Name: Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Découvrez la différenciation de cardiomyocytes humains à partir de cellules souches pluripotentes induites en conditions sans chargeur. Cette méthode utilise des corps embryonnaires pour générer des cellules cardiaques fonctionnelles.

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BS a été soutenue par l&#39;Université du programme de formation et de recherche d&#39;été pour étudiants Milan-Bicocca; recherche a été financée par des fonds du ministère italien de la Santé et le ministère italien de l&#39;Education, de l&#39;Université et de la Recherche et la Fondazione Humanitas à GC, nous remercions Michael VG Latronico pour la lecture critique de la manuscrit.

1. Entretien chargeur et sans repiquage des iPS humaines lignées cellulaires <ol><li> Préparer les plats Matrigel revêtus. Décongeler une fiole de Matrix ESC qualifié humaine sur la glace pendant une heure et diluer dans 25 ml de milieu DMEM-F12. Ajouter 1 ml de chaque plaque de 35 mm (ou des quantités équivalentes par unité de surface si d&#39;autres plats sont utilisés), tout garder sur la glace et faire en sorte que toutes les plaques et tubes sont pré-refroidi. Couvrir les plaques avec du papier d&#39;aluminium. </li></ol> Note: actions concentrations de Matrigel varient selon le lot. instructions de dilution sont indiqués sur la feuille de données. <ol start="2"><li> Conserver les plaques sur de la glace pendant la nuit et de retirer de la glace le lendemain. Les plaques peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu&#39;à une semaine avant de l&#39;utiliser. </li><li> Préparer le milieu complet mTESR1 (ou décongeler un flacon de milieu Nutristem) et le H-ESM (Moyen CSE humaines), selon le tableau ci-dessous. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Concentration finale </td><td> Pour 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout remplacement Serum (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM acides aminés non essentiels </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 pi </td></tr><tr><td> B27 supplément - sans VitaminA </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> moyen d&#39;actions peut être conservé à 4 ° C pendant plus de 2 semaines. Pour préparer un milieu de croissance complet, le FGF basique est ajouté juste before alimentation à une concentration finale de 20 ng / ml. </li></ol> Note: Complete H-ESM conditionnés sur des fibroblastes embryonnaires de souris peut être utilisée à la place de mTESR1 ou Nutristem pour les cellules iPS. <ol start="4"><li> Placez plaques enduites dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min à 2 h avant repiquage. </li><li> Les cellules doivent être repiquées environ tous les 5 jours, même si elles n&#39;ont pas atteint la confluence. Colonies ne doivent pas se toucher. </li><li> Remplacez le milieu de croissance avec 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissoudre à partir d&#39;un mg / ml de bouillon dans 10 PBS). </li><li> Retirer différencier les zones où tiré Pipettes Pasteur en verre. Domaines qui devraient être supprimés incluent des structures en forme de cratères ou kystique dans le centre de colonies, et les zones où les cellules ont été séparés de colonies et aplaties et semblent être la migration vers l&#39;extérieur. </li><li> Incuber à 37 ° C sous une hotte de culture jusqu&#39;à ce que les frontières de la colonie deviennent plus lumineux et commencent à se détacher (généralement autour de 5-7 min). Discard dispase. Laver avec 1 ml H-ESM et le jeter. </li><li> Dans 1 ml de H-ESM, utilisez un levier de cellule (en forme de spatule grattoir) aux colonies de récolte et de rassembler dans un tube Eppendorf 15 ml. Rincer avec 1 ml H-ESM et d&#39;ajouter au tube. Tourner à 1.000 rcf pendant 4 min et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre le culot dans 1 milieu de croissance préchauffé ml (soit mTESR1 ou Nutristem). Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en baisse de moins de 6-8x. Déterminez le nombre de cellules doit être plaqué et éliminer les cellules inutiles (généralement 01h04 ou 01h05 dilution), par exemple pour 2 plaques à 1:5, supprimer 600 ul, puis ajouter 1,6 ml de milieu frais. </li><li> Retirer Matrigel à partir de plaques. cellules de lieu goutte à goutte, répartissant uniformément sur la plaque. Evitez de secouer le tube trop, car cela va amener les cellules à se déplacer vers le centre. </li><li> Lavez tube avec 1 ml de milieu et fracture entre les plaques. Le volume final dans chaque assiette devrait être de 1,5 -2 ml. </li><li> Changer le milieu tous les jours, sauf le jour après repiquage. Bien qu&#39;il soitidéal pour changer le support de tous les jours, cela peut être parfois modifié à une fréquence d&#39;une fois tous les deux jours si pas plus de 2-3 jours se sont écoulés depuis le dernier passage sans affecter le potentiel pluripotence ou de différenciation. </li><li> Si la ligne de la cellule doit être congelée, remettre en suspension au lieu de 1-2 ml de milieu de congélation mFreSR utilisant une pipette de 2 ml et placer 1 ml / cryovial. Placer les flacons dans un Cryobox à -80 ° C et le transfert de l&#39;azote liquide dans les 3-4 jours. </li></ol> Note: Manuel microdissection de cellules iPS doit être effectuée sous une loupe binoculaire. Une fécondation in vitro (FIV), poste de travail (par exemple, une station de travail à partir de la FIV KSystem) intégré avec un microscope stéréoscopique permet la manipulation des cellules dans des conditions stériles pendant qu&#39;ils sont maintenus sur une surface chauffée. Si ce n&#39;est pas disponible, une loupe binoculaire peut être déplacé sous une hotte à flux laminaire régulier. 2. Embryoïde organismes Agrégation et cardiaque induction <ol><li> Préparez-20 EBM moyen selon le tableau ci-dessous. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Concentration finale </td><td> Pour 500 ml </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (origine Amérique du Sud) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> MEM acides aminés non essentiels </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline - streptomycine </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 50 pM </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Utilisation de FBS d&#39;origine Amérique du Sud est essentiel pour déterminer l&#39;efficacité de différenciation: l&#39;emploi d&#39;autres types de sérums peuvent affecterle processus de différenciation. Pour préparer EBM-20, l&#39;acide ascorbique module complet (AA) à une concentration finale de 50 ng / ml. Un milieu de croissance complet peut être conservé à 4 ° C pendant pas plus d&#39;une semaine. </li><li> iPS colonies de récolte telles que décrites ci-dessus (étapes 1.6 à 1.9). </li><li> Reprendre doucement dans 1 ml EBM-20 avec une pipette de 2 ml. Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en bas pas plus de 2 à 3 fois, vérifier la taille des colonies sous la loupe binoculaire. Plaque sur des plaques ultra-faible attachement au rapport 1:1 (par exemple pour un plat de 35 mm, utiliser 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits). Rincer le tube avec 1 ml EBM-20 et ajouter à la plaque. </li></ol> Note: La taille des colonies affectent le processus de différenciation, de contrôler l&#39;efficacité et le moment de l&#39;induction cardiaque. Agrégation de façon homogène taille EB ont été montré pour réduire la variabilité observée au cours de la différenciation. <ol start="4"><li> Au jour 3, changer EBM-20 une fois en utilisant un microscope à éviter à nouveauDépose d&#39;EBS. Gardez la pipette contre bord de la plaque, et éliminer le milieu. </li><li> Au jour 7, le commutateur à EB plaques revêtues de 0,1% de gélatine et placé précédemment à 37 ° C pendant 30 min. Si nécessaire, la gélatine peut être retirée et des plaques laissé sous hotte de culture cellulaire S / N. Ajouter 35-40 EB par boîte de 35 mm. </li><li> Vérifiez EB pour battre les zones et les changements EBM-20 deux fois par semaine. Marquez où zones battantes sont situés sur le dessus du couvercle du plat, afin de faciliter leur localisation sous la loupe binoculaire. Zones contractantes devraient apparaître après environ 10-20 jours. </li><li> Lorsque les zones où la contraction spontanée apparaissent, passez à moyen et EBM-2 (préparer comme EBM-20, avec 2% de FBS place) et les isoler comme décrit ci-dessous dans la section 3. </li><li> Continuez à vérifier d&#39;autres domaines pour battre et changer moyenne deux fois par semaine jusqu&#39;à zones battantes sont nécessaires pour d&#39;autres expériences. </li></ol> Note: l&#39;efficacité du processus de différenciation est très dépendanteplusieurs facteurs, le plus important dont les lignées cellulaires spécifiques et le lot de sérum utilisé pour induire la différenciation cardiaque. Pour obtenir le rendement le plus élevé, des lignées de cellules de test pour le potentiel cardiomyogénique et divers lots de sérum. 3. Battre les zones d&#39;isolement et de la culture <ol><li> Plaques à 12 puits manteau (4 cm zone 2) ou les plaques d&#39;intérêt avec 5 ug / cm 2 fibronectine, dilués dans du PBS pour faire un volume suffisant pour couvrir toute la surface complètement (300 totale par puits dans des plaques à 12 puits). Gardez découvert dans la hotte de culture cellulaire et laisser sécher. Les plaques peuvent être conditionnés et conservés à 4 ° CO / N. </li><li> Retirez zone à l&#39;aide d&#39;un verre battre tiré pipette Pasteur et scalpel, selon les besoins. Transfert à plaques revêtues de fibronectine avec une pipette de 1 ml. </li><li> Ajouter 1 ml EBM-2. </li><li> Rayez la plaque pour indiquer les zones où les cellules ont été enlevés et changer le milieu. Les plaques peuvent être conservés jusqu&#39;à 1 mois, comme d&#39;autres secteurs peuvent commencer bmanger plus tard. </li></ol> Remarque: Si les petites touffes battant sont nécessaires, une pipette la zone explanté monter et descendre plusieurs fois sous la loupe binoculaire, jusqu&#39;à ce qu&#39;il casse en petits morceaux. Cela se traduira par des groupes de quelques cellules de battage (voir film 3). <ol start="5"><li> Changer le milieu deux fois par semaine avant d&#39;être prêt pour les analyses. </li></ol> Note: cardiomyocytes obtenus à partir de ce protocole possèdent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles du fœtus ressemblant; maturation vers un phénotype adulte comme peut être obtenu en augmentant le temps de la culture afin de mieux différencier ces cellules. 4. Simple Battre cellules d&#39;isolement et de l&#39;analyse <ol><li> Manteau de diapositives 2 chambre (4 cm zone 2) ou autres supports appropriés avec 5 ug / cm 2 fibronectine dilué dans PBS suffisante pour couvrir la surface de culture entier. Si un support de verre est utilisé, manteau avec la laminine et la fibronectine (5 ug / cm &lt;sup&gt; 2 chacun). </li><li> Retirez zone battre avec une pipette Pasteur / scalpel à partir des plaques de la section 3. </li><li> En utilisant une pipette de 1 ml, transférer les cellules sur un tube de 15 ml contenant 500 ul collagénase II (480 U / ml dans PBS avec Mg et Ca) et incuber 15 min à 37 ° C, en agitant le tube une fois au cours de l&#39;incubation. </li><li> Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette 200 pl. Si les grumeaux restent, transfert à frais collagénase II et répétez l&#39;étape 4.3. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.4 jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun de grosses touffes sont laissés. </li><li> Inactiver collagénase avec 3 ml EBM-2 (sans AA). Le tube peut alors être laissée sous le capot dans un rack chauffée jusqu&#39;à ce que d&#39;autres tubes sont prêts. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min. </li><li> Remettre le culot dans 1 ml de trypsine à 0,25% / EDTA (dilué à partir d&#39;un stock de 0,5% dans du PBS 1X) et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Combiner les fractions de digestions du même échantillon initial. </li><li> Inactiver la trypsine avec 4 ml EBM-2 (sans AA). Passez cellules à travers une aiguille 18G sur une seringue de 2,5 pas plus than 7x. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml EBM-2 par puits et la plaque. Les cellules peuvent être utilisées pour des analyses morphologiques et fonctionnelles 2-3 jours après placage. </li></ol>

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</ol>

Aucun intérêt financier à divulguer.

Les cellules souches pluripotentes ont le potentiel de se différencier spontanément en GC, mais avec une faible efficacité et une forte variabilité entre les lignes. Le développement de nouvelles méthodes d&#39;induction a donc mis l&#39;accent sur l&#39;amélioration de l&#39;efficacité du processus et se déplaçant vers des protocoles plus définis. Cependant, la plupart de ces nouvelles méthodes de différenciation sont assez complexes, nécessitant des conditions complexes de la culture, le contrôle précis de la synchron...

Historiquement, l&#39;étude des mécanismes génétiques et moléculaires de conduire le développement humain et la maladie a été basée sur la production de modèles de recherche génétiquement modifiés. Cependant, de nombreux phénotypes humains ne parviennent pas à être reproduit avec succès chez la souris, principalement en raison des différences biologiques existant entre les deux espèces. D&#39;autre part, l&#39;accès aux tissus humains peuvent être limitées et souvent ne permettent pas suffisamment de matière pour être obtenue pour des études expérimentales en profondeur. Le domaine de la biologie cardiovasculaire souffre de ces deux limites: la physiologie du cœur de l&#39;homme est nettement différente de celle de la souris, et une quantité importante de tissu cardiaque est uniquement accessible post-mortem ou pendant la chirurgie cardiaque. Trouver une source optimale pour la différenciation fonctionnelle de CMS Human est donc devenue un sujet central en biologie cardiovasculaire, et beaucoup d&#39;efforts ont été faits pour résoudre ce problème. Différents types de cellules ont été proposées, including myoblastes squelettiques, cellules cardiaques locaux souches de moelle osseuse, des cellules mononucléaires, des progéniteurs endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. Toutefois, les données obtenues en utilisant ces cellules n&#39;ont pas été conforme 4. La dérivation de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) 5 et la découverte révolutionnaire de cellules induites souches pluripotentes (iPS) par Yamanaka et Thomson 6,7 semblé première tard pour apporter des solutions: ces cellules ont la capacité de croître indéfiniment et le potentiel de donner augmenter à tous les dérivés de cellules des trois feuillets embryonnaires, dont les GC. L&#39;utilisation de cellules iPS offre d&#39;autres avantages: être dérivées de cellules autologues adultes, ils portent le même génome que l&#39;individu ou le patient dont ils sont issus. Ils permettent donc le développement de modèles in vitro qui facilitent la recherche sur les maladies et les mécanismes de développement génétiques humaines. En vertu de cette caractéristique, les cellules iPS peuvent également overcome problèmes liés au rejet immunitaire et les questions éthiques 8. Pour ces raisons, même si les CES représentent toujours l&#39;étalon-or dans le domaine de la biologie des cellules souches, les chercheurs du monde entier sont en train de passer plus vers la technologie des cellules iPS. Les cellules iPS sont maintenant utilisés pour modéliser les maladies humaines in vitro pour diverses conditions, y compris les troubles cardio-vasculaires congénitales 9,10. Récemment, l&#39;application de la modélisation des maladies des cellules iPS a été effectuée pour des troubles cardiaques monogéniques (par exemple syndrome du QT long, catecholaminergic tachycardie ventriculaire polymorphe) et les pathologies dans lesquelles les malformations cardiaques font partie d&#39;un phénotype complexe (ie Leopard et Timothy syndromes, cardiomyopathie dilatée). Ces rapports ont confirmé que les cellules iPS spécifiques au patient qui se différencient en GC présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles similaires à celles de la maladie in vivo. Cependant, ilya encore de nombreux défis pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;induction des cellules iPS dans la lignée cardiaque. La génération spontanée de la CMS à partir de CSE humaines par la formation d&#39;agrégats appelé corps embryoïdes (EBS) ont fait leurs preuves 17. Depuis cette découverte, de nombreuses autres méthodes ont été proposées. De nombreux groupes ont grandement amélioré l&#39;efficacité du protocole de différenciation et se sont déplacés vers les réactifs de culture chimiquement définis et animale produits frais (voir Mummery, C., et al., De la recherche de Circulation (2012) pour un examen complet de toutes les méthodes 3 existants ). Néanmoins, la méthode classique basée sur EB agrégation représente toujours le plus couramment utilisé pour réaliser des études fonctionnelles et d&#39;enquêter sur les mécanismes de la maladie. Notre protocole proposé est fondé sur l&#39;agrégation des cellules iPS dans EBS et de la culture en présence d&#39;acide ascorbique et de sérum, qui a été montré pour améliorer le processus de différenciation cardiaque et de poincidence sitively la maturation de ces cellules 18,19. Dans cet article, nous allons passer par cette méthode en détail et nous allons montrer comment utiliser des lignées de cellules iPS chargeur sans pour générer spécifique au patient CM iPS dérivées.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Milieux et réactifs</td></tr><tr><td>Human ESC qualifié Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>décongeler le flacon de 5 ml à 4 &deg ; C sur glace O/N, aliquote dans des cryo-tubes pré-réfrigérés sur glace, selon les instructions de dilution de la fiche technique et stockage à -20 &deg ; L .</td></tr><tr><td>Fibronectine, à partir de plasma humain, solution à 0,1 %</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Concentration de travail : 5 &mu ; g/cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Concentration de travail : 5 &mu ; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (sans Mg ni Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (avec Mg et Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, protéase neutre, grade II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Stock : 10 mg/ml dans du DMEM-F12 à -20 &deg ; C, solution de travail : 1 mg/ml dans du PBS (pas de Mg/Ca)</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA, 0,5 %</td> <td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Dilué à 480 U/ml (par exemple 1,6 mg/ml) dans du PBS avec Mg et Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Sérum Knockout Remplacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Dégel à 4 &deg ; C, aliquote et stockage à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>F&#8211 ; tal Sérum bovin (origine Amérique du Sud)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Les lots doivent être testés pour leur potentiel cardiogénique. Décongeler à 4 &deg ; C, inactivé par la chaleur à 56 °C C pendant 30 min, aliquote et conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>PenStrep, pénicilline-streptomycine, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplément, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211 ; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine, à partir de peau de porc</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Stocker à 1 % dans l’eau, stocker à -20 &deg ;C. Diluer à 0,1 % dans PBS et conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Combinez le supplément 5X avec le milieu de base, aliquotez-le et stockez-le à -20 &deg ;C. Ne pas maintenir le milieu complet à 4 &deg ; C pour plus de 1 semaine</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent de Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Décongélation à 4 &deg ; C O/N, aliquote et stockage à -20 &deg ; C jusqu’à l’utilisation. Les aliquotes peuvent être maintenues à 4 &deg ; C pour une semaine au plus.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Préparer des stocks à 10 mg/ml dans de l’eau. Stocker les aliquotes à -20 &deg ; C dans l’obscurité. Ajouter à l’EBM à la concentration finale (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm Boîtes de culture</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 12 puits</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox Lames de chambre 2 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre 2 puits en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits, surface d’attache ultra-faible</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18G</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes pasteur en verre, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 2,5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</td></tr>Station <tr><td>de travail FIV</td><td>KSystem, par Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cardiomyocytes humains: un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afin d&#39;enquêter sur les événements de conduite développement du cœur et de déterminer les mécanismes moléculaires conduisant à des maladies du myocarde chez l&#39;homme, il est essentiel d&#39;abord de générer des cardiomyocytes humains fonctionnels (CMS). L&#39;utilisation de ces cellules dans la découverte de médicaments et les études de toxicologie serait également très bénéfique, en permettant de nouvelles molécules pharmacologiques pour le traitement des troubles cardiaques être validées au stade clinique sur les cellules d&#39;origine humaine. Parmi les sources possibles de la CMS, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont parmi les plus prometteurs, car ils peuvent être directement dérivées de tissus du patient facilement accessibles et possèdent une capacité intrinsèque pour donner naissance à tous les types cellulaires de l&#39;organisme 1. Plusieurs méthodes ont été proposées pour la différenciation des cellules iPS en GC, allant des classiques des corps embryoïdes (EBS) approche agrégation des protocoles définis chimiquement 2,3. Dans cet article, nous proposons un protocole EBS-base et montrons comment cette méthoD peut être utilisé pour générer efficacement des cellules CM-comme fonctionnels à partir de cellules iPS sans chargeur.

Dans nos études, nous avons généré CM de plusieurs lignées de cellules iPS. Ces lignes ont d&#39;abord été générées sur une couche nourricière MEF mais ont été immédiatement placés sur Matrigel utilisant un milieu défini (soit mTESR1 ou Nutristem). Différents tests ont permis de vérifier l&#39;entretien des propriétés morphologiques, l&#39;expression de marqueurs typiques des cellules pluripotentes (Oct-4, SSEA4 et TRA1-60) et leur stabilité du génome (Figure 1). L&#39;inser...

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l&#39;induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

L'objectif général de cette procédure est de différencier des cardiomyocytes humains à partir de cellules IPS humaines cultivées dans des conditions sans cellules nourricières. Cette étape est réalisée en semant d'abord les cellules IPS dans des plaques à attachement ultra-faible afin de former des embryocorps. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les embryocorps formés dans des boîtes traitées avec de la gélatine.Lorsque des zones contractiles apparaissent, elles sont disséquées manuellement au microscope stéréo et mises en culture dans des boîtes recouvertes de fibronectine. Pour poursuivre la différenciation, la dernière étape consiste à obtenir des cardiomyocytes individuels par digestion enzymatique des agrégats contractiles. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une différenciation en cellules semblables à des cardiomyocytes exprimant des marqueurs structuraux typiques, par exemple la troponine cardiaque, grâce à la microscopie par immunofluorescence.Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie cardiovasculaire, par exemple, quels sont les mécanismes responsables de la différenciation cardiaque et de la dys

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Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Ici, nous décrivons un protocole robuste pour la dérivation des cardiomyocytes humains qui combine la différenciation cardiaque modulée par de petites molécules et la purification des cardiomyocytes médiée par la privation de glucose, permettant la production de cardiomyocytes purifiés à des fins de modélisation des maladies cardiovasculaires et de criblage de médicaments.

Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques.  Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Ici, nous présentons un protocole de différenciation des cardiomyocytes robuste, rapide et évolutif pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cardiomyocytes dérivés à l’aide de cette méthode à grande échelle peuvent fournir un nombre suffisant de cellules pour leur utilisation efficace dans la modélisation des maladies cardiovasculaires humaines, le criblage de médicaments à haut débit et potentiellement des applications cliniques.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Nous présentons trois protocoles nouveaux et plus efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines induites dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et une méthode de distribution qui permet d'améliorer la prise de greffe de cellules transplantées en combinant l'injection de cellules avec la livraison de cytokines pièce à médiation.

Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique

La caractérisation électrophysiologique des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CMH-CM) est cruciale pour la modélisation de la maladie cardiaque et pour la détermination des réponses aux médicaments. Ce protocole fournit les informations nécessaires pour dissocier et plaquer les CMH-CM sur les réseaux multi-électrodes, mesurer leur potentiel de terrain et une méthode pour analyser les intervalles QT et RR.

Analyse électrophysiologique des cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) utilisant des matrices multi-électrodes (MEA)

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

Nous décrivons ici une méthode évolutive, en utilisant une combinaison simple d’activine A et induite par le lentivirus Id1-surexpression, pour générer des premiers progéniteurs cardiaques de coeur comme champ et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines.

Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

Cet article contient un ensemble de protocoles pour le développement des réseaux de cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (hiPSC-CM) cultivés sur des plaques MEA multiwell pour électroporater réversiblement la membrane cellulaire pour des mesures potentielles d'action. Les enregistrements à haut débit sont obtenus à partir des mêmes sites cellulaires à plusieurs reprises au cours des jours.

Réseaux de cardiomyocytes dérivés de l'iPSC sur des réseaux de micro-électrodes multipuits pour des enregistrements potentiels d'action récurrents

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient

Découvrez la différenciation de cardiomyocytes humains à partir de cellules souches pluripotentes induites en conditions sans chargeur. Cette méthode utilise des corps embryonnaires pour générer des cellules cardiaques fonctionnelles.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

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