Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée

L'objectif général de cette procédure est de préparer de grandes protéines oligomériques liant l'ADN, telles que MGM 1 0 1, en utilisant la stratégie de marquage par la protéine liant le maltose ou MVP. Cela est réalisé en clonant d'abord le cadre de lecture ouvert de MGM 1 0 1 en aval de MVP dans le vecteur PMLC deux E pour son expression dans e coli. La protéine de fusion M-V-P-M-G-M 1 0 1 est ensuite purifiée à partir de e coli par chromatographie d'affinité AMLO.

Le MGM 1 0 1 est ensuite libéré du MVP par clivage protéolytique et séparé du MVP par chromatographie d'échange cationique. Enfin, les anneaux de MGM 1 0 1 sont purifiés à l'état homogène par chromatographie d'exclusion stérique. Au final, environ 0,8 milligramme de MGM 1 0 1 soluble est obtenu.

Un litre de culture bactérienne peut être utilisé pour la caractérisation biochimique et structurale de cette protéine, qui joue un rôle important dans la réparation de l'ADN au niveau des mitochondries. Le principal avantage de l'utilisation d'une version marquée par une protéine de liaison mortelle de MGM101 réside dans le fait que cette version est moins toxique, plus soluble et plus stable que la version non marquée. Par conséquent, nous pouvons obtenir une expression élevée de la protéine native MGM101 chez E. coli.

Bonjour, je m'appelle Sarah Vicki. Je suis spécialiste principale de soutien à la recherche dans le laboratoire du Dr. Jji TEN à l'Université de médecine et de biologie de SUNY. Mon collègue, Wan Wong, et moi-même allons maintenant démontrer l'expression et la purification de la protéine MGM 1 0 1. Commencez par générer la protéine de fusion en utilisant la PCR pour amplifier la séquence codante mature de MGM 1 0 1.

Ne pas inclure les 22 premiers résidus aminoterminals de MGM 1 0 1, qui sont connus pour être clivés. Après importation dans les mitochondries, le MGM 1 0 1 amplifié est ensuite placé en aval de la séquence MAL E, qui code pour la protéine de liaison au maltose ou MVP, dans une version modifiée du vecteur d'expression PM MAL C deux E. Cela génère une fusion M-V-P-M-G-M 1 0 1 avec un linker contenant un site de clivage pour la protéase de précision. Le plasmide est d'abord construit en sélectionnant des transformants de e coli sans sélection bleu-blanc.

Le plasmide résultant PLC deux E, MGM 1 0 1 est ensuite introduit dans la souche d’e coli BL deux un codon plus DE trois RIL, puis cultivé sur des boîtes de Petri LB contenant de l’ampicilline et du chloramphénicol. Commencez par ensemencer 10 millilitres frais de milieu LB supplémenté avec les transformants d’e coli, puis incubez à 37 degrés Celsius toute la nuit sous agitation à 200 tr/min. Le jour suivant, ensemencez deux litres de milieu LB supplémenté avec 10 millilitres de la pré-culture.

Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius sous agitation. Lorsque la DO 600 atteint 0,5, induire l'expression de la protéine de fusion M-B-P-M-G-M 1 0 1 en ajoutant du IPTG à une concentration finale de 0,3 millimolaire, puis faire croître les cellules sous agitation à 30 degrés Celsius pendant cinq heures. Après cinq heures écoulées, transférer les cultures dans des bouteilles de centrifugation de 500 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation.

Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez 30 millilitres de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases et resuspendez le culot cellulaire en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Ensuite, soniquez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 20 secondes. À l’aide d’un homogénéisateur ultrasonique réglé sur un cycle de travail de 50 %, laissez refroidir les cellules sur de la glace pendant 30 secondes.

Ensuite, répétez les étapes de sonication et de refroidissement deux fois supplémentaires. Maintenez la suspension sur de la glace. Ajoutez un millilitre d'une solution de deux milligrammes par millilitre.

ADN : une étape intermédiaire consiste à agiter doucement le lysat cellulaire à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Une fois les deux heures écoulées, ajuster la concentration finale en sel à 500 millimolaire en ajoutant quatre millilitres de chlorure de sodium à cinq molaire à 36 millilitres de lysat.

Ensuite, pour éliminer les débris cellulaires, centrifuger à 10 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférer le surnageant dans un tube propre. À ce stade, un aliquot de 20 microlitres peut être utilisé pour contrôler l'efficacité de la lyse par sonication.

Sur un gel SDS-PAGE. Ensuite, le lysat cellulaire est passé sur une colonne d'amylose. Pour purifier la protéine de fusion MVP-MGM101, commencez par ajouter 1,5 millilitre d'une suspension à 50 % de résine AMLO dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, pour l'équilibrer, ajoutez 13 millilitres de tampon de lyse et centrifugez à 2000 ×g pendant cinq minutes. Répétez ce lavage quatre fois supplémentaires, puis reprenez la résine dans 0,75 millilitre de tampon de lyse. Ajoutez l'émulsion d'AMLO équilibrée au lysat cellulaire et agitez doucement à 4 degrés Celsius toute la nuit.

Le lendemain, chargez une colonne de chromatographie à l’aide d’une colonne Econo installée dans une chambre froide avec le mélange de lyzat et de résine amylose. Ouvrez le robinet afin de laisser les protéines non liées passer dans un tube de collecte par filtration gravitationnelle. Ensuite, lavez la résine AMLO en ajoutant 300 millilitres de tampon de lavage un.

Une fois qu’il est passé, répétez la lavage avec 150 millilitres de tampon de lavage deux. Après avoir ajouté le tampon Ellucian et collecté l’EIT comme décrit dans le protocole écrit, déterminez le rendement et la pureté de M-V-P-M-G-M 1 0 1 en chargeant un aliquot de l’EIT sur un gel SDS-PAGE.

Après la migration du gel, réaliser une coloration de Kumasi : une seule bande principale d’environ 70 kilodaltons devrait être visible. Ajouter 50 unités de protéase de précision aux EITs M-V-P-M-G-M 1 0 1 et placer dans un tube de dialyse contenant du tampon de dialyse. Laisser la coupure se produire toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Exécuter un gel SDS-PAGE comme précédemment. Pour évaluer l'efficacité du clivage, un clivage complet doit produire deux bandes de 42 et 28 kilodaltons, correspondant respectivement à MVP et MGM 1 0 1. Charger le MVP MGM 1 0 1 clivé par injections multiples sur une cartouche Bio Scale Mini Macro Prep High S reliée à un système FPLC BioRad Biologic DUO Flow.

Commencez la chromatographie d'échange cationique en appliquant un gradient salin par paliers de cinq millimolaires, 300 millimolaires, 500 millimolaires, 750 millimolaires et 1000 millimolaires de chlorure de sodium. Ce gradient est obtenu en mélangeant le tampon A et le tampon B. Réglez le débit à 0,5 millilitre par minute. Récupérez des fractions de deux millilitres dans un collecteur de fractions ; typiquement, le MGM 1 0 1 élué à 500 millimolaires de sel.

Combiner les fractions correspondant au pic MGM 1 0 1 et vérifier la pureté de la protéine sur un gel SDS-PAGE. Le pic MGM 1 0 1 doit présenter une seule bande d’environ 28 kilodaltons après regroupement des fractions protéiques issues de la chromatographie d’échange cationique, suivie d’une dialyse de la protéine dans le tampon d’équilibrage pour la chromatographie d’exclusion stérique, effectuée à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, transférer la protéine vers une colonne de filtration ultra-rapide AVEA Spin 15 R et centrifuger à 3000 ×g à quatre degrés Celsius pour concentrer la protéine.

Une fois le volume réduit à environ un millilitre, charger le MGM 1 0 1 sur une colonne de type supra six prep grade calibrée équivalente, préalablement équilibrée avec le tampon de chromatographie, puis démarrer la séparation par exclusion stérique en utilisant le tampon de chromatographie à un débit de 0,5 millilitre par minute. Les protéines oligomériques de grande taille éluent dans les premières fractions, tandis que les protéines de petite taille éluent dans les dernières fractions. Les anneaux de MGM 1 0 1 éluent à environ 400 kilodaltons.

Recueillir les fractions des pics purifiés de MGM 1 0 1 à l’aide d’un collecteur de fractions, puis déposer des aliquotes des fractions sur un gel SDS-PAGE à 12 % afin de vérifier la qualité finale de la protéine. Ensuite, concentrer la protéine à l’aide d’Aveva. Faire une centrifugation six fois à 3000 ×g à quatre degrés Celsius.

Ensuite, congeler rapidement les aliquotes de protéines dans des tubes de microcentrifugeuse en les immergeant dans de l'azote liquide pendant deux minutes. Conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius pendant six à douze mois. Utiliser les échantillons MGM 1 0 1 pour le test de liaison à l'ADN simple brin et pour la visualisation structurale par microscopie électronique en transmission.

Les résultats de l'essai de migration en gel montrent que le MGM 1 0 1 purifié possède une activité de liaison forte à l'ADN simple brin. La sonde d'ADN simple brin est de plus en plus retenue dans les puits d'un gel natif de polyacrylamide par le MGM 1 0 1 oligomérique.

Lorsque le M GM 1 0 1 est ajouté à une concentration supérieure à 400 nanomoles, ces micrographies électroniques montrent l'organisation structurale de haut niveau du MGM 1 0 1. Le M GM 1 0 1 fraîchement préparé existe sous forme d'anneaux distincts d'un diamètre de 20 nanomètres, que l'on peut révéler par microscopie en transmission avec coloration négative.

Après plusieurs semaines de stockage à quatre degrés Celsius, MGM 1 0 1 forme des filaments supramoléculaires hélicoïdaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine.

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