Extraction de prostaglandine et de l'analyse en Caenorhabditis elegans

Dans cet article, nous décrivons une procédure optimisé pour l'extraction et l'analyse des prostaglandines et autres eicosanoïdes de

Cette procédure vise à identifier et à mesurer les prostaglandines et autres eicosanoïdes dans les extraits d’élégance marine. Tout d’abord, cultivez les vers dans des cultures à grande échelle. Puis, à l’aide d’une technique d’extraction liquide liquide, extraire les lipides hydrophiles du tissu du ver, injecter les extraits lipidiques dans une colonne HPLC couplée à un spectromètre de masse.

Analysez ensuite les données de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide. En fin de compte, cette approche lc MSMS pour les extraits chauds purifiés peut identifier de nouveaux métabolites et également mesurer des métabolites connus tels que les prostaglandines de la série S. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les immunoessais enzymatiques, est qu’elle est très sensible et spécifique, tandis qu’en même temps, Hugh Hong, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette technique par Hugh Hong, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Culture bactérienne par centrifugation, jeter le surnageant et mettre en suspension la pastille bactérienne dans 100 millilitres de tampon M nine. Conservez la solution bactérienne concentrée à quatre degrés Celsius. Commencez les cultures de vers sur cinq plaques NGM extra larges.

Continuez à propager les vers pendant trois à quatre générations jusqu’à ce que les plaques soient pleines de gravité. Les adultes pour éviter la famine à environ un millilitre de bactéries concentrées dans les plaques de vers au besoin. Sécher complètement à l’air libre avant de placer le couvercle.

Ensuite, lavez les hermaphrodites des plaques avec un tampon M neuf. Récoltez les vers dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres. Laissez ensuite les vers se déposer au fond.

Jetez le surnageant contenant des œufs-bactéries et des vers au stade larvaire. Maintenant, Resus, suspendez les vers restants dans 15 millilitres de tampon M nine et mélangez délicatement. Répartissez 200 microlitres de suspension de vers de terre dans chacune des 60 plaques d’azote GM ensemencées.

Gardez la solution de vers bien mélangée jusqu’à ce que toutes les plaques aient été ensemencées pour vous assurer qu’elles reçoivent un nombre à peu près égal de vers. Répartissez les vers sur les plaques. Cultivez les vers pendant deux à quatre générations, en complétant avec un millilitre de bactéries concentrées par assiette par période de 12 à 24 heures.

Lorsque les plaques sont pleines d’adultes GR, récoltez les vers une souche à la fois. Lavez les vers des plaques avec un tampon M neuf et transférez-les dans six tubes en polypropylène de 50 millilitres. Remplissez les tubes avec un tampon M nine pour laver les vers.

Lorsque l’adulte se dépose au fond, retirez environ 35 millilitres de surnageant. Ensuite, tirez les vers dans un ou deux tubes. Répétez le lavage M neuf trois fois ou jusqu’à ce que le surnageant soit transparent avec une pipette à pasti de gros calibre.

Transférez autant de vers que possible dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres. Centrifugez à 1000 RCF pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Répétez les étapes de récolte, de lavage et de consolidation pour les autres souches.

Stockez les stocks des souches de vers récoltées à moins 80 degrés Celsius. Notez le poids d’un tube conique en polypropylène à l’aide d’une lame de rasoir chauffée au rouge. Coupez un tube de polypropylène congelé contenant des vers récoltés près de la marque des six millilitres.

Dans des conditions stériles. Transférez environ six grammes de pastille de ver congelée dans l’échantillon de pensée. Ajoutez un nanogramme de l’étalon interne et 12 millilitres de solution saline d’acétone glacée.

Avec le mélange BHT, répartissez bien 1,5 millilitres de lisier de ver dans 12 tubes en plastique autoportants de cinq millilitres dans chaque tube. Ajoutez 0,7 millilitre de perles d’oxyde de zirconium stabilisées. Homogénéiser la suspension de vis sans fin si nécessaire.

Répétez le processus pendant une autre minute pour obtenir moins de 10 % de vers intacts à l’aide d’une pipette de pâturage de neuf pouces. Transférez soigneusement l’homogénat mais pas les billes dans quatre tubes de verre coniques de 10 millilitres. Combinez les billes de trois tubes et lavez-les avec un millilitre de solution saline d’acétone contenant du BHT.

Répétez ce lavage pour le reste des billes contenant des tubes. Transférez la solution de lavage dans les tubes de verre sur de la glace. Ensuite, centrifugez l’homogénat à 1000 Gs pendant 10 minutes.

À quatre degrés Celsius, transférez le surnageant de chaque tube dans un tube conique en verre propre de 10 millilitres. Ensuite, dans une hotte chimique, ajoutez un volume égal d’hexane à chaque vortex de tube à vitesse maximale pendant 30 secondes. Après centrifusion à quatre degrés Celsius à 1000 Gs pendant 10 minutes.

Jetez la phase supérieure contenant l’hexane et les lipides chargés neutrement à deux millimolaires d’acide formique pour acidifier la phase aqueuse inférieure. Test avec des bandelettes de pH pour un pH de 3,5. Maintenant, ajoutez des volumes égaux de chloroforme dans chaque vortex de tube à vitesse maximale pendant 30 secondes.

Centrifuger les échantillons à quatre degrés Celsius à environ 1000 GS toutes les 10 minutes. Insérez une pointe de pipette en verre dans la phase inférieure du chloroforme et essayez d’éviter l’interface solide en inclinant le tube. Tirez les extraits de quatre tubes dans un seul tube de verre conique de 15 millilitres.

Purger l’air dans le tube de verre avec de l’azote gazeux et incuber à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures à deux semaines. Après avoir décongelé l’extrait, jetez la couche supérieure aqueuse laiteuse restante si elle est présente. À l’aide d’une pipette neuve.

Transférez le chloroforme dans un flacon en verre demi-DRM doublé de téflon dans une hotte chimique. Évaporez le solvant organique dans un léger flux d’azote gazeux et stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Tout d’abord, préparez des solutions mères de prostaglandines de référence individuelles dans du méthanol.

Générez maintenant une courbe standard par dilution en série dans du méthanol à 80 %. Ensuite, dissolvez les extraits lipidiques séchés de l’élégance de la mer dans 200 microlitres de méthanol à 80 % pour analyse. Injectez 20 à 50 microlitres de l’échantillon dans la colonne de phase inverse et effectuez l’analyse de gradient comme détaillé dans le protocole texte en utilisant l’interface ESI en mode ions négatifs.

Introduire l’effluent de la colonne dans le spectromètre de masse. Réglez le gaz de collision à 10 électronvolts. L’énergie de collision à moins 35 électronvolts.

La température à 600 degrés Celsius. Le potentiel de désencombrement à moins 90 et le potentiel de sortie cellulaire à moins 11 génèrent une courbe standard pour analyser les différentes classes de prostaglandines présentes dans les échantillons extraits à l’aide d’un logiciel d’analyse. Traiter les données pour identifier les prostaglandines présentes dans les extraits de vers.

Des scans d’étude du type sauvage et de la graisse de trois extraits de vers mutants montrent les niveaux globaux d’ions dans la gamme de masse de 315 à 360 unités de masse atomique. Comparé aux vers de type sauvage, les trois derniers mutants manquent de la plupart des 20 pfas de carbone, comme en témoigne une prostaglandine de classe F trois. Avec un rapport de charge principal de 3 51 surligné en gris, les analyses MRM peuvent identifier les différentes classes de prostaglandines.

Par exemple, les prostaglandines de classe F1 sont présentes dans les extraits de type sauvage ainsi que dans plusieurs autres composés hydrophobes avec des temps de rétention plus longs variant la transition de masse permet une analyse plus approfondie des prostaglandines de classe F deux et F trois indiquant que les extraits de vers contiennent plusieurs isomères de prostaglandine de chaque classe. La comparaison de la décomposition induite par collision de la prostaglandine d’élégance marine à la prostaglandine standard peut être utilisée pour cartographier les ions produits de sites de clivage prévus. Afin d’éviter l’oxydation des lipides.

N’oubliez pas de prendre les précautions appropriées. Par exemple, ajoutez l’antioxydant VHT à la solution indiquée et purgez l’extrait avec de l’azote gazeux.