embryonnaires formés dans des boîtes enrobées de gélatine.

Lorsque des zones contractantes apparaissent, elles sont disséquées manuellement au stéréomicroscope et plaquées sur des boîtes enrobées de fibronectine. Pour une différenciation plus poussée, la dernière étape consiste à obtenir des cardiomyocytes uniques par digestion enzymatique des amas qui se contractent. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une différenciation des cellules de type cardiomyocytes qui expriment des marqueurs structurels typiques, c’est-à-dire la troponine cardiaque, par microscopie d’immunofluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie cardiovasculaire, telle que : quels sont les mécanismes à l’origine de la différenciation et du dysfonctionnement cardiaques au cours du développement cardiovasculaire et des maladies au niveau du cardiomyocytes humain. Il s’agit d’une technique très intéressante car elle permet de générer des cardiomyocytes in vitro à partir de patients humains et d’individus humains. Et dans un second temps, il permet de récapituler la maladie dans l’éprouvette afin que de nouveaux médicaments puissent être expérimentés in vitro avant d’être mis in vivo.

Expérimentez avec des cultures cellulaires IPS confluentes cultivées sur des plaques revêtues de matrigel de 35 millimètres. Remplacez le milieu de croissance par un millilitre de PBS contenant un milligramme de diss. Examinez les cellules à l’aide de pipettes en verre sans cornes.

Supprimez les régions avec des cellules différenciées telles que les structures en forme de cratère ou kystiques au centre des colonies. Retirez également toutes les zones où les cellules se sont séparées, aplaties et semblent migrer vers l’extérieur. Incuber maintenant les cellules restantes à 37 degrés Celsius sous un capot de culture jusqu’à ce que les limites de la colonie deviennent plus lumineuses et commencent à se détacher.

Cela prend généralement entre cinq et sept minutes. À ce stade, retirez la solution dispa et lavez les cellules avec un millilitre d’HESM. Jetez ensuite la solution de lavage.

Dans un millilitre frais d’HESM, utilisez un élévateur de cellules pour récolter les colonies. Rassemblez les colonies dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, rincez les cellules avec un autre millilitre d’HESM et faites-les tourner à 1000 fois G pendant quatre minutes.

Ensuite, procédez au placage des cellules sur matrigel et changez le milieu quotidiennement pendant la culture. Commencez par récolter les colonies IPS indifférenciées comme décrit dans la section précédente. Une fois les populations indifférenciées isolées, réhydratez-les doucement en suspension dans un millilitre d’EBM 20.

À l’aide d’une pipette de deux millilitres, ne brisez pas trop les amas cellulaires. Limitez le pipetage à deux ou trois coups. Vérifiez la taille des colonies sous le stéréoscope entre les traits.

Lorsque les colonies sont toutes à peu près de la même taille, elles n’ont pas besoin d’être mélangées davantage. Maintenant, plaquez les cellules sur des plaques de fixation ultra basses remplissant une plaque de six puits par plaque de cellules récoltées. N’oubliez pas de rincer le tube avec un millilitre d’EBM 20 et de répartir le rinçage sur la plaque.

Après le troisième jour d’incubation, changez le milieu à l’aide d’un microscope pour éviter l’ablation des corps embryonnaires. Gardez la pipette près du bord de la plaque. Le septième jour, déplacez les corps embryonnaires dans des assiettes recouvertes de gélatine à 0,1 % chauffée à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ajoutez 35 à 40 corps embryonnaires dans chaque boîte de 35 millimètres dans deux millilitres de milieu. Pendant la culture. Changez de support deux fois par semaine régulièrement.

Vérifiez que les corps embryonnaires ne contiennent pas de zones de battement et marquez l’emplacement des zones de perlage. Sur le dessus du couvercle du plat, des zones de contraction de perles devraient apparaître après environ 10 à 20 jours. Lorsque des zones avec une contraction spontanée apparaissent, passez leur milieu à l’EBM deux Après l’apparition des zones contractantes, continuez à cultiver et à surveiller les autres zones de la plaque jusqu’à un mois.

Au total. Dans l’EBM deux, la déficience du processus de différenciation dépend fortement de plusieurs facteurs, dont les plus critiques sont les lignées cellulaires spécifiques et le lot de sérum utilisé pour induire la différenciation cardio. Pour obtenir une efficacité maximale, testez plusieurs lignes pour le potentiel cardiogénique et différents lots de sérum Commencez par enrober 12.

Les plaques de puits avec cinq microgrammes par centimètre carré de fibronectine en PBS 300 microlitres par puits devraient couvrir complètement la surface de chaque puits. Laissez sécher les plaques à découvert dans une hotte de culture cellulaire. Pour enlever la zone de perlage de la culture cellulaire, utilisez une pipette en verre tiré et un scalpel.

Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez quatre à cinq pinces dans chaque puits d’une plaque recouverte de fibronectine. Une fois que toutes les collectes ont été effectuées, ajoutez un millilitre d’EBM deux dans les puits chargés sur la plaque de collecte pour marquer les zones où les cellules ont été retirées. Changez ensuite de milieu et remettez la plaque dans la hotte de culture.

Si des touffes plus petites sont nécessaires au stéréomicroscope, passez les zones explantées à l’aide d’une pipette. Cela produit de petits amas contenant quelques cellules battantes. Dans la culture.

Changez de support deux fois par semaine jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse. Tout d’abord, préparez des lames de quatre centimètres carrés à deux chambres en les enrobant de 20 microgrammes de fibronectine diluée dans suffisamment de PBS pour couvrir la surface. Si un support en verre est utilisé, ajoutez 20 microgrammes supplémentaires de laminine.

Isolez la zone de culture des billes comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant 500 microlitres de tube de collagénase. Incuber les cellules pendant 15 minutes et secouer le tube une fois pendant l’incubation.

Après 15 minutes, passez les cellules à l’aide d’une pipette de 200 microlitres pour éliminer les amas s’il en reste. Transférez les cellules dans la collagénase fraîche deux et répétez l’incubation lorsqu’il ne reste plus de gros amas. Terminez la digestion en ajoutant trois millilitres d’EBM deux sans autant d’acide soïque qu’ils sont préparés.

Conservez les tubes dans une grille chauffée sous le capot, puis centrifugez-les à 1000 fois G pendant quatre minutes à température ambiante. Une fois centrifugé, faites une suspension des fractions cellulaires à partir du même échantillon initial dans un millilitre de 0,25 % de trypsine EDTA dans PBS. Ensuite, incubez la suspension pendant cinq minutes dans le bloc chauffé, inactivez la trypsine avec quatre millilitres de E BM deux sans acide soïque.

Ensuite, passez les cellules à travers une aiguille de calibre 18 sur une seringue de 2,5 millilitres jusqu’à sept fois jusqu’à ce qu’aucun gros amas ne soit visible au microscope. Ensuite, centrifugez les cellules à 1000 fois G pendant quatre minutes. Maintenant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans E BM deux et plaquez-les sur deux lames de chambre à puits.

Les cellules seront prêtes à être analysées après deux à trois jours d’incubation. Les CMS ont été générés à partir de plusieurs lignées cellulaires IPS. Ces lignes ont d’abord été générées sur une couche d’alimentation de méthamphétamine et immédiatement placées sur le matrigel à l’aide d’un milieu défini.

Les cellules présentaient une morphologie semblable à celle de l’ESC humaine avec des bords brillants en phase et des noyaux proéminents. L’analyse d’immunofluorescence a montré que les cellules IPS exprimaient correctement le facteur de transcription T quatre et exprimaient l’antigène de surface TRA un 60. L’analyse cytofluorométrique a confirmé l’expression des antigènes de pluripotence de surface typiques, SS EEA quatre et TRA un 60.

La stratégie de déclenchement est illustrée dans le scatter gauche. Une analyse du caryotype des cellules IP FS cultivées sur gel matriciel a également été effectuée. L’induction dans la lignée cardiaque a été déclenchée par l’agrégation des cellules IPS en ebs, ainsi que par la culture en présence d’un type spécifique de sérum.

Et comme l’acide sorbique, les zones de contraction représentaient 20 à 35 % de la culture totale, selon la lignée cellulaire utilisée. Les CMS contractants ont été isolés de ces régions par digestion enzymatique et analysés pour l’expression des protéines. R-T-P-C-R a constaté l’expression de canaux ioniques spécifiques cardiaques exprimés dans les cellules battantes dérivées de l’IPS, mais pas dans les cellules non battantes.

Ces canaux comprenaient un canal alpha, une sous-unité d’un canal calcique dépendant de la tension, une sous-unité alpha d’un canal sodique dépendant de la tension de type cinq, un canal panzé potassique de la sous-famille KQT, comme la sous-famille, et les deux formes de myosine. L’analyse par immunofluorescence à chaîne lourde a révélé que les cardiomyocytes dérivés d’IPS exprimaient les protéines structurelles, l’alpha-sarcomérique, l’actine, la troponine cardiaque I et la jonction cardiaque spécifique, la conexion 43. Après tout, cette technique a vraiment ouvert la voie à la modélisation des maladies du myocarde in vitro et permet d’expérimenter des médicaments dans le cadre humain sans injecter le médicament dans le corps humain.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de maintenir les cellules IPS dans des conditions libres et de les différencier en cardiomyocytes grâce à une méthode basée sur l’agrégation des corps embryonnaires.