A Caenorhabditis elegans Système modèle pour l'étude de Amylopathy

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les effets de la toxicité de la bêta-amyloïde sur la fonction neuronale et la survie. Ceci est accompli en construisant d’abord des vers transgéniques C elegance exprimant un peptide bêta-amyloïde avec un rapporteur GFP dans un neurone sensoriel SE. Ensuite, la conséquence comportementale de l’expression de la bêta-amyloïde dans un neurone SE est évaluée par un test de chimiotaxie.

La troisième étape consiste à obtenir des cultures primaires de neurones SE, puis à traiter les neurones cultivés avec des agents pharmacologiques tels que Q-V-D-O-P-H pour supprimer l’effet toxique de la bêta-amyloïde. En fin de compte, les résultats peuvent montrer les effets de la toxicité de la bêta-amyloïde sur la fonction et la survie des neurones SE grâce à des tests comportementaux et pharmacologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la neurodégénérescence, telles que l’élucidation de mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques.

Effets neurotoxiques sous-jacents des oligomères bêta-amyloïdes. La démonstration des procédures sera faite par le Dr Zing Dwan, un post-doctorant de mon laboratoire. Pour la transformation, des tampons d’injection de 2 %agros sont nécessaires. Placez une goutte d’aros chaud dissous dans l’eau sur une lamelle en verre, et placez rapidement une deuxième lamelle sur la goutte et tapotez-la légèrement.

Lors de la préparation du mélange d’injection, assurez-vous de centrer et de transférer les cinq microlitres supérieurs, exempts de débris et d’autres contaminants dans un tube frais pour la charge d’injection, le mélange d’injection et le plasmide vide dans une pipette d’injection par capillarité. Un demi-microlitre suffit généralement pour injecter 100 vers afin d’élargir l’ouverture de la pipette d’injection, de frotter son extrémité contre le bord d’une lamelle de recouvrement montée sur une lame de verre. Huile Halo carbon 700. La qualité de l’ouverture est cruciale.

Il est jugé par la forme de la pointe, et surtout, par le débit, évalué par le débit et par la taille des bulles qui se forment à la pointe de la pipette en réponse à la pression d’injection. Placez maintenant une goutte de 700 huile de carbone sur un tampon d’injection et transférez plusieurs vers sur le tampon. Utilisez un pic à vis pour pousser les vers vers sur le tampon jusqu’à ce qu’ils adhèrent aux aros.

Les vers doivent être orientés en rangées avec leurs côtés ventraux alignés. Évitez de toucher leur tête. Si, après plusieurs tentatives, les vers n’adhèrent pas au coussin, essayez un nouveau coussinet ou augmentez l’épaisseur ou la concentration du coussin.

Insérez maintenant la pipette dans la vis sans fin. Tout d’abord, déplacez la platine pour positionner la vis sans fin sous la pipette ensuite. Placez la pipette à côté du noyau central de la gonade.

Parce que son cytoplasme est partagé par de nombreux noyaux de cellules germinales, cela améliore la probabilité que l’ADN injecté soit transmis à la descendance. La pipette doit être presque parallèle à la vis sans fin. Troisièmement, déplacez la pointe verticalement vers le corps jusqu’à ce que la peau soit enfoncée.

Enfin, tapotez doucement le manipulateur pour induire l’insertion des pointes. Injectez maintenant la solution d’ADN. Appliquez une pression sur la pipette jusqu’à ce que la gonade gonfle.

Arrêtez ensuite l’écoulement et retirez la vis sans fin de la pipette. Testez le flux des aiguilles, puis injectez les autres gonades avant de passer au ver suivant. Après les injections, ajoutez environ 10 microlitres de tampon de récupération aux vers et attendez qu’ils commencent à nager.

Une fois la nage, ajoutez un volume égal de tampon M neuf. Lorsque les vers recommencent à nager, continuez à ajouter M neuf jusqu’à ce que la solution soit principalement M neuf. Transférez maintenant chaque ver dans une assiette assise.

Collectez les vers GR dans un millilitre de tampon M neuf dans un tube de faucon de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’un tampon M neuf, lavez les vers par centrifugation répétée et remplacement de la solution jusqu’à ce que le M neuf soit clair après le lavage. Ensuite, ajoutez 10 volumes de solution basique d’hypochlorite aux poux.

Les vers granulés incubent les vers à température ambiante jusqu’à ce qu’environ quatre cinquièmes d’entre eux soient cassés, ce qui prend généralement 10 minutes. Surveillez la réaction en prélevant des aliquotes pour les observer au microscope. Arrêtez la réaction en ajoutant un volume égal de tampon d’œufs stériles.

Récupérez ensuite les œufs et les carcasses par centrifugation à 450 G pendant cinq minutes. Retirez délicatement le surnageant. Ajoutez un volume égal de tampon à œufs et centrifugez à nouveau le tube à 450 G pendant cinq minutes.

Répétez la procédure jusqu’à ce que la mémoire tampon soit effacée. Maintenant, incubez les œufs pendant la nuit dans un tampon M neuf, et le lendemain, épépinez-les sur des plaques NGM standard. Préparez plusieurs cubes d’agar, d’environ un demi-centimètre de côté.

Faites tremper les morceaux de gélose dans une solution contenant l’attractif souhaité pendant deux heures. Déposer un morceau de gélose dans une plaque d’essai de 10 centimètres dans laquelle l’emplacement du point d’essai et d’un point de contrôle a été marqué. Préparez cinq plaques de ce type par expérience.

Laissez les plaques former un gradient chimique en les laissant toute la nuit à 20 degrés Celsius le lendemain. Avant l’expérience, ajoutez 10 microlitres d’azoture de sodium de 20 millimolaires à chaque endroit sur les plaques. Celui-ci agit comme un anesthésique.

Commencez l’expérience en plaçant 20 vers synchronisés d’âge au centre de la plaque, puis placez la plaque dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, comptez les animaux du test sur les points de contrôle et calculez l’indice IC. Après avoir lysé les vers et nettoyé les œufs et les carcasses comme décrit précédemment, mettez-les en suspension dans deux millilitres de tampon d’œuf stérile et ajoutez deux millilitres de saccharose stérile à 60 % dans le tampon d’œufs.

Mélangez ensuite le tube à la main ou au vortex jusqu’à ce que les œufs soient complètement remis en suspension. Centrifugez les œufs remis en suspension à 450 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, récupérez soigneusement le surnageant rempli d’œuf et jetez le palais pour éliminer le saccharose résiduel, remettez les œufs en suspension dans un tampon à œufs et centrifugez-les à 450 G pendant cinq minutes.

Récupérez et jetez délicatement le surnageant, puis répétez le processus de nettoyage trois fois sur la hotte. Utilisez un tampon d’œufs stérile contenant une unité par millilitre de chitinase pour remettre les œufs en suspension granulés. Laissez les œufs digérer à température ambiante pendant 30 minutes, puis commencez à surveiller la réaction au microscope de culture cellulaire inversée.

Lorsque 70 à 80 % des coquilles d’œufs sont digérées, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture L 15 complet ou CM 15. Pour isoler les cellules, dissociez-les afin qu’elles ne forment pas d’amas en les faisant passer à travers une aiguille de calibre 27 à quelques reprises. Passez maintenant la solution dans une seringue avec un filtre de cinq microns.

Granuler la suspension cellulaire dissociée par centrifugation à 450 G pendant 15 minutes. Retirez ensuite le surnageant et remettez en suspension les cellules granulées dans le CM 15. Pour être sûr que les cellules sont dissociées, vérifiez la suspension au microscope.

Enfin, plaquez les cellules dissociées sur des lamelles de verre préalablement enduites. Avec la lectine d’arachide, les cellules peuvent être maintenues à température ambiante avec de l’air normal pendant plus de deux semaines. À l’aide des techniques de transformation décrites, un ver transgénique a été construit pour exprimer un bêta 42 humain dans les neurones a SE, des neurones qui détectent les attractifs hydrosolubles tels que la biotine à l’aide du test de chimiotaxie.

Des vers transgéniques âgés de sept jours ont été testés. Les témoins n’ont eu aucun mal à trouver de la biotine. En revanche, seuls quelques vers exprimant un bêta 42 ont pu trouver le point d’attraction.

L’indice de chimiotaxie pour la biotine était de 0,68 contre 0,12 pour les vers témoins et expérimentaux respectivement à trois ou quatre jours. Il y a également eu une baisse faible mais détectable de l’indice. Un neurone A SER en culture à quatre jours exprimant toujours la GFP après neuf jours de vie.

Cependant, la fluorescence de la GFP a disparu et l’apoptose a été suspectée pour tester cette théorie. Les neurones SER primaires A ont été préparés comme décrit et complétés par un inhibiteur de caspase à large spectre. Comme prévu, le traitement a stoppé la perte de fluorescence en confirmant que l’expression de A bêta 42 humain déclenche l’apoptose dans les neurones A SER.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire les élégants vers transgéniques, de les étudier dans des essais comportementaux et d’obtenir une culture primaire d’Ambrose.