Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire un système modèle pour étudier les effets de l’éclairage laser infrarouge sur les neurones auditifs in vitro. Ceci est réalisé par patch clamping, en cultivant des neurones auditifs dans toute la configuration cellulaire afin d’explorer leurs caractéristiques électriques. Par la suite, l’exposition des neurones à l’irradiation laser peut provoquer des réponses électriques dans la cellule exposée, qui peuvent être mesurées à l’aide d’une pince à patch.

Les paramètres d’éclairage et les variables environnementales peuvent ensuite être modifiés afin d’observer leurs effets sur les réponses électriques induites par le laser. Les neurones auditifs exposés à la lumière laser présenteront une activité électrique reproductible en réponse à chaque impulsion laser pour une analyse ultérieure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les mécanismes sous-jacents à la stimulation infrarouge des neurones du ganglion spiral.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la stimulation infrarouge des cellules ganglionnaires spirales en particulier, elle peut également être étendue à d’autres types de cellules ou à des modèles simplifiés tels que les bicouches lipidiques pour élucider davantage les processus physiques impliqués. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour assurer un positionnement précis de la fibre optique de diffusion de lumière, car l’exposition à la radiance résultante est un paramètre critique, Avoir préparé des micro-pipettes d’enregistrement avec une résistance de deux à six méga ohms. Ils peuvent être retirés du verre de silicate emprunté à l’aide d’un extracteur laser CO2.

Préparez le laser couplé à la fibre. Un large éventail de fibres optiques fonctionnera. La coupe en deux d’une fibre dans une configuration de cordon de raccordement avec des connecteurs FCPC produit deux liaisons de fibre avec un connecteur à une extrémité et une fibre exposée à l’autre extrémité.

Ce sont les nattes. Préparez la pointe d’ours d’une queue de cochon en retirant la gaine de fibre, en nettoyant avec de l’éthanol et en clivant avec un outil approprié sous un microscope. Vérifiez que la pointe est perpendiculaire à l’axe de la fibre et qu’elle semble plate.

Connectez l’autre extrémité de la queue de cochon en fibre à la sortie du laser de stimulation à l’aide d’un connecteur traversant approprié si nécessaire. À ce stade, assurez-vous toujours de mesurer la puissance laser de sortie de la fibre. Faites-le également après toute manipulation supplémentaire de l’embout.

Insérez maintenant la fibre dans un mandrin et fixez le mandrin au micro-positionneur approprié. Ensuite, déterminez l’angle que fait la fibre optique avec un lamelle. Prenez une photo de l’agencement et calculez l’angle à l’aide de l’image J.Maintenant, sécurisez les connexions qui synchronisent le laser avec le système d’acquisition de données de patch clamp.

La sortie numérique du système d’acquisition de données de patch clamp doit être connectée au laser via un générateur de fonctions externe, ce qui permet de spécifier les paramètres d’impulsion laser indépendamment du système d’acquisition de données, le signal utilisé pour déclencher le laser doit être reconnecté à une entrée du système d’acquisition de données pour garantir que le temps et la durée des impulsions laser peuvent être enregistrés en même temps que le signal électrophysiologique, Réglez le débit du système de perfusion entre un et deux millilitres par minute. Un système alimenté par gravité avec un réchauffeur en ligne pour un chauffage rapide de la solution et une pompe péristaltique pour éliminer la solution usée par aspiration fonctionnera. Puits. Placez une lamelle avec des cellules cultivées dans la chambre d’enregistrement d’un microscope vertical à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau à fort grossissement et d’un contraste de phase, localisez un neurone ganglionnaire spiralé.

Un neurone ganglionnaire spiralé typique est en phase, brillant, rond et d’environ 15 microns de diamètre, avec un noyau proéminent. Une fois qu’un neurone approprié a été localisé, passez à un objectif à faible grossissement et localisez le neurone cible. Utilisez ensuite le micro-positionneur pour déplacer la fibre optique jusqu’à ce que la pointe soit proche du neurone cible dans les plans horizontal et vertical.

Revenez à l’objectif à fort grossissement et positionnez l’extrémité de la fibre optique dans sa position prévue à côté du neurone. Lors du réglage de la position verticale de la fibre, il est important que le bord inférieur de la fibre repose sur la lèvre du couvercle. Pour minimiser l’incertitude quant à l’emplacement de la fibre, le point de contact peut être identifié à partir de repères visuels dans l’image du microscope.

Une fois la fibre en position, déplacez-la d’une quantité connue le long de son axe longitudinal afin de ne pas affecter le positionnement de la micro pipette. La micropipette doit être remplie d’une solution intracellulaire et solidement fixée en place sur l’étage supérieur de l’amplificateur. À l’aide d’un tube fixé sur le côté du porte-micro-électrode, appliquez une petite quantité de pression positive pour éviter le colmatage de la micro-pipette.

À l’aide d’un manipulateur micrométrique, déplacez la micropipette en position juste au-dessus du neurone cible et procédez à la fabrication d’un joint giga ohm. Notez la résistance série de capacité de la membrane et la résistance d’entrée déterminées à partir de la courbe exponentielle ajustée au courant. Pendant l’impulsion de test d’étanchéité.

Minimisez les transitoires de capacité en ajustant les commandes CP rapide et CP lente sur l’amplificateur. Basculez ensuite l’amplificateur en mode cellule entière et modifiez la compensation de capacité et de résistance jusqu’à ce qu’un courant plat soit observé pendant le test SEAL. Ensuite, appliquez une compensation de résistance en série avec environ 70 % de correction, 70 % de prédiction, en ajustant les commandes de compensation de capacité et de résistance pour maintenir une réponse d’étanchéité de test plate.

Basculez ensuite l’amplificateur en mode pince de courant. Prenez note du potentiel de la membrane de repos en l’absence d’injection de courant. Réglez maintenant un courant de maintien pour stabiliser le potentiel de membrane au niveau souhaité.

Neutralisez la capacité de la pipette et ajustez l’équilibre du pont pour équilibrer la chute de tension. Vérifiez les propriétés de décharge du neurone en stimulant avec un courant dépolarisant. À ce stade, remettez la fibre optique en position à côté du neurone à l’aide d’un logiciel d’imagerie couplé à une caméra CCD pour capturer des images initialement focalisées sur le plan du neurone, puis focalisées sur le bord supérieur de la fibre optique.

Analysez les images pour déterminer la valeur delta, qui est la position du bord supérieur de la fibre optique par rapport au centre du neurone cible. Il est très important de connaître avec précision la position de la fibre optique. En effet, l’énergie par unité, surface ou exposition au rayonnement délivrée à la cellule cible est un paramètre critique pour la stimulation neuronale infrarouge, et cela peut être considérablement affecté par la position de la fibre par rapport à la cellule.

Ce laser est de puissance optique, est contrôlé par ordinateur via une entrée directe au laser et peut être spécifié manuellement avant chaque enregistrement. La longueur d’impulsion et le taux de répétition peuvent être contrôlés via le générateur de fonctions comme décrit précédemment, assurez-vous que les données sont enregistrées à la fois à partir du canal de pince de patch et du canal de déclenchement laser d’une demi-à 15 millisecondes impulsions laser à 0,25 à cinq. Les millijoules produisent généralement des réponses électriques mesurables. Initialement.

Il peut être utile de régler le taux de répétition des impulsions laser à un hertz ou moins pour minimiser les effets indésirables. Une fois que tous les paramètres du laser ont été réglés. Procédez à la collecte des données.

Les neurones ganglionnaires spiralés réagissent à l’éclairage laser avec des formes d’onde reproductibles à la fois dans la pince de tension et la pince de courant Configurations d’enregistrement en réponse à des impulsions laser de 2,5 millisecondes 0,8 millijoules. Une pile typique produit un courant net vers l’intérieur à différents potentiels de maintien. Les enregistrements par pince de courant montrent une dépolarisation constante de la membrane au cours de ces impulsions laser, suivie d’une diminution approximativement exponentielle vers le potentiel de la membrane au repos après l’impulsion.

Dans certains cas, il y a également une petite dépolarisation supplémentaire de la membrane suite à l’impulsion laser. L’éclairage avec une énergie excessive ou l’exposition à de fortes augmentations de température peut entraîner des dommages cellulaires observés par détérioration des propriétés électriques des cellules ou mort cellulaire instantanée. En suivant cette procédure, une gamme de paramètres environnementaux tels que la température de la solution ou les facteurs chimiques peuvent être modifiés pour tester l’effet de ceux-ci sur l’activité électrique induite par le laser.

N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être dangereux et que des précautions de sécurité standard doivent être mises en place. Il s’agit notamment d’utiliser des lunettes de sécurité laser, des panneaux d’avertissement et de s’assurer que le faisceau ne croise pas involontairement des surfaces hautement réfléchissantes.