Name: Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Découvrez la transduction adénovirale pour l'expression ectopique de gènes dans les cellules T CD4 naïves avant la différenciation en cellules Treg. Cette méthode permet une surexpression transitoire élevée sans altérer la viabilité cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier Lirui Du pour la construction du vecteur pCAGAdDU et Oliver Gorka pour la fourniture du protocole de fixation.

1. Clonage d&#39;un gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;entrée <ol><li> Cloner le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;entrée. Amplification par PCR du gène suivie d&#39;une ligature d&#39;extrémités franches dans un vecteur topoisomérase couplé (par exemple pENTR / D-TOPO) ou l&#39;enzyme de restriction à médiation par clonage peut être utilisé pour cette procédure. </li></ol> 2. Transfert du gène d&#39;intérêt dans le pCAGAdDu Vecteur de Destination <ol><li> Transférer le gène d&#39;intérêt à partir du vecteur d&#39;entrée dans le vecteur de destination par recombinaison LR (par exemple la passerelle LR Clonase II Enzyme Mix). Cela va créer le vecteur d&#39;expression adénoviraux (Figure 1). </li><li> Linéariser 10 ug du vecteur d&#39;expression adénoviral dans une digestion de restriction PacI, précipiter l&#39;ADN et remettre en suspension dans l&#39;eau à une concentration de 3 pg par 100 pi. Linéarisation libère les répétitions inversées virales (ITR), qui sont nécessaires pour la réplication et l&#39;encapsidation du vADN IRAL dans des particules virales. </li></ol> 3. Génération du lysat Virus primaire <ol><li> Graine de 1 x 10 5 cellules HEK293A dans deux milieux de culture de cellules ml (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) dans un puits d&#39;une plaque de 6 puits et incuber les cellules pendant 6 à 14 heures à 37 ° C en 10% Incubateur à CO 2 pour leur permettre d&#39;adhérer. Les cellules doivent alors être à la confluence d&#39;environ 50%. </li><li> Lipofection: Transfert 6 pi de réactif jetPEI dans 94 ul de 50 uM NaCl, brièvement vortex. Ajouter la solution mélangée à 100 pi vecteur adénovirus linéarisé en vortex et incuber ce mélange de transfection pendant 15 - 30 min à température ambiante. </li></ol> Effectuez toutes les étapes suivantes dans les conditions appropriées de biosécurité pour l&#39;infection à adénovirus! <ol start="3"><li> Verser goutte à goutte la solution dans la cellule contenant HEK293A bien et incuber les cellules à 37 ° C et 10% de CO 2. Lorsque vous utilisez un marqueur de fluorescence, d&#39;évaluer le transfeefficacité ction visuellement après 12 à 36 h à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence. Ajouter 0,5 ml de milieu frais tous les 3 jours. </li><li> Consultez toutes les 2 - 3 jours avec un microscope optique ou de fluorescence pour effet cytopathogène (CPE), qui sont des zones avec des cellules élargies et arrondies qui commencent à se détacher. Ceci est révélateur de la génération de virus efficace. Lors de l&#39;apparition de zones plus larges du CPE (figure 3), il faudra 24 à 72 h avant de toutes les cellules sont infectées. </li><li> Lorsque toutes les cellules présentent des signes de CPE, mais avant un décollement de l&#39;ensemble des cellules se produit, détacher les cellules par pipetage doux et les cellules de transfert de surnageant (SN, 3-5 ml) dans un tube en polystyrène de 15 ml. </li><li> Geler les cellules de la SN sur glace sèche pendant 15 - 20 min et décongeler rapidement à 37 ° C après la rupture des cellules. Répétez ce gel-dégel et-cycle (F / TC) deux fois plus. Gardez le lysat primaire du virus sur la glace pour une utilisation dans un jour ou le congeler à -80 ° C pour le stockage à long terme. Toute F supplémentaire/ TC permettra de réduire le titre viral de 30 - 50%. </li></ol> 4. amplification du virus <ol><li> Semences et cultiver des cellules HEK293A à 90% de confluence sur un cm boîte de culture 14 tissulaire. </li><li> Infecter les cellules avec la moitié du lysat de virus primaire (1,5 - 2,5 ml) et incuber les cellules pendant au moins 36 h. Presque toutes les cellules devraient être infectés puis, qui peut être déterminé par microscopie à fluorescence. Pour la ré-amplification d&#39;un stock de virus déjà amplifié (soit plus concentré), infecter HEK293A à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 50 (voir 6.3). </li><li> Les cellules doivent être récoltées lorsque tous d&#39;entre eux montrent CPE mais avant détachement. Avec une production efficace du virus cet état est atteint dans les 48 heures après l&#39;infection. (Si cela prend jusqu&#39;à une semaine, envisager un autre cycle d&#39;amplification en augmentant la quantité de stock de l&#39;adénovirus utilisé pour l&#39;infection décrite au point 4.2.) </li><li> Détacher les cellules par pipetage doux et des cellules de transfert et SN pour un tube en polystyrène de 50 ml. Spin cellules vers le bas à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirez le SN et remettre le culot dans un volume approprié de milieu ou SN (environ 1 ml). </li><li> Effectuez 3 F / TC de perturber les cellules et centrifuger à 800 xg pendant 15 min à 4 ° C. Enlevez le SN qui contient les particules de virus (c&#39;est à dire le lysat de virus concentré), et aliquote du lysat de virus de la stocker à -80 ° C. </li></ol> 5. Virus Détermination du titre <ol><li> Seed 10 5 cellules A549 par puits en 5 puits d&#39;une plaque de 12 puits dans 1 ml de milieu et de laisser cellules adhèrent pendant 6 heures. </li><li> Utilisez 1 pl de l&#39;adénovirus concentré (décongelé sur glace) pour effectuer une dilution en série dans le milieu (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) et ajouter 10 ul par puits. Laissez un bien non infecté pour régler le déclenchement en cytométrie en flux. </li><li> Après 36 heures, enlever le SN, lavez avec PBS, les cellules et détachement (par exemple par traitement à la trypsine). Pour les précautions risques biologiques, il est recommandé de fixer caunes de 100 pi paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et lavage avec du PBS seule fois. </li><li> Effectuer une analyse FACS de l&#39;expression du marqueur d&#39;infection. Plot &#39;ul lysat viral appliquée »contre le nombre absolu de cellules infectées (figure 4). Déterminer la plage linéaire de l&#39;infection et de calculer le titre par ml de virus non dilué à partir de la courbe d&#39;étalonnage sur la plage linéaire avec x = 1000 pl. </li></ol> 6. L&#39;infection des cellules T <ol><li> Isoler les cellules T CD4 naïfs / repos de DO11.10 tg; souris Tg CARΔ1 utilisant MACS (T CD4 + naïves cellulaire Isolation Kit II) ou FACS (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-). </li><li> Pour les expériences à petite échelle, une pipette un volume approprié de lysat viral pour atteindre une MOI de 50 dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits à fond rond. </li><li> Ajoutez jusqu&#39;à 4 x 10 5 cellules T dans un volume d&#39;infection final de 50 ul dans un milieu de cellules T (RPMI1640, 10% de FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoéthanol, HEPES 10 mM). Exemple: Une MOI de 50 doivent être utilisés pour infecter 3 x 10 5 cellules T; le titre viral est de 3 x 10 9 ml -1 volume de virus = MOI x T numéro de cellulaire / titre viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml </li></ol> Note: pour une infection du nombre de cellules plus grandes, l&#39;échelle en utilisant une MOI de 50 dans un volume d&#39;infection de 165 pi par 10 6 cellules T naïves dans un tube de polystyrène avec la tasse lâche (jusqu&#39;à tp 3 ml par tube). <ol start="4"><li> Incuber les cellules pendant 90 min à 37 ° C dans 5% d&#39;un incubateur à CO 2. </li><li> Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. </li></ol> (Facultatif: les cellules peuvent être lavées à nouveau pour supprimer le virus plus efficacement) <ol start="6"><li> Remettre les cellulesdans 200 pi de milieu de cellules T sans anticorps stimulant et sans IL-2 ou d&#39;autres cytokines et les reposer pendant 40 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur pour permettre l&#39;expression du gène d&#39;intérêt avant l&#39;activation. </li></ol> 7. Activation des cellules T et de la polarisation <ol><li> Pipette un volume d&#39;anti-CD3 et perles anti-CD28 couplés qui est égal au nombre de cellules (par exemple 4 x 10 5) dans une petite tasse de réactif, ajouter le volume 10 fois de PBS et mettez-les sur un aimant pour 2 min . Enlever le surnageant et remettre en suspension les perles dans 200 pi de milieu polarisant (pour les Tregs: milieu de cellules T + 1 ng / ml TGFß, 100 U / ml d&#39;IL-2). </li></ol> Note: Les cellules peuvent également être activés à l&#39;aide des boîtes de culture de tissu recouvertes d&#39;anticorps anti-CD28 et anti-CD3, ou d&#39;une manière spécifique du récepteur DO11.10 cellules T en utilisant irradiés splénocytes BALB / c pulsées avec de l&#39;ovalbumine 323-339 antigène peptidique. <ol start="2"><li> Centrifuge le reposa cellules comme avant, enlever le SN et remettre les cellules dans 200 ul milieu polarisant contenant des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 anticorps couplés à des perles. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur sans changer de support. </li></ol> 8. T Fixation cellulaire et coloration pour cytométrie en flux <ol><li> Laver les cellules: Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. Effectuez toutes les étapes de lavage suivantes en conséquence. </li><li> Reprendre les cellules dans 100 ul solution fixable de coloration de cellules mortes et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules, remettre en suspension dans 100 pi de PBS, ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% dans du PBS, incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules, les remettre en suspension dans 200 pi glacée 70% de méthanol dans du PBS et incuber pendant 30 min sur la glace. </li></ol> Note: Les cellules peuvent être traités à partir de maintenant sans précaution Biohazard!<ol start="5"><li> Préparer 60 pl mélange-maître de 60 pi de PBS + 10 pg / ml Fc-bloc (anti-FCR3 pour bloquer la liaison non spécifique). Laver les cellules, les remettre en suspension dans 40 pl de PBS + anti-FCR3 et incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 ul de PBS + anti-FCR3 contenant 1 pg d&#39;anticorps anti-Foxp3 PE-couplé, bien mélanger et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver les cellules deux fois dans du PBS et analyser les cellules sur un cytomètre de flux. </li></ol>

<ol><li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li>
<li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li>
<li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li>
<li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Peripheral+CD4%2BCD25-+Naive+T+Cells+to+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+TGF-%CE%B2+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li>
<li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).</li>
<li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+%28TCR%29+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li>
<li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+%28MEA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).</li>
<li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li>
<li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+the+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li>
<li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4(2002).</li>
<li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li>
<li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li>
<li>Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+bic%2FmicroRNA-155+for+Normal+Immune+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%CE%B3+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Génération Virus et titrage Pour obtenir des résultats de transfection optimales, la qualité et la quantité de vecteur linéarisé semblent les plus importants. Nous n&#39;avons pas observé d&#39;effets négatifs sur la production de lysat primaire d&#39;une prolifération initiale de la culture depuis l&#39;infection va procéder rapidement une fois que la production de virus efficace se produit. Cependant, la production de virus par les cellules HEK293A peut être affectée par de longs inserts qui ...

Tregs sont cruciales pour maintenir la tolérance immunitaire et à atténuer la réponse immunitaire de surréaction. Tregs supprimer l&#39;activation des cellules T du spectateur. Par conséquent, l&#39;ablation des Tregs conduit à l&#39;auto-immunité fatal et l&#39;auto-destruction entraînée par les cellules T activées 1. Tregs se développent dans le thymus au cours de sélection négative des CD4 précurseurs mono-positifs, mais ils peuvent aussi faire la différence dans la périphérie de CD4 des lymphocytes T naïfs lors de la stimulation antigénique faible dose optimale avec 1,2 co-stimulation. Thymique Tregs semblent supprimer l&#39;auto-immunité tissu contre des auto-antigènes, alors que périphérique Tregs ont été impliqués dans la fourniture de tolérance dans l&#39;intestin ou du poumon. Ceux-ci induit Tregs puissamment prévenir l&#39;activation des lymphocytes T après la reconnaissance d&#39;antigènes étrangers dans la muqueuse, y compris antigènes environnementaux de la nourriture et de l&#39;air, les bactéries commensales, et les allergènes 3,4. En outre, les Tregs sont essentielles pour établir la tolérance maternelle de peptides fœtales 5 et à prévent la maladie du greffon contre l&#39;hôte 6. Dans le même temps, Tregs également médier les effets indésirables en atténuant la surveillance immunitaire des cellules tumorales 7,8. La fonction caractéristique de Tregs est l&#39;expression de la sous-spécification transcription Foxp3 facteur, un facteur de transcription contenant un domaine fourche tête qui est nécessaire et suffisante pour conférer une fonction 9,10 Treg. Certaines voies de signalisation qui peuvent induire l&#39;expression de Foxp3 sont connus. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent, réguler ou moduler Treg différenciation en réponse au récepteur des cellules T déclenchement sont moins bien compris. Tregs peut être très efficace induite in vitro par la stimulation des cellules T CD4 naïfs avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF et IL-2 11. Comme les Tregs émergents sont fonctionnelles in vivo, la manipulation de molécules qui favorisent la différenciation Treg porte un énorme potentiel pour l&#39;avenir therapies, par exemple, le traitement de l&#39;asthme, la maladie de Crohn et la transplantation 11,12. Inversement, la modulation thérapeutique de molécules afin de bloquer la différenciation Treg peut offrir des avantages dans les futures approches de traitement combiné des patients atteints de tumeurs. Dans les essais de différenciation in vitro ont joué un rôle important pour la description des changements moléculaires qui sont associés avec T différenciation de sous-ensemble de cellules. À l&#39;heure actuelle, les tentatives expérimentales à la recherche ou à l&#39;écran pour les produits de gènes qui contrôlent la différenciation des cellules T sont entravés par le fait que les méthodes les plus courantes de l&#39;expression des gènes extra-utérine ne parviennent pas dans les cellules T naïves. Par exemple, l&#39;électroporation et la transduction rétrovirale ne sont efficaces que dans les cellules T activées. Contrairement aux attentes initiales, la transduction lentivirus, qui est généralement efficace dans les cellules au repos, nécessite de pré-activation des cellules T naïves par des cytokines 13. En outre, le transfert de l&#39;ADNc ou de l&#39;ARNm durant l&#39;électroporationimplique une dépolarisation de la membrane plasmique, qui lui-même confère des caractéristiques de l&#39;activation des cellules T et peut même mobiliser Ca 2 + signalisation et activer des protéines NFAT (observation et ref inédit. 14). De même, pour la transduction rétrovirale, les cellules T naïves doivent être activés pour 18 - 40 h. Pendant ce temps, la répartition de la membrane nucléaire au cours de la division cellulaire se produit et permet l&#39;intégration de la génomique ultérieure du vecteur rétroviral 15. Ces méthodes ne sont donc pas en mesure de répondre à la régulation moléculaire début de la rencontre initiale des lymphocytes T avec l&#39;antigène, qui est la phase décisive de la différenciation des cellules T helper. Transduction adénovirus est connue pour conférer une expression ectopique du gène passagère dans un certain nombre de types de cellules humaines qui expriment le récepteur de l&#39;adénovirus humain Coxsackie (CAR). Il procède sans obligation pour l&#39;activation de la cellule ou de la progression du cycle cellulaire. L&#39;expression de surface de CAR est essentiel pour la fixation du virus efficace et l&#39;intériorisation et l&#39;expression transgénique de la version tronquée CARΔ1 sous un promoteur spécifique des cellules T a été trouvée pour rendre thymocytes de souris et des cellules T sensibles à l&#39;infection par adénovirus 16. Surtout, le transgène ne modifie pas le développement des thymocytes ou la différenciation in vitro des cellules CD4 T naïfs cellules dans différents sous-ensembles (données non présentées; ref 17).. Transduction adénovirus des cellules T a déjà été utilisé pour la surexpression 17,18 et knock-down approches 19,20. Les cellules T transgéniques peuvent être purifiés à partir de commerce DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. et ref 17).. Surtout, transduction adénovirale permet une haute expression d&#39;un gène d&#39;intérêt dans des cellules T naïves sans induire des signes évidents d&#39;activation. Les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) après infectisur et peut être activée et différenciée en Treg similaire aux cellules non infectées. Production d&#39;adénovirus recombinants peut être atteint après transfection de cellules avec des plasmides HEK293A adénoviraux (Figure 1). Ces plasmides contiennent généralement du génome de l&#39;adénovirus humain de type 5 avec les gènes E1 et E3 supprimées pour rendre adénovirus recombinants incompétent pour la réplication 21. Cellules HEK293A complètent carence de réplication tels qu&#39;ils ont été immortalisés par l&#39;intégration stable de l&#39;adénovirus 22 cisaillé. Depuis vecteurs adénoviraux sont grandes (~ 40 kb) et par conséquent pas bien adapté pour l&#39;enzyme de restriction induite par clonage traditionnel, nous avons utilisé le système de passerelle. Le gène d&#39;intérêt est initialement clonée dans un vecteur d&#39;entrée plus petit, à partir de laquelle il peut être facilement transféré dans le vecteur adénoviral de destination par l&#39;intermédiaire de la réaction de recombinaison lambda (LR) 23. Nous avons construit le vecteur pCAGAdDuen associant le promoteur CAG (promoteur de l&#39;actine de poulet et CMV) avec une cassette d&#39;expression contenant des sites LR flanquant le marqueur de sélection ccdB procaryote 24. Cette cassette d&#39;expression est fusionnée à un site d&#39;entrée interne du ribosome (IRES) de l&#39;élément qui permet de co-expression du marqueur renforcée protéine eucaryote de l&#39;infection fluorescente verte (EGFP), qui est fusionné à une séquence contenant l&#39;hormone de croissance bovine poly (A) de signal. Nous avons choisi des séquences cis-régulatrices CAG, puisque le promoteur CMV prototype a été jugée hautement dépendant de l&#39;activation et donc défavorable pour l&#39;expression des gènes dans les cellules T naïves. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;efficacité dans Treg différenciation in vitro et une méthode pour la transduction de CD4 des lymphocytes T naïfs sans activation (figure 2). La méthode permet l&#39;expression des gènes extra-utérine ou abattre CD4 précédents différenciation des cellules T à l&#39;état naïf. Il permet de tester l&#39;effet d&#39;une overexpressegène d &#39;intérêt au cours des événements de signalisation précoces lors de la stimulation initiale TCR jusqu&#39;à engagement de sous-ensemble de cellules T. Nos expériences de validation fournissent également la base pour établir l&#39;application de l&#39;adénovirus similaire dans la différenciation des autres sous-ensembles de cellules T comme Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou des cellules TFH.

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO Kit de clonage</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfection</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Lignée cellulaire</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm Boîte de culture tissulaire</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta ; 1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Modèle nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ Kit d’isolement des lymphocytes T II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Mélange de vitamines essentielles (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads souris T-activateur CD3/CD28 pour l’expansion et l’activation cellulaires</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes bleues fixable</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Souris BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris/Rat Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>Sondes LightCycler 480 Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Transcription</td><td>Transcription Alternative Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

transduction adenoviral de cd4 naïfs cellules t pour étudier la différenciation treg

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Les cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour assurer la tolérance immunitaire à l&#39;auto ainsi que pour certains antigènes étrangers. Tregs peut être généré à partir de cellules T CD4 naïves in vitro avec le TCR et co-stimulation en présence de TGF et de l&#39;IL-2. Cela porte un énorme potentiel pour de futurs traitements, cependant, les molécules et les voies de signalisation que la différenciation de contrôle sont largement inconnues. Les cellules T primaires peuvent être manipulés par l&#39;expression des gènes extra-utérine, mais les méthodes communes parviennent pas à cibler l&#39;état naïf le plus important de la cellule T avant la reconnaissance de l&#39;antigène primaire. Ici, nous fournissons un protocole d&#39;exprimer des gènes extra-utérines en cellules T CD4 naïves in vitro avant d&#39;induire la différenciation Treg. Elle s&#39;applique transduction avec l&#39;adénovirus déficient pour la réplication et explique sa génération et de la production. L&#39;adénovirus peut prendre jusqu&#39;à de grands inserts (jusqu&#39;à 7 ko) et peut être équipé avec les promoteurs pour atteindre la haute et transitoire OVEREXPression dans les cellules T. Il transduit efficacement les lymphocytes T de souris naïves si elles expriment un récepteur de l&#39;adénovirus Coxsackie transgénique (CAR). Surtout, après l&#39;infection, les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) et peuvent être activées et différenciées en Tregs similaires aux cellules non-infectées. Ainsi, cette méthode permet la manipulation de cellules CD4 T différenciation cellulaire depuis ses débuts. Il assure que l&#39;expression des gènes extra-utérine est déjà en place lorsque les événements de signalisation précoces de la stimulation initiale TCR induit des changements cellulaires qui aboutissent dans Treg différenciation.

La production de virus Pour la production de titres élevés de virus, le moment de la récolte des cellules HEK293A dans la production primaire du virus ou d&#39;amplification du virus est cruciale. Représentant images de contraste fluorescents et en phase avec les signes visuels de la production de virus sont présentés dans la figure 3. Le CPE a été observée 10 jours après transfection de cellules HEK293A avec un pCAGAdDu contrôle vectoriel sans insert. CPE sont caractérisés par...

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l&#39;adénovirus Coxsackie permet l&#39;analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices<em&gt; In vitro</em&gt;.

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Ce protocole décrit un flux de travail pour la production de particules adénovirales infectieuses utilisées afin de transduire un gène d'intérêt dans des lymphocytes T naïfs, lesquels expriment de façon atopique le transgène ou se différencient en lymphocytes T régulateurs, ou tregs. Dans un premier temps, le gène d'intérêt est cloné dans le vecteur d'adénovirus destination. Ce vecteur est ensuite transféré dans la lignée cellulaire productrice d'adénovirus, HC 2 93 A, et des particules adénovirales infectieuses sont produites.Les virus obtenus sont utilisés pour infecter des lymphocytes T naïfs provenant de souris transgéniques pour un récepteur d'adénovirus après l'infection. Les cellules sont ensuite mises au repos afin de garantir l'expression du gène d'intérêt. Dans les lymphocytes T naïfs, les cellules sont activées dans des conditions polarisantes afin d'induire la différenciation en lymphocytes T régulateurs (treg).Ensuite, les cellules sont fixées et colorées pour une analyse cytométrique en flux. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'expression du marqueur de différenciation des cellules T régulatrices, Fox P trois, et du marqueur d'infection GFP, qui peuvent être influencés par le gène d'intérêt surexprimé. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transduction génique par rétrovirus, est qu'elle permet la surexpression d'un gène d'intérêt dans des lymphocytes T naïfs.Cela entraîne un haut niveau de surexpression présent au moment de l'activation des lymphocytes T. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lymphocytes T régulateurs. Par exemple, sur la régulation post-transcriptionnelle des gènes qui sous-tend l'établissement de l'identité des cellules T-Rex.Commencez ce protocole par le clonage du gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée. Le gène d'intérêt amplifié par PCR est inséré de manière contiguë par ligature dans le vecteur P enter D topo couplé à la topoisomérase. Le gène d'intérêt est ensuite transféré par recombinaison LR dans le vecteur destination P kakadu.Il contient les gènes adénoviraux et un site d'entrée ribosomale interne ou iris, suivi du cadre de lecture ouverte de la GFP, afin de créer un vecteur d'expression adénoviral doté d'un marqueur d'infection. Ensuite, 10 microgrammes du vecteur d'expression adénoviral sont linéarisés. Par un digestif de restriction en PAC un, l'ADN est alors précipité et resuspendu dans de l'eau à une concentration de trois microgrammes par 100 microlitres.La linéarisation libère les répétitions inversées virales, ou RIV, nécessaires à la réplication et à l'encapsidation de l'ADN viral dans les particules virales. Toutes les étapes suivantes doivent être réalisées dans des conditions de biosécurité appropriées pour une infection par l'adénovirus. Pour préparer le vecteur linéarisé destiné à la codélivrance par transfection, transférez six microlitres du réactif jet PEI dans 94 microlitres de chlorure de sodium à 50 micromolaire et vortexez.En résumé, tout en vortexant, ajouter la solution mixte à 100 microlitres de vecteur viral adénoviral linéarisé. Incuber ce mélange de transfection pendant 15 à 30 minutes à température ambiante. Ensuite, retirer les cellules HEC 293A cultivées à une confluence de 50 % dans des plaques à six puits de l’incubateur.Ajouter la solution goutte à goutte dans les puits contenant les cellules HEC 2 9 3 A et les incuber à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone. Ajouter 0,5 millilitre de milieu frais tous les trois jours en utilisant l'expression de la GFP comme marqueur d'infection. Évaluer l'efficacité de la transfection visuellement à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé tous les deux à trois jours et rechercher des effets cytopathiques manifestés par des zones de cellules agrandies et arrondies commençant à se détacher.Cela indique une génération efficace du virus. Une fois que des zones plus étendues d'effets cytopathiques apparaissent, toutes les cellules seront infectées en 24 à 72 heures. Lorsque toutes les cellules présentent des signes d'effets cytopathiques, mais avant qu'une détachement général des cellules ne se produise, récoltez les cellules par pipetage doux et transférez-les, avec le surnageant, dans un tube en polystyrène de 15 millilitres.Pour rompre ensuite les cellules, congeler les suspensions sur de la glace sèche pendant 15 à 20 minutes, puis les décongeler rapidement à 37 degrés Celsius. Répéter ce cycle de congélation et décongélation deux fois supplémentaires. La suspension de cellules rompues est désormais appelée lyssat viral primaire.Conservez toutes les lysats viraux sur de la glace. S'ils doivent être utilisés dans les 24 heures pour un stockage à long terme, congélez-les à moins 80 degrés Celsius. Gardez à l'esprit que chaque cycle supplémentaire de congélation-décongélation réduira le titre viral de 30 à 50 %. Pour amplifier le lysat viral primaire, infectez des cellules HC 293 A cultivées à 90 % de confluence sur 15 plaques de culture tissulaire avec la moitié du lysat viral primaire, et incubez pendant au moins 36 heures.Au bout de 36 heures, vérifiez l'infection par microscopie à fluorescence ; presque toutes les cellules doivent être infectées. Dès que toutes les cellules présentent des effets cytopathiques mais sans détachement, récoltez-les par pipetage doux accompagné d'une production efficace de virus. Cet état est atteint dans les 48 heures suivant l'infection. Transférez les cellules et le surnageant dans un tube en polystyrène de 50 millilitres.Centrifuger les cellules à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un volume approprié de milieu. Un millilitre devrait donner un titre compris entre 10 à la puissance 10 par millilitre.Effectuez trois cycles de congélation-décongélation comme précédemment pour rompre les cellules. Ensuite, centrifugez à 900 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez soigneusement le surnageant, désormais appelé lysat viral concentré, dans un tube cryo.Préparez des aliquotes pour plusieurs infections et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Enfin, déterminez le titre viral par analyse FACS de l'expression du marqueur d'infection dans des cellules 5 4 9. Conformément aux instructions du document joint, cette partie du protocole est réalisée à l'aide de cellules T CD quatre naïves isolées de souris transgéniques D 1110 car delta un transgéniques pour des expériences à petite échelle.Pipetez un volume approprié de lysat viral afin d'obtenir un MOI de 50 dans un puits d'une plaque 96 puits à fond rond. Ajoutez jusqu'à quatre fois 10 à la puissance 5 lymphocytes T dans un volume final d'infection de 50 microlitres par puits de lymphocytes T.Milieu moyen. Ce dispositif permet des approches expérimentales parallèles. Incuber les cellules pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.Après l'incubation, centrifuger les cellules à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante ; après la centrifugation, les resuspendre dans 200 microlitres de PBS, centrifuger à nouveau et éliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 200 microlitres de milieu pour lymphocytes T, sans anticorps stimulateurs et sans IL-2 ni autres cytokines. Incuber ensuite les cellules pendant 40 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre l'expression du gène d'intérêt avant l'activation. Pour activer et polariser les lymphocytes T, prélever à l'aide d'une pipette des billes couplées à l'anticorps anti-CD3 et à l'anticorps anti-CD28, et les introduire dans un petit récipient pour réactif. Le nombre de billes doit être égal au nombre de cellules, puis ajouter un volume de PBS dix fois supérieur et placer le récipient sur un aimant pendant deux minutes.Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez. Suspendez les billes dans 200 microlitres de milieu de polarisation, centrifugez les cellules reposées à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante ; après la centrifugation, retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 200 microlitres de milieu de polarisation contenant les billes couplées à l'anticorps. Incubez pendant 72 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone, sans changer le milieu. Le protocole de coloration et de fixation est décrit succinctement ici.Les cellules sont d'abord lavées dans du PBS, puis incubées avec une solution de coloration fixable pour les cellules mortes. Après une nouvelle étape de lavage, les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde ; à partir de ce stade, les manipulations peuvent être réalisées sans précautions de biosécurité contre l'adénovirus. Les cellules sont ensuite lavées à nouveau et rendues perméables au méthanol. Après un autre lavage, les cellules sont incubées avec un anti-FCR3 afin de bloquer la liaison non spécifique.Enfin, les cellules sont incubées avec des anticorps anti-FCR trois et anti-fox P trois couplés à la PE. Il existe un risque de perte importante de cellules durant les étapes de fixation et de marquage en raison des multiples lavages ; veillez à éviter cette perte. Assurez-vous de retirer le surnageant immédiatement après la centrifugation, sans perturber le culot à l’aide d’une pipette. Après marquage des cellules, lavez-les deux fois en PBS et analysez-les sur un cytomètre en flux.Un lecteur 96 puits sur le cytomètre en flux permet d'effectuer l'infection, la différenciation, la fixation et la coloration des lymphocytes T dans le même plateau 96 puits, offrant ainsi un flux de travail efficace pour l'analyse parallèle de plusieurs conditions. Toutefois, l'analyse peut également être réalisée dans des tubes fax classiques afin d'évaluer l'effet de l'infection par l'adénovirus sur la viabilité des lymphocytes T et leur différenciation en lymphocytes T régulateurs. Des lymphocytes T naïfs purifiés à partir de souris transgéniques DO11.10 et car delta 1 transgéniques ont été infectés par un adénovirus contrôle à différents MOI et activés dans des conditions favorisant la polarisation vers des Treg. Les cellules fixées et colorées ont été analysées par cytométrie en flux afin d'évaluer l'expression du marqueur d'infection.Incorporation de GFP de cellules mortes et du marqueur de différenciation. FOX P trois comme indiqué ici. Une augmentation du MOI de un à 50 entraîne un pourcentage plus élevé de cellules infectées.Alors que ni la viabilité ni la différenciation en lymphocytes T régulateurs (Treg) ne sont affectées, afin de déterminer si l'infection par l'adénovirus influe sur l'état d'activation des lymphocytes T. Les cellules infectées et non infectées ont été analysées pour l'expression de marqueurs d'activation et de repos par cytométrie en flux, comme illustré ici. L'expression de ces marqueurs était indiscernable entre les cellules infectées et non infectées lorsque celles-ci étaient ensuite activées dans des conditions favorisant la polarisation vers des Treg.L'uprégulation des marqueurs d'activation et la downrégulation des marqueurs de lymphocytes T naïfs étaient très similaires dans les cellules infectées et non infectées prises ensemble. Ces données indiquent qu'une infection des lymphocytes T à l'état naïf n'interfère pas avec l'activation ultérieure des lymphocytes T. Afin de tester le niveau de surexpression obtenu avec le protocole de transduction adénovirale décrit, les lymphocytes T naïfs ont été infectés par un adénovirus codant pour le microARN 155 ou un adénovirus contrôle à un MOI de 50. Les cellules ont soit été mises au repos pendant 40 heures, soit activées pendant 40 heures, soit mises au repos pendant 40 heures, suivies d'une activation de 40 heures. Un ADNc a été généré et l'expression du microARN 155 a été déterminée relativement au snoARN 202.Par PCR quantitative, les niveaux de surexpression de la microARN 155 dans les lymphocytes T naïfs mis au repos pendant 40 heures correspondent à ceux de la microARN endogène 155. Après 40 heures d'activation des lymphocytes T, l'activation de ces cellules induit toujours une surexpression dépendante de l'activation de la microARN 155.Ceci démontre le haut niveau de surexpression dans les lymphocytes T naïfs induit par l'adénovirus, en sus de l'expression des microARN induite par l'activation endogène. Une fois la méthode maîtrisée, le clonage, la génération du virus et l'infection des lymphocytes T peuvent être réalisés en quatre semaines. Le virus, une fois produit, peut être conservé à long terme ou réamplifié en trois jours.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours contrôler soigneusement toutes les expériences à l’aide d’un vecteur vide et d’établir d’abord l’effet de l’infection adénovirale elle-même sur le processus étudié. Veuillez garder à l’esprit que l’infection adénovirale et la surexpression sont transitoires et ne durent que cinq à sept jours environ.

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous présentons un protocole pour produire l'antigène spécifique de la souris de cellules T à l'aide transduction...

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d'un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d'autres dans une variété d'applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Génération de cellules T régulatrices induites de l&#39;homme primaires cellules T naïves et mémoire

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Les lymphocytes T CD4+ naïfs se polarisent en divers sous-ensembles en fonction de l’environnement au moment de l’activation.  La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en divers sous-ensembles effecteurs peut être réalisée in vitro par l’ajout de stimuli des récepteurs des lymphocytes T et de signaux spécifiques de cytokines.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser le phénotype des cellules T régulatrices (Treg) isolées de souris naïves et chroniques infectées par le virus de la chorioméningite lymphoïde. De plus, nous proposons un processus pour évaluer l’activité suppressive des cellules Treg.

Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

De nombreux systèmes expérimentaux ont été utilisés pour comprendre les mécanismes qui régulent la croissance et la fonction des lymphocytes T dans une réponse immunitaire. Ici, une approche génétique en utilisant la transduction rétrovirale est décrite, qui est économique, efficace du temps, et surtout, très instructif pour identifier les voies de régulation.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Ce protocole décrit la génération reproductible et phénotypage des cellules T régulatrices humaines induites (les iTregs) à partir de cellules T CD4 + naïves in vitro. Différents protocoles pour FOXP3 induction permettent l'étude des phénotypes iTreg spécifiques obtenus avec les protocoles respectifs.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Ce protocole décrit la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Th17 pathogènes in vitro. Plus précisément, lorsqu’il est combiné à une approche basée sur la cytométrie en flux multiparamétrique, une pureté de 90 % de cellules Th17 pathogènes peut être obtenue à partir de cellules T CD4+ naïves en utilisant cette méthode de différenciation.

Différenciation in vitro de lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Th17 pathogènes chez la souris

L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.

Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

Nous présentons un protocole pour la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, offrant une alternative efficace pour l’édition de gènes dans l’étude de la différenciation Th17.

Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

Découvrez la transduction adénovirale pour l'expression ectopique de gènes dans les cellules T CD4 naïves avant la différenciation en cellules Treg. Cette méthode permet une surexpression transitoire élevée sans altérer la viabilité cellulaire.

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Explorer plus de vidéos