ARNi médiée double inactivation génique et de mesure de la perception gustative chez les abeilles (

Ce protocole vidéo illustre des techniques novatrices permettant d'inactiver simultanément deux gènes chez des abeilles adultes, puis de réaliser un test de réponse d'extension du proboscis, ou test PER, afin de mesurer l'effet de cette double inhibition génique sur la perception gustative de l'abeille. Cette approche consiste d'abord à synthétiser des ARN double brin ciblant les gènes codant trois protéines : vitelline, gényne, ultrasphérique, ainsi que la protéine fluorescente verte.

Étant donné que le gène codant pour la GFP n'est pas présent dans le génome de l'abeille, l'ARN double brin de la GFP sert de contrôle négatif. La deuxième étape consiste à injecter de l'ARN double brin dans des abeilles en utilisant quatre stratégies de traitement. Les injections comprennent : l'ARN double brin de la GFP seul, une injection unique avec un mélange d'ARN double brin de VG et de USP, une injection d'ARN double brin de vg le premier jour suivie d'une injection d'ARN double brin de USP le deuxième jour, et une injection d'ARN double brin de USP le premier jour suivie d'une injection d'ARN double brin de VG le deuxième jour. Après les injections, les abeilles sont marquées à l'aide de points de peinture codés par couleur correspondant aux traitements, puis sont remises dans une ruche.

Six jours plus tard, la suppression des gènes VG et USP chez les abeilles traitées est validée par PCR en temps réel, et l'effet de la double suppression de VG et USP sur la perception gustative est déterminé par le test PER. En définitive, les abeilles présentant une double suppression montrent des réductions significatives de l'expression des gènes VG et USP, ainsi que des augmentations significatives de la perception gustative du saccharose. Notre interférence constitue un outil puissant permettant de révéler les fonctions des gènes.

Il est généralement utilisé pour cibler un seul gène. Cependant, les gènes font partie d'un réseau régulateur complexe. Une façon d'améliorer notre compréhension de tout processus biologique consiste à étudier comment les gènes interagissent au sein de réseaux géniques.

Pour ce faire, nous devons manipuler plusieurs gènes simultanément. Jusqu’à présent, nous n’avons été capables de perturber qu’un seul gène à la fois chez les insectes ; ici, pour la première fois, nous souhaitons vous montrer comment inhiber deux gènes chez les abeilles mellifères au lieu d’un seul. Le réflexe d’extension des palpes buccaux (PER) est une technique très utile pour mesurer la perception gustative, qui constitue un indicateur comportemental du comportement social des abeilles mellifères.

Par exemple, les abeilles de nid ayant une forte perception gustative mûrissent rapidement sur le plan comportemental, deviennent butineuses précocement dans la vie et préfèrent collecter du pollen. Pour commencer cette procédure, concevoir des amorces d'ARN doubles brins ciblant les gènes à inhiber à l'aide du logiciel gratuit Primer.Three. Dans cette expérience, les deux gènes ciblés pour l'inhibition sont vitelli, genin ou VG et ultras sphérique ou USP.

En complément des conceptions de VG et d'USP, des amorces d'ARN double brin ciblant un gène témoin codant pour la protéine fluorescente verte, ou GFP, qui n'est pas présente dans le génome de l'abeille, sont utilisées. Par la suite, la synthèse d'ARN double brin pour le VG, l'USP et la GFP est réalisée par transcription in vitro à l'aide du système de production d'ARN T7 Ribomax de Promega.

Après avoir purifié les ARN double brin en utilisant des procédures standard, dissoudre chaque culot d'ARN double brin dans de l'eau exempte de nucléase afin de garantir l'efficacité de la réduction de l'expression génique ; la concentration en ARN double brin doit être d'environ neuf à dix microgrammes par microlitre. Pour préparer les abeilles en vue de l'injection, refroidir les abeilles récemment écloses dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant une à deux minutes. Une fois les abeilles immobilisées, fixer trois à quatre abeilles en parallèle sur des boîtes de Pétri remplies de cire solide à l’aide d’épingles entomologiques croisées entre leurs abdomens et leurs thorax.

Refroidissez à nouveau les abeilles dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant environ une à deux minutes. Veillez à ce que les abeilles soient complètement immobiles. Elles doivent sembler détendues, sans être recroquevillées ou tordues.

L'immobilisation complète est importante, car tout mouvement pourrait augmenter la taille de la plaie et la mortalité. Les abeilles qui sont recroquevillées ou tordues ont été refroidies trop longtemps et ne doivent pas être utilisées en raison d'une mortalité élevée. Fixez une aiguille jetable de calibre 30 sur une microsyringe Hamilton.

Remplir la seringue avec trois microlitres d'ARN double brin et s'assurer qu'il n'y a pas de bulle d'air dans la seringue. Si une stratégie d'injection unique est utilisée, la seringue est remplie avec un mélange des ARN double brin des deux gènes. Si une stratégie d'injection sur deux jours est utilisée, la seringue est remplie avec l'un des deux ARN double brin.

Insérez l'aiguille sur le côté de l'abdomen. Pour éviter d'endommager les organes internes, appuyez lentement sur le piston de la seringue afin que l'ARN double brin soit absorbé. Étant donné que l'ARN double brin est très visqueux, il faut deux à trois secondes pour l'expulser complètement de la seringue.

Après avoir complètement enfoncé le piston, laissez l'aiguille dans la plaie pendant quatre à cinq secondes. Observez les abeilles pendant trois à cinq secondes après l'injection. Si une goutte de liquide hémolymphatique s'écoule de la plaie, jetez l'abeille et marquez le thorax des abeilles avec des couleurs différentes correspondant à différents traitements.

À ce stade, si l'on utilise la stratégie d'injection unique, observer les abeilles pendant une heure dans un récipient avec du miel fourni, puis les replacer dans une colonie. Toutefois, si l'on utilise la stratégie d'injection sur deux jours et que seul le premier ARN double brin a été injecté, placer les abeilles dans une cage cylindrique en treillis métallique avec du miel disposé sur le côté. Garder les abeilles dans une étuve à 34 degrés Celsius et 80 % d'humidité pendant la nuit le jour suivant.

Injectez les mêmes abeilles avec le deuxième ARN double brin, en utilisant la même procédure que pour le premier ARN double brin. Laissez les abeilles se remettre à température ambiante pendant une heure dans un récipient avec du miel fourni, puis introduisez-les dans une colonie. Six jours après les injections, récupérez les abeilles traitées dans la colonie sans utiliser de fumigène pour ouvrir la ruche.

La fumée n'est pas utilisée car elle pourrait affecter la perception gustative des abeilles, qui seront testées dans cette procédure. Collecter les abeilles dans des cages cylindriques en treillis métallique à l'aide de pinces douces, avec pas plus de trois abeilles par cage, afin de monter les abeilles. Pour le test PER.

Refroidir les abeilles à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient complètement immobilisées. Monter chaque abeille verticalement dans un tube en plastique, spécialement conçu pour la PER. Utiliser du ruban adhésif pour maintenir l'abdomen à l'intérieur du tube et laisser la tête dépasser du tube.

Placer les tubes sur un support comportant deux rangées de petites colonnes en plastique. Une des rangées est numérotée afin que les abeilles montées puissent se voir attribuer un numéro d'identification. Placer les supports contenant les abeilles traitées dans un incubateur à 34 degrés Celsius et 80 % d'humidité pendant deux heures, le temps de l'incubation des abeilles.

Préparez une série de solutions aqueuses de saccharose. Chargez les solutions dans des seringues équipées d'aiguilles de calibre 15 à 20 pour le test PER.

Les abeilles sont testées par groupes. Touchez d'abord l'antenne de chaque abeille avec une goutte de solution à 0 %, qui est de l'eau, puis testez avec du saccharose à 0,1 %, 0,3 %, 1 %, 3 %, 10 % et 30 %. Utilisez des solutions aqueuses en respectant un intervalle d'au moins deux minutes entre chaque solution.

Il faut généralement environ deux minutes pour tester 20 abeilles en utilisant une concentration de saccharose. Par conséquent, chaque groupe doit toujours comporter plus de 20 abeilles. Si une abeille déploie complètement son proboscis, une réponse positive est enregistrée en temps réel.

L'analyse par PCR a confirmé que les deux stratégies — injection unique et injections sur deux jours — réduisaient de manière significative les niveaux des transcrits de Fiji et de USP chez les abeilles. Six jours après l'injection d'ARN double brin, représentés sur ces graphiques, la RQ indique le niveau de quantification relative des transcrits des gènes ciblés, et les différentes lettres au-dessus des barres indiquent des différences significatives entre les groupes traités. L'analyse postérieure a révélé que la suppression du transcrit USP par l'injection unique avec un mélange d'ARN double brin, ainsi que par l'injection sur deux jours avec VG en premier et USP en second, était significativement plus faible que celle obtenue avec l'injection sur deux jours où USP était injecté en premier et VG en second.

Cela indique que la VG pourrait être un régulateur principal dans la boucle de régulation impliquant la VG et l'hormone juvénile. Les scores de réponse à la GUA, ou GRS, pour les abeilles traitées ont été calculés à partir des résultats du test de réponse d'extension du proboscis (PER), comme illustré ici. Le GRS chez les abeilles injectées avec un mélange d'ARN double brin ciblant la VG et l'USP était significativement plus élevé que celui des abeilles contrôles GFP, indiquant que les abeilles soumises à l'extinction double étaient plus sensibles au saccharose.

Les différentes lettres au-dessus des barres indiquent des différences significatives entre les groupes traités. On observe ici un réseau régulateur possible entre la vitellogénine, USP (ultraspiracle) sphérique et l'hormone juvénile, mis en évidence par la suppression simultanée des gènes VG et USP. Alors qu'un ARNi simple ciblant USP n'entraîne aucun changement de l'hormone juvénile, un ARNi double ciblant VG et USP provoque une augmentation plus importante de l'hormone juvénile qu'un ARNi simple ciblant VG.

Ceci suggère que vitelli n'inhibe pas seulement la production de l'hormone juvénile, mais inhibe également une réponse de rétroaction de l'hormone juvénile au knockdown de USP. Dans les knockdowns doubles, l'augmentation spectaculaire de la production de l'hormone juvénile résulte d'une inhibition réduite provenant de VI genin causée par le knockdown de VG et d'une réponse compensatoire à une transduction réduite de l'hormone juvénile provoquée par le knockdown de USP. Une discussion plus détaillée de ce réseau régulateur est présentée dans le texte du protocole accompagnant.

En utilisant une approche de double inhibition génique, nous avons mis en évidence une relation détaillée entre les gènes vitaux, les gènes ultras, les gènes sphériques et l'hormone juvénile, relation que nous n'aurions pas pu découvrir en inhibant un seul gène. Désormais, grâce à cette technique, les chercheurs peuvent explorer les interrelations entre les gènes au sein des réseaux régulateurs. La réponse proboscide (PR) est une méthode standard utilisée pour mesurer la perception gustative chez les abeilles, mais elle est très sensible aux manipulations, aussi faut-il faire très attention à maintenir une constance entre l'environnement et la manipulation des animaux.

En outre, si l'essai doit être réalisé sur plusieurs jours, il est conseillé de maintenir une courte échéance et de surveiller attentivement afin de s'assurer que les conditions météorologiques et l'environnement ne changent pas.