Name: 4D imagerie multimodalité des Citrobacter rodentium Infections chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez l'imagerie multimodale 4D pour étudier la colonisation bactérienne chez la souris avec Citrobacter rodentium bioluminescent. Cette méthode combine tomographie optique et micro-CT pour visualiser le cycle infectieux en temps réel.

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L&#39;installation dans d&#39;imagerie in vivo à l&#39;Imperial College a été financé par la MRC.

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

Production et le libre accès à cet article est parrainé par PerkinElmer. Les auteurs Kevin P, Francis, Jeff Meganck et Chaincy Kuo sont des employés de Caliper-Une société PerkinElmer. Tous les expérimentations animales ont été effectuées en conformité avec la loi de 1986 animaux de procédures scientifiques et ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local.

Le film 4D d&#39;une infection bactérienne constitue un outil utile pour visualiser et interpréter de grandes quantités de données d&#39;imagerie multi-modalité rapidement et facilement. Cette technique facilite l&#39;analyse détaillée de la façon dont l&#39;infection se propage par une souris individuelle et peut être utilisée pour étudier comment la suppression de l&#39;hôte ou des gènes bactériens ou particulier stratégies d&#39;intervention effet de la charge bactérienne, la distribution et la localisation au cours d&#39;une étude longitudinale 7. Ces vidéos fournissent également des outils pédagogiques utiles et un moyen de diffuser l&#39;information au public. Il ya plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui pourraient affecter la qualité des données obtenues par imagerie DLIT-μCT et la possibilité de compiler une vidéo 4D d&#39;infection. La partie la plus importante de ce protocole est l&#39;infection réussie et homogène de souris avec C. rodentium. Il est essentiel que les souris utilisées pour l&#39;étude sont entre 18-20 g et que la bactéinoculums rial sont fraîchement préparés et environ 5 x 10 9 UFC, comme décrit précédemment 2,3. Avant d&#39;infection des souris, il est important de vérifier que l&#39;inoculum est bioluminescence utilisant le spectre CT et une fois l&#39;inoculum a été préparé, il doit sans cesse être homogénéisé avant chaque souris est par gavage afin de s&#39;assurer que les souris reçoivent des doses infectieuses similaires. L&#39;imagerie DLIT-μCT de souris a été optimisé de sorte que la fonction d&#39;exposition automatique dans le logiciel 4.3.1 image vivante détermine automatiquement les paramètres d&#39;imagerie optimisés pour que le signal soit bien au-dessus du bruit. Cependant, la fonction d&#39;exposition automatique s&#39;appuie sur les paramètres et les paramètres définis par l&#39;utilisateur qui doivent être modifiés comme décrit dans la procédure. Sinon, cela se traduira par des images pauvres avec un faible nombre de photons collectés qui ne donne pas lieu à une progression évidente dans l&#39;infection, comme les réglages d&#39;usine du spectre CT pour l&#39;exposition automatique sont programmés pour l&#39;imagerie des tumeurs exprimantluciférase de luciole. Reconstructions effectuées à l&#39;aide de 560 à 620 nm donnent le meilleur accord entre les données simulées et mesurées et, par conséquent, les données plus fiables à inclure dans la reconstruction. Une limitation de l&#39;utilisation de DLIT-μCT est que le rayonnement ionisant à partir de l&#39;analyse μCT provoque des dégâts d&#39;irradiation sublétale qui est cumulative au cours d&#39;une étude longitudinale 18. L&#39;exposition aux radiations sub-létaux peut affaiblir la réponse immunitaire, provoquer des lésions de l&#39;ADN et l&#39;apoptose dans les organes internes 19. En fin de compte, dégâts d&#39;irradiation sub-létale cumulatif peut entraîner la mort si le LD 50/30 pour les rayonnements ionisants est dépassé, ce qui est entre 5 et 7 Gy en fonction de la souche de souris et de l&#39;âge des souris utilisé 18,20,21. Bien que certains des dommages moléculaires des rayonnements ionisants peut guérir, puisque le principe fondamental est d&#39;estimer la dose prudente, ce n&#39;est généralement pas pris en compte dans la planification de l&#39;étude. Au lieu de cela, l&#39;objectif est de rester le plus belux de ces limites que possible tout en réalisant les objectifs de l&#39;étude. Ceci est particulièrement important dans cette étude en raison de la réponse immunitaire normale à l&#39;infection, la fréquence de l&#39;imagerie, et le fait que transgénique, immuno-composé, ou fortement animaux infectés peuvent être plus sensibles aux rayonnements ionisants. Lors de la planification de l&#39;expérience pour produire un film 4D d&#39;infection, il est important de considérer la durée de l&#39;expérience, le nombre de μCT analyse requis au cours de cette période et la LD 50/30 pour les rayonnements ionisants pour la souche de souris utilisée. Une autre limite potentielle à DLIT-μCT est la force de l&#39;expression de journaliste au sein de la souche bactérienne utilisée, car cela aura une incidence sur les limites de détection bactérienne et heures d&#39;imagerie. Il est fortement recommandé que les chercheurs utilisent validés souches bactériennes qui sont très virulents, mais optimisée pour lux expression de l&#39;opéron maximal, comme l&#39;a montré précédemment pour BLI2,3. Une mise en garde à la conception actuelle de l&#39;imagerie 4D est que chaque film est composé de scans DLIT-μCT individuels qui ont différente échelle photon. Cela peut rendre les images difficiles à interpréter si les modifications apportées à la localisation de la BL foyers, ou son intensité sont subtiles, ou si il ya un accent BL intense entouré de multiples foyers faible. Par conséquent, pour les visualisations longitudinales, il est important de garder les barres de couleur uniforme dans les points dans le temps. Le concept d&#39;un film 4D d&#39;infection peut être appliquée à n&#39;importe quel agent pathogène bactérien convenablement étiqueté. Le développement futur de cette technique vise à utiliser l&#39;imagerie par fluorescence tomography (EIPC) ainsi que DLIT pour faciliter l&#39;enquête de réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection en utilisant une combinaison d&#39;agents pathogènes bactériens bioluminescentes et injectables fluorescentes près de sondes infrarouges pour enquêter sur les réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection. En plus de cela, dans ce protocole, nous nedécrire l&#39;utilisation de bactéries bioluminescentes pour créer des films 4D d&#39;infection. Toutefois, dans certains cas, il peut être nécessaire d&#39;utiliser des bactéries marquées par fluorescence, par exemple étiquetés avec IRFP, de sorte que le journaliste de bioluminescence peut être utilisé pour l&#39;étude génétique de l&#39;hôte lors de l&#39;infection. Surtout, l&#39;utilisation de l&#39;imagerie multi-modalité combinant DLIT / FLIT-μCT va nous permettre d&#39;enquêter de manière non invasive des paramètres multiples au cours d&#39;une infection bactérienne, ce qui contribuera de manière significative à la réduction, raffinement, et le remplacement de l&#39;utilisation des animaux dans la recherche scientifique comme indiqué dans l&#39;initiative de la NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Les petits modèles animaux, en particulier ceux des souris en utilisant, sont couramment utilisées pour étudier la pathogenèse bactérienne ou pour tester des stratégies d&#39;intervention pour les infections, comme les antibiotiques, les probiotiques, les prébiotiques et les vaccins 1-7. Les principales lectures expérimentales de petites infections d&#39;origine animale sont la charge de pathogènes, la localisation spatiale et temporelle de l&#39;infection, et les changements de la réponse immunitaire de l&#39;organisme infecté. Imagerie optique in vivo est un outil précieux pour la recherche sur les maladies infectieuses et peuvent être utilisés pour surveiller multiple lectures expérimentales grâce à l&#39;utilisation de gènes rapporteurs (protéines fluorescentes, la luciférase, la bêta-lactamase, etc), des colorants fluorescents, des nanoparticules ou des sondes chimiluminescentes cible à une protéine, un processus biologique, ou d&#39;un microorganisme 6. l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) est une modalité d&#39;imagerie optique utilisé pour surveiller la colonisation de petits animaux comme les souris et les rats, par les bac pathogèneria 3,6,8,9. Les souris sont infectées par des bactéries recombinantes exprimant une luciférase, comme l&#39;opéron lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Ces bactéries peuvent alors être détectés par leur production de lumière à l&#39;aide d&#39;un capteur CCD sur la base dans le système d&#39;imagerie in vivo 3,6,9. Surtout, seuls les micro-organismes sont métaboliquement actifs bioluminescence (BL), ce qui signifie que des cellules bactériennes viables sont détectés par cette méthode 10,11. Utilisation 2D BLI, l&#39;emplacement de la source BL est déduit à partir de la surface de l&#39;animal, où le signal est émis 8. La localisation anatomique exacte de la BL foyers in vivo doit être déterminée par l&#39;analyse ex vivo des organes 3,6,9 En revanche, composite 3D diffuse la lumière d&#39;imagerie de tomographie (DLIT) peut être utilisée pour compiler une reconstruction 3D quantitative de la BL source 12. DLIT est effectuée par la collecte des images prises à l&#39;aide BL-filtres optiques passe-bande étroits définis etensuite les entrer dans une tomographie optique 3D algorithme de reconstruction diffuse 1,7,12,13. Actuellement, l&#39;imagerie multi-modalité est la seule méthode disponible pour obtenir la vraie localisation anatomique non-invasive de foyers bioluminescence in vivo sans la nécessité d&#39;une analyse ex vivo. Récemment, nous avons utilisé une combinaison de DLIT co-enregistré avec l&#39;imagerie μCT pour évaluer Citrobacter rodentium (C. rodentium) Les dynamique de colonisation après le traitement prophylactique par une bactérie probiotique 7. C. rodentium est un agent pathogène entérique spécifique murin utilisé pour modéliser l&#39;infection humaine par entéropathogènes et enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infection rodentium provoque la colite, généralement associée à une légère perte de poids, diarrhée, polarisée réponse immunitaire Th1 et les altérations pathologiques distincts, y compris l&#39;hyperplasie des cryptes du côlon et attachant et effaçant lésion formatile 14. En plus de cela, C. pathogenèse de rodentium a été soigneusement étudiée par BLI et de sa dynamique de colonisation chez les souris C57BL/6J sont bien documentés, faisant de cette bactérie un modèle de micro-organisme idéal pour une utilisation avec la multi-modalité d&#39;imagerie 3,4,7. Ce protocole est le premier à décrire une méthodologie pour l&#39;imagerie DLIT-μCT intégrée d&#39;une infection bactérienne à l&#39;aide d&#39;une seule plate-forme multimodale d&#39;imagerie, le SIIV Spectrum CT, et la génération d&#39;un film 4D montrant la véritable dynamique de cette infection non invasive.

<table><tbody><tr><td>Bioluminescent C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td></td><td>Le temps optimal d’épilation est de 7 min. L’épilation fonctionne mieux si la crème est bien frottée.</td></tr><tr><td>Isofluorane (100 % v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouteille d’oxygène médical</td><td>BOC Medical</td><td></td><td>de taille F. <fort>Remarque : </fort> un régulateur approprié est requis.</td></tr><tr><td>Luria Bertani bouillon</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g dans 1L Eau déminéralisée.</td></tr><tr><td>Gélose Luria Bertani</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g dans 1L Eau déminéralisée.</td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques en polypropylène Falcon</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Universels</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Aiguille de dosage oral (16G x 75 mm) incurvée</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microbanques (Cryoflan)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr>Étrier <td>IVIS Spectrum CT</td><td>- une société PerkinElmer</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td><td>² ;</td></tr><tr>Étrier <td>d’onduleur 6kVA</td><td>- une société</td><td></td><td></td> PerkinElmer</tr><tr><td>Système d’anesthésie XGI-8</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td>118918</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>XAF-8 Filtre d’anesthésie à charbon de bois</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Living Image v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Incubateur à secousses de paillasse</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d imagerie multimodalité des<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; infections chez les souris

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à suivre longitudinalement une infection bactérienne bioluminescence utilisant la lumière composite tomographie d&#39;imagerie diffuse 3D avec μCT intégré (DLIT-μCT) et l&#39;utilisation ultérieure de ces données pour générer une dimensions (4D) film du cycle d&#39;infection quatre. Pour développer les films d&#39;infection 4D et de valider l&#39;imagerie DLIT-μCT pour des études d&#39;infection bactérienne à l&#39;aide d&#39;un spectre CT SIIV, nous avons utilisé l&#39;infection par bioluminescence C. rodentium, ce qui provoque l&#39;auto-limitation de la colite chez la souris. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;infection de souris avec bioluminescente C. rodentium et la surveillance non invasive de la colonisation par le quotidien imagerie DLIT-μCT et le dénombrement des bactéries dans les excréments pendant 8 jours. L&#39;utilisation du spectre SIIV CT facilite la co-registration transparente des balayages optiques et μCT en utilisant une seule plate-forme d&#39;imagerie. Le μCT modalité à faible dose permet l&#39;imagerie de sourisà plusieurs moments au cours de l&#39;infection, en fournissant la localisation anatomique détaillée de foyers bactérien de bioluminescence en 3D sans causer d&#39;effets secondaires du rayonnement cumulatif. Surtout, les films 4D de souris infectées constituent un outil analytique puissant pour surveiller la dynamique de colonisation bactérienne in vivo.

L&#39;infection des souris C57BL/6J avec 5 x 10 9 UFC C. rodentium est un modèle d&#39;infection bactérienne bien décrit et se traduit par une infection auto-limitation gastro qui culmine entre 6-8 jours après l&#39;infection et dure entre 3 à 4 semaines 2,14. L&#39;infection est confinée à la lumière intestinale par le système immunitaire murin et en conséquence, les bactéries sont continuellement versé dans les fèces. La colonisation de la souris par C. rodentium peut être contrôlée de manière non invasive par énumération bactérienne directe à partir des fèces, ou l&#39;imagerie par bioluminescence 2,3. Ce manuscrit décrit un protocole optimisé pour effectuer 3D et 4D multimodalité imagerie C. rodentium au sein souris pour contrôler la charge bactérienne et la localisation au cours de l&#39;infection. Les résultats présentés dans la figure 1 montrent les contrôles qui sont nécessaires pour l&#39;imagerie 4D succès. Avant l&#39;infection des souris, il est essentiel pour dissuadermine qui l&#39;inoculum bactérien est utilisé bioluminescente (figure 1A) et que, suite à l&#39;gavage d&#39;une souris avec bioluminescente C. rodentium, que le signal peut être observé dans l&#39;estomac de l&#39;animal, et non pas dans les poumons (figure 1B) 16. En plus de surveiller la colonisation bactérienne utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence, c&#39;est une bonne pratique de quantifier le nombre de bactéries dans les selles, qui est utilisé comme une mesure indirecte de la colonisation bactérienne de la muqueuse gastro-intestinale La figure 2 montre la charge bactérienne typique dans les selles prélevé sur 8 C57BL6 / J. souris qui ont été infectées par le ~ 5 x 10 9 UFC ICC180 et suivies pendant 8 jours pi colonisation augmente de jour 2 PI jusqu&#39;au jour 6-7 où les pics d&#39;infection à ~ 5 x 10 10 UFC / g, qui est en ligne avec les rapports précédents 2,3,17. Pour souligner l&#39;importance de l&#39;évaluationTing la propagation de l&#39;infection en une seule souris, les figures 1b et 3 ainsi que la vidéo 1 a été généré à partir de la même souris après C. infection rodentium, comme décrit ci-dessus. Daily DLIT-μCT a été utilisé pour évaluer la répartition spatiale des bactéries bioluminescentes dans ce souris, en utilisant le squelette comme une référence anatomique. Figure 3 montre la reconstruction DLIT-μCT d&#39;une souris C57BL/6J infectés par ICC180 à 3 fois les points clé PI A Jour 3 PI petite bioluminescente foyers peut être observée dans le côlon, qui présentent une augmentation modérée de l&#39;intensité de la bioluminescence par jour 5 PI avec peu de changement dans la distribution spatiale. Au jour 7 PI, nous avons observé une augmentation significative de la bioluminescence et la bioluminescence foyers propagation à travers l&#39;ensemble du côlon. Vidéo 1 est une compilation des reconstructions 3D DLIT-μCT de jours 1-8 PI avec ICC180 et illustre C.rodentium dans le tractus gastro-intestinal proximal entre les jours 1-2 PI qui se répand dans le côlon au jour 3 PI De 4-6 jours PI le nombre de bactéries dans le côlon étendre jusqu&#39;à un pic au jour 7 PI où les foyers bactérienne couvre la totalité du côlon. Au jour 8 PI que deux foyers bactériens distinctes sont présentes dans le côlon proximal et distal. La possibilité de consulter la reconstruction 3D complète à chaque point de temps dans l&#39;ordre chronologique représente un outil puissant pour analyser les interactions pathogènes de l&#39;hôte et est plus facile à interpréter que d&#39;une 3D toujours du même ensemble de données. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figure 1. D&#39;imagerie par bioluminescence 2D A) bioluminescentes C. rodentium ICC180 inoculum et B) d&#39;une souris après gavage avec 200 pi de l&#39;inoculum. Arrowhead (&gt;) illustre bioluminescente C. rodentium </<html> em&gt; dans l&#39;estomac. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figure 2. C. rodentium dynamique de colonisation. Quantification de C. colonie de rodentium unités formant des selles pendant 8 jours PI <img alt="Figure 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figure 3. Diffuse la lumière imagerie tomographique μCT scan de bioluminescence C. infection rodentium d&#39;une souris contrôlée au jour 3, 5 et 7 PI Arrowhead (&gt;) illustre la colonisation du côlon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Vidéo 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir la vidéo. film 4D de l&#39;infection à C. rodentium d&#39;une souris contrôlée à partir de 1-8 jours PI

Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l&#39;étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l&#39;infection de souris avec bioluminescentes<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Et le suivi longitudinal de la colonisation bactérienne en utilisant composite diffuse la lumière tomographie d&#39;imagerie 3D avec l&#39;imagerie μCT pour créer un film 4D<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infection.

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

L'objectif général de cette procédure est de suivre le cycle d'infection à zéro DUM à l'aide d'une tomographie d'imagerie par lumière diffuse composite associée à une micro-TDM afin de créer un film en quatre dimensions de l'infection. Cela est réalisé en préparant d'abord un inoculum bactérien bioluminescent. La deuxième étape de la procédure consiste à infecter des souris par gavage oral avec zéro dunum.Les souris infectées sont ensuite imagées quotidiennement à l’aide d’un micro-CT en lumière D, et les étapes finales consistent à reconstruire les données micro-CT 3D du DLI et à les compiler en un film en quatre dimensions du cycle d’infection. En définitive, les résultats peuvent montrer l’évolution de la distribution et de la localisation de la charge bactérienne grâce à l’imagerie multimodale en quatre dimensions chez les souris infectées. Dr. James Collins.Un post-doctorant de mon laboratoire démontrera la procédure aujourd'hui. En fin d'après-midi, la veille de l'infection, sortez un tube cryogénique de la souche Zymo strain IC 180 et laissez-le décongeler ; dès qu'il est décongelé, ajoutez un granulé cryogénique de bactéries à 15 millilitres de LB contenant de la canamycine, puis laissez la culture croître toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation à 220 tr/min. Le lendemain matin, cultivez également 15 millilitres de LB non inoculé afin de contrôler une éventuelle contamination du milieu.Si le témoin inoculé avec l'UN n'est pas trouble, transférer la culture inoculée dans un tube de 50 millilitres et centrifuger à 4 000 tr/min pendant 10 minutes. À quatre degrés Celsius, reprendre le culot dans un volume de PBS et répéter la centrifugation. Ensuite, resuspendre soigneusement les cellules dans 1,5 millilitre de PBS afin de préparer l'inoculum bactérien. Pour vérifier que la culture ICC 180 est bioluminescente et estimer le nombre de bactéries, imager la culture dans le système IVIS Spectrum CT en utilisant l'imagerie bioluminescente avec filtre ouvert, et appliquer le réglage automatique du logiciel Living Image, version 4.3 0.1.Ceci est décrit en détail dans une vidéo précédemment publiée. Afin de démontrer l'infection de souris avec un rongeur bioluminescent, nous infecterons une souris et utiliserons une autre souris pour une infection factice au PBS. Avant de réaliser l'infection, anesthésiez la souris avec 3 % d'isoflurane à l'aide d'un système d'anesthésie XGI huit pour assurer une contention humane pendant que l'anesthésie agit complètement.Mélangez l'inoculum bactérien et aspirez un nombre connu de bactéries en 0,2 millilitre dans une seringue pour gavage oral. Saisissez maintenant la première souris à infecter en la tenant fermement par la nuque. Veuillez noter que les souris ont été épilées avant l'imagerie à l'aide d'une crème dépilatoire, comme décrit dans l'article, poussez l'aiguille vers le palais par-dessus la langue et vers le bas de l'œsophage, puis injectez l'inoculum bactérien dans l'estomac.S'il y a une résistance, ne forcez pas l'aiguille car cela risquerait d'injecter l'inoculum dans les poumons ; réinsérez délicatement l'aiguille. Par la suite, si la souris présente des difficultés respiratoires ou motrices, elle doit être euthanasiée en cas d'infection factice. Effectuez une gavage oral avec 0,2 millilitre de PBS afin de confirmer que le gavage a été correctement réalisé.Imager les souris en spectre IVUS CT à l'aide d'une imagerie bioluminescente avec filtre ouvert et utiliser le réglage automatique dans l'interface Living Image. L'assistant d'imagerie 4.3 0,1, tel que décrit précédemment, le Delight micro-CT intègre une imagerie optique associée à un scanner micro-CT à faible dose de rayonnement. Étant donné que la dose s'accumule chez les animaux au cours de chaque séance d'imagerie, nous cherchons à maintenir la dose aussi basse que raisonnablement possible.En raison de ces préoccupations, les souris doivent être sacrifiées au premier signe de symptômes néfastes ou à la fin de la période d'imagerie par micro-TDM. Pour cette étude, optimisez les paramètres de la fonction d'exposition automatique dans Living Image 4.3 0.1 pour l'imagerie de la luciférase bactérienne in vivo. Sélectionnez d'abord « Éditer », puis « Préférences », ensuite « Acquisition » et enfin la fenêtre « Exposition automatique ».Ensuite, sélectionnez les valeurs de plage suivies par la durée de l'expérience en secondes et réglez le maximum à 300 secondes. Enfin, sélectionnez le nombre cible minimal suivi de la luminescence et réglez cette valeur à 10 000 impulsions. Une fois que le système a été initialisé, que l'anesthésie a été mise en place et que les dispositifs de sécurité des rayons X ont été vérifiés.Procédez à l'anesthésie d'une souris. Utilisez un système d'anesthésie XGI eight avec un débit d'oxygène de deux litres par minute et 3 % d'isoflurane. Une fois la souris prête pour l'imagerie, ouvrez l'assistant d'imagerie dans le logiciel.Cet outil optimise automatiquement plusieurs paramètres afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible pour chaque filtre d'émission sélectionné. Lorsque l'assistant d'imagerie y invite, incluez les filtres d'émission de cinq cent soixante-cinq, quatre-vingts, six cents et six cent vingt nanomètres. Ensuite, assurez-vous que le scan micro-CT de la souris est sélectionné, puis cliquez sur acquérir pour démarrer l'imagerie.Après avoir replacé la souris anesthésiée dans sa cage, retirez la plateforme d'imagerie pour une souris du CT Spectrum et désinfectez la plateforme pour animal à l'aide de Tri-Gene à 1 %. Remarque. Si la plateforme pour animal est fortement souillée, le coussin en mousse peut être remplacé. Poursuivez l'imagerie des souris quotidiennement jusqu'à huit jours après l'infection afin de générer des données d'imagerie longitudinales.Des périodes d'essai plus longues augmentent la probabilité d'artéfacts dus à l'exposition cumulative au rayonnement. Pour produire des reconstructions de micro-tomodensitométrie à double détection (DD) de haute qualité et reproductibles, plusieurs étapes sont nécessaires. Tout d'abord, ouvrez le logiciel Living Image, version 4.3 0.1, puis sélectionnez Parcourir dans la fenêtre de navigation.Ouvrez le dossier contenant les fichiers micro-CT DLI en cliquant sur charger. Ouvrez le fichier micro-CT DLI dans le navigateur d'images vivantes. Par exemple, consultez deum jour sept après l'infection.Dans la palette d'outils, sélectionnez la topographie de surface, puis la souris nue. Ajustez le seuil, puis cliquez sur Générer la surface. Si la reconstruction de surface réussit, un contour de surface s'affichera dans la fenêtre de vue 3D.Pour visualiser la micro-tomodensitométrie rendue dans la fenêtre de vue 3D, masquez le contour de surface ou diminuez l'opacité de la surface. Les deux options s'obtiennent en sélectionnant d'abord les outils optiques 3D. Ensuite, désactivez l'affichage de l'objet de surface ou réglez la barre de glissement d'opacité afin d'obtenir une localisation anatomique détaillée de la reconstruction lumineuse des trois DD.Par rapport au squelette de l'animal, modifiez les données volumétriques 3D. Pour visualiser le squelette avec un contraste optimal, cliquez sur les outils multimodaux 3D et déplacez le curseur de l'histogramme vers la droite jusqu'à ce que seuls les os soient clairement visibles. Ensuite, si ce n'est pas déjà fait, cliquez sur l'histogramme logarithmique, inversez le dégradé de couleur, la qualité d'éclairage et appliquez la suppression du bruit.Si désiré, recadrer l'image afin de supprimer toute structure indésirable de la reconstruction 3D depuis la palette d'outils, sélectionner la reconstruction 3D D light. S'assurer que seuls les filtres de cinq cent soixante-cinq, quatre-vingt-six cents et six cent vingt nanomètres sont sélectionnés. Ensuite, cliquer sur démarrer.Ceci ouvre la fenêtre d'aperçu des données avec les signaux de bioluminescence filtrés spectralement provenant de la souris imagée en 2D. Ces signaux sont automatiquement seuillés par le logiciel, mais peuvent être ajustés manuellement si nécessaire, à l'aide des onglets situés en bas du menu. Le seuil détermine l'intensité minimale des données qui seront incluses comme données dans la reconstruction.Ensuite, dans la palette d'outils, sélectionnez la reconstruction 3D micro-TDM D light et vérifiez les propriétés optiques. En cliquant sur l'onglet propriétés, les propriétés du tissu doivent être réglées sur tissu de souris et le spectre de la source sur bactéries. Cliquez maintenant sur reconstruire pour effectuer la reconstruction D light.L'emplacement réel du signal lumineux D, entouré en rouge, se situe dans le bassin pelvien. Cette localisation est plus facile à interpréter lorsque l'image tourne pendant le film. Pour générer le film 3D micro-TDM de l'IDL, accédez au menu outils et sélectionnez Animations prédéfinies en 3D, axe dans le sens antihoraire, puis durée totale.Fixez cette valeur à 10 secondes ou 25 images par seconde. Une fois les paramètres de l'animation 3D correctement configurés, appuyez sur l'enregistrement et enregistrez les reconstructions 3D micro-TDM DLI sous forme de fichiers VI. Il est essentiel de réaliser ces reconstructions à l'aide de paramètres identiques afin qu'elles soient comparables.Il est également important de réaliser les vidéos avec le même nombre d’images par seconde et la même durée totale. Sinon, le chronométrage des 40 vidéos n’est pas homogène. Sur l’ordinateur, ouvrez Windows Live Movie Maker et créez un nouveau fichier.Insérez les reconstructions micro-CT DLI par ordre chronologique à partir du premier jour suivant l'infection. À l'aide de l'onglet outils, ajoutez des légendes au début de chaque vidéo en sélectionnant la vidéo, puis l'onglet accueil, puis en choisissant d'ajouter une légende. Le texte de la légende peut être mis en forme à l'aide de la barre d'outils, et l'emplacement de la légende est également ajustable.Ajoutez maintenant une page de titre en cliquant sur Accueil, puis sur Titre. Saisissez votre titre dans la zone en utilisant la barre d'outils pour formater le texte. Ensuite, enregistrez le projet sous forme de fichier MMP.Ceci est essentiel si vous souhaitez modifier le film. Enfin, enregistrez le film au format WMV depuis le menu du créateur de films, sélectionnez « Enregistrer le film », puis choisissez l'option quatre. Les commandes informatiques sont essentielles pour une bonne technique. Avant d'infecter les souris, l'inoculum bactérien utilisé a été déterminé comme étant bioluminescent.Après la gavage oral avec la tige bioluminescente pour rongeur, on a vérifié si le signal pouvait être observé dans l'estomac de l'animal, illustré par une flèche blanche, et absent des poumons. La même souris sera présentée dans les exemples suivants d'une infection individuelle. Zero denture est un agent pathogène extracellulaire confiné à la lumière intestinale pendant l'infection démontrée.Il est donc éliminé dans les selles, qui ont été analysées afin de montrer que la colonisation augmente du deuxième au sixième ou septième jour, lorsque l'infection atteint son pic quotidien. Une micro-tomodensitométrie en lumière D a été utilisée pour évaluer la répartition spatiale des bactéries bioluminescentes chez cette souris, le squelette servant de référence anatomique. Au troisième jour post-infection, de petits foyers bioluminescents ont été observés dans le côlon, illustrés par une flèche bleue.Ces foyers ont présenté une augmentation modérée de l'intensité de la bioluminescence au cinquième jour suivant l'infection, avec peu de changement dans la distribution spatiale au septième jour suivant l'infection ; à ce moment, on observe une augmentation significative de la bioluminescence et une dissémination des foyers bioluminescents à travers tout le côlon. Trois reconstructions micro-CT en lumière DD, réalisées entre le premier et le huitième jour suivant l'infection, illustrent la propagation de l'infection par le sérodième. L'infection bactérienne débute sous forme de foyers distincts dans le tube digestif proximal.Vers le troisième jour, l'infection se propage au côlon. Au cours des jours suivants, les foyers d'infection s'étendent davantage, augmentant en taille et en nombre. L'infection atteint son pic le septième jour.Ensuite, au huitième jour, les colonies se sont réduites à deux foyers bactériens distincts dans le côlon proximal et distal. Cette technologie permettra aux chercheurs d'étudier en temps réel les mécanismes de colonisation bactérienne et d'infection, ainsi que d'évaluer l'efficacité des stratégies d'intervention.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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