Reconstitution d'un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

L'objectif général de cette procédure est de fournir une description détaillée des techniques permettant l'étude fonctionnelle et structurale de l'effet des lipides sur les protéines membranaires. Cela est réalisé en exprimant et en purifiant d'abord un canal potassique sensible au voltage. La deuxième étape consiste en la réconstitution du canal ionique.

Ensuite, l'enregistrement électrique des canaux ioniques dans des bicouches lipidiques est effectué afin d'étudier la fonction des canaux ioniques. La dernière étape consiste en la cristallisation des canaux ioniques dans la membrane pour la détermination de leur structure. En définitive, des dosages biochimiques, une méthode électrophysiologique et une étude de cristallographie électronique sont utilisées pour examiner les effets des lipides sur le déplacement du capteur de voltage des canaux ioniques.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison des nombreux détails techniques liés à la reconstitution des protéines et aux enregistrements biologiques. Espérons que ce film vous aidera à suivre l'ensemble du protocole et à réussir. La démonstration de l'ensemble de la procédure sera réalisée par le Dr Hui Jim de mon laboratoire.

Avant la préparation des lipides, préparez un tube à essai en verre jetable de 14 millilitres, un tube en verre à visser et une seringue en verre de 250 microlitres contenant du chloroforme. Transférez ensuite 10 millilitres de chloroforme dans le tube à essai. Pour préparer les liposomes de POPE et de POPG, transférez 3,75 milligrammes de POPE et 1,25 milligrammes de POPG dans du chloroforme dans le tube en verre à bouchon vissé.

Séchez les lipides sous un flux continu de gaz argon lorsque plus aucune trace de chloroforme n'est visible. Poursuivez le séchage sous vide ambiant pendant une heure. Ensuite, ajoutez 440 microlitres de tampon à faible concentration saline ou d'eau dans le vortex de lipides séchés.

Le tube servant à hydrater les lipides. La suspension lipidique doit apparaître blanchâtre et trouble. Ensuite, soniquez la suspension lipidique dans un bain glacé jusqu'à ce que la solution de vésicules devienne translucide.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de chlorure de potassium à trois molar et 10 microlitres de DM à 0,5 molar au mélange, de sorte que la suspension lipidique finale contienne 300 millimolar de chlorure de potassium et 10 millimolar de DM. Incubez la solution sur un rotateur pendant deux heures à température ambiante afin de permettre la formation de micelles mixtes lipides-détergent. Après l'incubation, la suspension devrait devenir légèrement trouble en raison de la fusion induite par le détergent des petites vésicules ELLA. Lorsque la concentration protéique dépasse deux milligrammes par millilitre, ajoutez les composants indiqués, à savoir le mélange lipides-détergent, pour obtenir un volume final de un millilitre.

Incubez ensuite le mélange protéine-lipide-détergent dans le tube en verre sur un agitateur rotatif pendant deux heures supplémentaires. La préparation du KVAP en mélange avec le DTaP ou le DOGS solubilisés par détergent est similaire à la préparation lipidique des vésicules P-O-P-E-P-O-P-G. Toutefois, la sonication des lipides hydratés en de petites vésicules unilamellaires prend plus de temps que pour les lipides P-O-P-E-P-O-P-G ; les vésicules de DOGS peuvent lentement fusionner entre elles et former de petites gouttelettes huileuses afin de solubiliser complètement le dote ou le DOGS.

Les vésicules soniquées sont mélangées avec du DM à 10 millimolaire et du beta og à 40 millimolaire. Le mélange lipide-détergent est incubé toute la nuit à température ambiante et doit être relativement limpide, sans particules ni gouttelettes visibles. Ensuite, mélanger la protéine KVAP avec le DTaP ou le DOGS solubilisés par le détergent, selon un rapport protéine/lipide inférieur ou égal à un pour dix.

Le mélange protéine-détergent-lipide est laissé à incuber à température ambiante pendant deux à trois heures sous agitation orbitale continue. Pour illustrer l'élimination lente des détergents ayant une CMC relativement élevée, tels que le DM et le Béta og, préparez d'abord deux litres de tampon de dialyse pour chaque millilitre de mélange.

Ensuite, découpez un morceau de tubing de dialyse d'une longueur appropriée et rincez-le avec de l'eau DI pour vérifier qu'il n'y a pas de fuite dans le tubing. Ensuite, chargez le mélange protéine-lipide-détergent dans le tubing de dialyse. Serrez les deux extrémités du tubing avec un espace minimal laissé au-dessus de la solution.

Placer le tube chargé sur une plaque agitatrice dans le tampon de dialyse afin que le tube tourne lentement en solution. Changer le tampon de dialyse toutes les huit heures. Préparer maintenant les billes de polystyrène pour l'élimination des détergents ayant une CMC faible en vortexant d'abord 0,5 gramme de billes sèches.

Ensuite, transférez-les dans un tube Corning de 50 millilitres et ajoutez 20 millilitres de méthanol. Soniquez la solution dans un bain pendant cinq minutes pour éliminer les bulles piégées, puis centrifugez pendant cinq minutes à 5 000 tr/min. Après cela, décantez complètement le méthanol et répétez le lavage avec de l’éthanol et de l’eau Milli-Q. Conservez ensuite les billes lavées dans 20 % d’éthanol à quatre degrés Celsius, et remplacez par un tampon sans détergent avant utilisation. Estimez la quantité de détergents présents dans le mélange protéine-lipide-détergent à traiter et calculez la quantité de billes nécessaire pour éliminer les détergents.

Peser les billes humides sans excès d'eau et les ajouter directement au mélange protéique. Attendre au moins 15 à 20 minutes pour que les billes atteignent leur pleine efficacité. Pour éliminer 8,7 milligrammes de DDM dans un millilitre de solution, une quantité totale de 87 milligrammes de billes de polystyrène, telles que les Bio-Beads SM-2, est divisée en cinq portions égales. Mélanger le mélange protéine-lipide-détergent avec chaque fraction pendant 20 à 30 minutes, sous agitation constante par retournement doux à température ambiante.

Faire centrifuger les billes, puis transférer le surnageant vers la fraction suivante de billes et répéter jusqu'à la fin. Dans cette étape, commencer par nettoyer un tube à essai en verre et un flacon teinté muni d’un bouchon vissable à surface en téflon, ainsi qu’un jeu de seringues en verre, à l’aide de chloroforme. Ensuite, sécher le flacon teinté sous un courant de gaz argon.

Transférez ensuite 0,75 milligramme de POPE et 0,25 milligramme de POPG dans du chloroforme dans un flacon en verre et faites évaporer le chloroforme à l’aide de gaz argon. Ajoutez ensuite 0,2 millilitre de pentane dans le flacon pour dissoudre les lipides séchés, puis séchez complètement afin d’éliminer le chloroforme résiduel. Ajoutez ensuite 50 microlitres de décane dans le flacon pour dissoudre le lipide séché.

Maintenant, appliquez les lipides sur le trou circulaire situé à la surface cylindrique du godet à double couche, sans introduire de solution lipidique dans le trou. Attendez une à deux minutes afin que le solvant s'évapore complètement, puis procédez aux enregistrements électriques des canaux KVAP dans les bicouches lipidiques. Insérez le godet dans la chambre d'enregistrement, placez les ponts salins et reliez les électrodes aux deux côtés du godet d'enregistrement.

Ajoutez la solution de cystéine aux trous des électrodes, ainsi que la solution CYS et trans aux compartiments extérieur et intérieur de la chambre. Ensuite, ajustez le décalage de potentiel entre les deux côtés de la cupule à moins de deux millivolts, puis appliquez une couche lipidique sur le trou du bouchon. Attendez que la membrane s'amincisse et devienne relativement stable.

Dès que la membrane devient stable, appliquez 0,5 à un microlitre de solution contenant des vésicules dans le canal en positionnant l'extrémité fine d'une pipette P2 juste au-dessus du trou. Les vésicules tombent à travers le trou jusqu'au fond de la cuve.

Pour tester les canaux KVAP dans la bicouche, appliquer une courte impulsion de 80 millivolts à partir du potentiel de maintien de moins 80 millivolts. En raison de l'inactivation rapide et du lent rétablissement après activation, un long intervalle d'environ 120 secondes est imposé entre deux impulsions pour les canaux dans les membranes PEPG. Une fois que le courant paraît satisfaisant en amplitude, équilibrer les concentrations ioniques dans les solutions des deux côtés de la membrane en ajoutant des sels ioniques supplémentaires du côté à faible concentration.

Voici une image d'un cristal en deux dimensions obtenu par coloration négative, prise lors de l'étape intermédiaire de l'optimisation des cristaux. Les cristaux ont été colorés avec du molybdate d'ammonium 6 %, pH 6,4, additionné de 0,5 % de triose en raison du sucre, qui provoquait parfois leur empilement. Le carré noir désigne une zone donnant lieu à un motif de diffraction présentant des taches de diffraction.

À environ 20 angströms, voici une image de cryo-microscopie électronique d'un cristal 2D provenant d'un échantillon similaire à celui montré précédemment. L'échantillon a été mélangé avec 3 %TLOs et congelé par trempe directe, puis observé au cryo-microscope électronique à 50 000 grossissements. Il est clair qu'il existait des défauts locaux dans l'empilement cristallin.

Voici une autre image de cryo-microscopie électronique d'un cristal davantage optimisé. L'échantillon a été inclus dans 0,75 % de tanin et 10 % de tree hellos, et l'image a été prise à 50 000 x. Les lignes droites observées dans l'empilement serré suggèrent que les canaux étaient bien ordonnés dans ce type de cristaux, tandis que les deux flèches noires indiquent les vecteurs carrés.

Après avoir visionné cette vidéo, j'espère que vous aurez une bonne compréhension de la manière de manipuler correctement les lipides et les protéines, et cette vidéo vous aidera, espérons-le, à étudier plus efficacement l'interaction entre lipides et protéines dans la membrane.