Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

L'objectif général de cette procédure est de différencier des cardiomyocytes humains à partir de cellules IPS humaines cultivées dans des conditions sans cellules nourricières. Cette étape est réalisée en semant d'abord les cellules IPS dans des plaques à attachement ultra-faible afin de former des embryocorps. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les embryocorps formés dans des boîtes traitées avec de la gélatine.

Lorsque des zones contractiles apparaissent, elles sont disséquées manuellement au microscope stéréo et mises en culture dans des boîtes recouvertes de fibronectine. Pour poursuivre la différenciation, la dernière étape consiste à obtenir des cardiomyocytes individuels par digestion enzymatique des agrégats contractiles. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une différenciation en cellules semblables à des cardiomyocytes exprimant des marqueurs structuraux typiques, par exemple la troponine cardiaque, grâce à la microscopie par immunofluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie cardiovasculaire, par exemple, quels sont les mécanismes responsables de la différenciation cardiaque et de la dysfonction au cours du développement cardiaque et des maladies au niveau du cardiomyocyte humain. Il s'agit d'une technique particulièrement intéressante, car elle permet la génération de cardiomyocytes in vitro à partir de patients humains et d'individus humains. Ensuite, elle permet la reconstitution de la maladie dans un tube à essai, de sorte que de nouveaux médicaments puissent être testés in vitro avant d'être expérimentés in vivo.

Commencer l'expérimentation avec des cultures de cellules IPS confluentes cultivées sur des plaques de 35 millimètres recouvertes de Matrigel. Remplacer le milieu de croissance par un millilitre de PBS contenant un milligramme de diss. Observer les cellules à l’aide de pipettes en verre tirées.

Retirez les régions présentant des cellules différenciées, telles que des structures en forme de cratère ou kystiques situées au centre des colonies. Supprimez également les zones où les cellules se sont dissociées, aplaties et semblent migrer vers l'extérieur. Incubez ensuite les cellules restantes à 37 degrés Celsius sous une hotte de culture jusqu'à ce que les bords des colonies deviennent plus brillants et commencent à se détacher.

Cela prend généralement entre cinq et sept minutes. À ce stade, retirez la solution de dispa et lavez les cellules avec un millilitre de HESM. Puis jetez la solution de lavage.

Dans un nouveau millilitre de HESM, utilisez un détacheur cellulaire pour récolter les colonies. Rassemblez les colonies dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, rincez les cellules avec un autre millilitre de HESM et centrifugez-les à 1000 ×g pendant quatre minutes.

Procédez ensuite au semis des cellules sur de la matrigel et changez le milieu tous les jours pendant la culture. Commencez par récolter les colonies IPS non différenciées comme décrit dans la section précédente. Une fois les populations non différenciées isolées, resuspendez-les délicatement dans un millilitre d'EBM 20.

À l’aide d’une pipette de deux millilitres, ne pas trop disperser les agrégats cellulaires. Limiter la pipétation à deux ou trois aspirations. Vérifier la taille des colonies au stéréoscope entre chaque aspiration.

Lorsque les colonies ont toutes à peu près la même taille, elles n'ont pas besoin d'être mélangées davantage. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plaques à adhérence ultra faible, en utilisant une plaque de six puits par plaque de cellules récoltées. N'oubliez pas de rincer le tube avec un millilitre d'EBM 20 et de répartir ce rinçage dans la plaque.

Après le troisième jour d'incubation, changez le milieu en utilisant un microscope afin d'éviter de retirer les corps embryonnaires. Tenez la pipette près du bord de la plaque. Au septième jour, transférez les corps embryonnaires dans des plaques recouvertes de gélatine à 0,1 %, préalablement réchauffées à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ajouter de 35 à 40 corps embryonnaires dans chaque boîte de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu. Pendant la culture, changer le milieu deux fois par semaine régulièrement.

Vérifiez les corps embryonnaires à la recherche de zones battantes et indiquez l'emplacement des zones de battement. Sur le couvercle de la boîte, des zones de battement contractiles devraient apparaître après environ 10 à 20 jours. Lorsque des zones présentant une contraction spontanée apparaissent, changez leur milieu pour du EBM deux. Après l'apparition des zones contractiles, poursuivez la culture et surveillez les autres zones de la plaque pendant jusqu'à un mois.

Au total. Dans le milieu de base d'Endothelial (EBM), le déficit du processus de différenciation dépend fortement de plusieurs facteurs, les plus critiques étant les lignées cellulaires spécifiques et le lot de sérum utilisé pour induire la différenciation cardiaque. Pour obtenir une efficacité maximale, testez plusieurs lignées pour leur potentiel cardiogénique ainsi que différents lots de sérum. Commencez par revêtir une plaque de 12.

Les plaques de culture doivent être recouvertes intégralement sur chaque puits avec cinq microgrammes par centimètre carré de fibronectine dans 300 microlitres de PBS par puits. Laissez les plaques sécher à l’air libre dans une hotte de culture cellulaire. Pour éliminer la zone de bourgeonnement de la culture cellulaire, utilisez une pipette en verre étirée et un scalpel.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de un millilitre, transférez quatre à cinq pinces dans chaque puits d’une plaque revêtue de fibronectine. Une fois tous les prélèvements effectués, ajoutez un millilitre d’EBM deux dans les puits chargés de la plaque de prélèvement, puis marquez les zones où les cellules ont été retirées. Changez ensuite le milieu et remettez la plaque dans la hotte de culture.

Si de plus petits agrégats battants sont nécessaires sous un microscope stéréo, faites passer les zones explantées à travers une pipette. Cela produit de petits groupes contenant quelques cellules battantes. En culture.

Changer le milieu deux fois par semaine jusqu'à ce que les échantillons soient prêts pour l'analyse. Préparez d'abord des lamelles carrées de quatre centimètres sur deux chambres en les recouvrant de 20 microgrammes de fibronectine dilués dans suffisamment de PBS pour couvrir la surface. Si un support en verre est utilisé, ajoutez 20 microgrammes supplémentaires de laminine.

Isolez la zone de culture sur billes comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette de un millilitre, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant 500 microlitres de collagénase. Incubez les cellules pendant 15 minutes et agitez le tube une fois durant l’incubation.

Après 15 minutes, faire passer les cellules à l’aide d’une pipette de 200 microlitres afin d’éliminer les agrégats, s’il en reste. Transférer les cellules dans du collagénase deux frais et répéter l’incubation jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’agrégats importants. Mettre fin à la digestion en ajoutant trois millilitres d’EBM deux sans acide ascorbique, tel que préparé pour chacun.

Conserver les tubes dans un bloc chauffant sous la hotte, puis les centrifuger à 1000 ×g pendant quatre minutes à température ambiante. Après centrifugation, préparer une suspension des fractions cellulaires provenant du même échantillon initial dans un millilitre de trypsine-EDTA à 0,25 % dans du PBS. Incuber ensuite la suspension pendant cinq minutes dans le bloc chauffant, puis inactiver la trypsine à l'aide de quatre millilitres de milieu E BM deux sans acide ascorbique.

Ensuite, passez les cellules à travers une aiguille de calibre 18 fixée à une seringue de 2,5 millilitres jusqu'à sept fois, jusqu'à ce qu'aucun gros agrégat ne soit visible au microscope. Puis, centrifugez les cellules à 1000 ×g pendant quatre minutes. Resuspendez maintenant le culot cellulaire dans E BM deux et ensemencez-les sur des lamelles à deux puits.

Les cellules seront prêtes pour les analyses après deux à trois jours d'incubation. Les CMS ont été générés à partir de plusieurs lignées de cellules IPS. Ces lignées ont été initialement produites sur une couche de cellules nourricières en méthyl et immédiatement transférées sur de la matrigel en utilisant un milieu défini.

Les cellules présentaient une morphologie semblable à celle des cellules souches embryonnaires humaines, avec des bords en lumière de phase brillante et des noyaux apparents. L'analyse par immunofluorescence a montré que les cellules IPS exprimaient correctement le facteur de transcription T four et l'antigène de surface TRA one 60. L'analyse cytofluorométrique a confirmé l'expression des antigènes de surface de pluripotence typiques, SS EEA four et TRA one 60.

La stratégie de tri est indiquée dans le nuage de points à gauche. Une analyse du caryotype des cellules FS IP cultivées sur gel de matrice a également été réalisée. L'induction vers la lignée cardiaque a été déclenchée par l'agrégation des cellules IPS en embryoïdes, associée à une culture en présence d'un type spécifique de sérum.

Et les zones contractiles contenant de l'acide sorbique représentaient de 20 à 35 % de la culture totale, selon la lignée cellulaire utilisée. Les CMS contractiles ont été isolés de ces régions par digestion enzymatique et analysés pour l'expression protéique. La RT-PCR a révélé l'expression de canaux ioniques spécifiques au cœur dans les cellules battantes dérivées des IPS, mais pas dans les cellules non battantes.

Ces canaux comprenaient une sous-unité alpha d’un canal calcique dépendant du voltage, une sous-unité alpha d’un canal sodique voltage-dépendant de type cinq, un canal potassium voltage-dépendant de la sous-famille KQT, ainsi que les deux formes de la myosine. Une analyse par immunofluorescence de la chaîne lourde a révélé que les cardiomyocytes dérivés d’IPS exprimaient les protéines structurales, l’actine alpha sarcomérique, la troponine I cardiaque et la jonction spécifique cardiaque, la connexine 43. Après tout, cette technique a véritablement ouvert la voie à la modélisation des maladies myocardiques in vitro et permet d’expérimenter des médicaments dans un contexte humain sans avoir à injecter le médicament dans des organismes humains.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de maintenir les cellules IPS en conditions sans sérum et de les différencier en cardiomyocytes par une méthode fondée sur l'agrégation de corps embryonnaires.