Name: Reconstitution dun canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez la reconstitution de canaux potassiques voltage-dépendants dans des membranes lipidiques pour des études structurales et fonctionnelles. Cette méthode permet d'analyser les effets des lipides sur les protéines membranaires.

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Les des études sur KvAP dans le laboratoire Jiang ont obtenu une aide significative à partir de le laboratoire du Dr Roderick MacKinnon à l&#39;Université Rockefeller. Des remerciements spéciaux vont à M. Kathlynn Brown et Michael McQuire pour leurs conseils et leur aide sur nos expériences phage à l&#39;écran. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (GM088745 et GM093271 à Q-XJ) et AHA (12IRG9400019 à Q-XJ).

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La reconstitution de les canaux KvAP en différentes membranes a été utilisé dans plusieurs études 8-10. Suite à l&#39;idée d&#39;assurer la distribution des lipides entre détergent / lipides micelles mixtes et la protéine / détergent / lipides micelles mixtes, nous sommes en mesure d&#39;atteindre reconstitution presque complète de la KvAP dans des membranes en très différents lipides. Chaque canal KvAP tétramérique a besoin d&#39;~ 100 molécules lipidiques pour couvrir pleinement son domaine transmembranaire...

Cellules matériaux d&#39;échange et d&#39;information avec leur environnement par le biais des fonctions des protéines membranaires spécifiques 1. Les protéines membranaires en membranes cellulaires fonctionnent comme des pompes, des canaux, des récepteurs, des enzymes intramembranaires, linkers et les partisans de structure à travers les membranes. Les mutations qui affectent les protéines membranaires ont été liés à de nombreuses maladies humaines. En fait, de nombreuses protéines membranaires ont été les cibles de médicaments primaires parce qu&#39;ils sont importants et facilement accessible dans les membranes cellulaires. Il est donc très important de comprendre la structure et la fonction des différentes protéines membranaires en membranes, et permettre de concevoir de nouvelles méthodes pour atténuer les effets néfastes des protéines mutantes dans les maladies humaines. Les lipides entourent toutes les protéines membranaires intégrées dans des bicouches 2, 3. Dans les membranes eucaryotes, les différents types de lipides sont connus pour être organisés en microdomaines 4, 5.Beaucoup de protéines membranaires ont été présentés à répartir entre ces microdomaines ainsi que la phase fluide volumineux de membranes 3, 6. Le mécanisme sous-jacent à l&#39;organisation des micro-domaines et la fourniture de protéines membranaires en eux et l&#39;importance physiologique de ces distributions sont clairement importants mais restent mal compris. Une difficulté majeure technique à étudier les effets des lipides sur les protéines membranaires est la reconstitution fiable de biochimiquement purifié les protéines membranaires en membranes de composition lipidique bien contrôlée de sorte que presque toutes les protéines reconstituées sont de 7 fonctionnel. Au cours des dernières années, nous avons développé des méthodes pour reconstituer le canal potassique voltage-gated prototype de A. pernix (KvAP) dans différents systèmes membranaires pour les études structurales et fonctionnelles 8-10. Les données des autres et ensemble, nous ont montré que les lipides sont probablement un facteur déterminant dans les changements conformationnels de la détection de tensiondomaines d&#39;un canal ionique et voltage-dépendants peuvent former des structures de certains de ces canaux 11. Dans le prochain, nous allons fournir une description détaillée de nos méthodes et offrira des conseils techniques essentiels qui vont probablement assurer le succès de la reproduction de nos résultats ainsi que l&#39;extension de nos méthodes pour les études sur d&#39;autres protéines membranaires.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-dodécyl-&#946 ;-D-maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-grade</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946 ;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td> de qualité analogique <td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-DOPE </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>Billes d’agarose NeutrAvidin </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentane</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Décane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution d&#39;un canal kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Pour étudier l&#39;interaction protéine-lipides de manière réductionniste, il est nécessaire d&#39;intégrer les protéines membranaires en membranes de composition lipidique bien défini. Nous étudions les effets de déclenchement de lipides à charge dans un canal potassique voltage-gated prototype (Kv), et nous avons travaillé sur des procédures détaillées pour reconstituer les canaux dans différents systèmes membranaires. Nos procédures de reconstitution prennent considération à la fois la fusion détergent induite par des vésicules et la fusion de protéine / détergent micelles avec le lipide / détergent micelles mixtes ainsi que l&#39;importance de parvenir à une distribution d&#39;équilibre des lipides chez la protéine / détergent / lipides et le détergent / lipides micelles mixtes. Nos données suggèrent que l&#39;insertion des canaux dans les vésicules lipidiques est relativement aléatoire dans les orientations et l&#39;efficacité de la reconstitution est si élevé qu&#39;aucun des agrégats de protéines détectables ont été observés dans des expériences de fractionnement. Nous avons utilisé le reconstituerd canaux pour déterminer les états conformationnels des canaux dans différents lipides, enregistrer les activités électriques d&#39;un petit nombre de canaux incorporés dans des bicouches lipidiques planes, écran de ligands conformation spécifiques à partir d&#39;un-s&#39;affiche phage bibliothèque de peptides, et de soutenir la croissance des cristaux 2D des canaux dans les membranes. Les procédures de reconstitution décrites ici peuvent être adaptées à l&#39;étude d&#39;autres protéines membranaires dans des bicouches lipidiques, en particulier pour l&#39;étude des effets des lipides sur les canaux ioniques voltage-dépendants eucaryotes.

Le flux général des expériences de purification du canal KvAP en homogénéité biochimique est décrit dans la figure 1A. Des échantillons typiques pendant l&#39;expression et la purification de la protéine est montré dans le gel SDS-PAGE à la figure 1B. La protéine après la purification IMAC est relativement pure. Le rendement du canal KvAP est d&#39;environ 1,0 mg / litre de culture. Solubilisation des vésicules lipidiques avec des détergents doit être élabor...

Procédures pour les reconstitution complète d&#39;un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d&#39;électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d&#39;autres protéines membranaires.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une description détaillée des techniques permettant l'étude fonctionnelle et structurale de l'effet des lipides sur les protéines membranaires. Cela est réalisé en exprimant et en purifiant d'abord un canal potassique sensible au voltage. La deuxième étape consiste en la réconstitution du canal ionique.Ensuite, l'enregistrement électrique des canaux ioniques dans des bicouches lipidiques est effectué afin d'étudier la fonction des canaux ioniques. La dernière étape consiste en la cristallisation des canaux ioniques dans la membrane pour la détermination de leur structure. En définitive, des dosages biochimiques, une méthode électrophysiologique et une étude de cristallographie électronique sont utilisées pour examiner les effets des lipides sur le déplacement du capteur de voltage des canaux ioniques.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison des nombreux détails techniques liés à la reconstitution des protéines et aux enregistrements biologiques. Espérons que ce film vous aidera à suivre l'ensemble du protocole et à réussir. La démonstration de l'ensemble de la procédure sera réali

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La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu'elle est combinée avec l'électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

Préparation des liposomes de géant pour l&#39;imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

Évaluer bidimensionnelles (2D essais de cristallisation) pour la formation de réseaux classés protéine membranaire est une tâche difficile et très critique dans cristallographie électronique. Ici, nous décrivons notre approche dans le dépistage et l'identification des cristaux 2D de protéines membranaires principalement des petites de l'ordre de 15 - 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Nous allons démontrer comment étudier l'effet d'une mutation ponctuelle unique sur la fonction d'un canal ionique.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

Découvrez la reconstitution de canaux potassiques voltage-dépendants dans des membranes lipidiques pour des études structurales et fonctionnelles. Cette méthode permet d'analyser les effets des lipides sur les protéines membranaires.

Reconstitution d'un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

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