Name: Titration biochimique de glycogène In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Apprenez la titration biochimique du glycogène in vitro par hydrolyse enzymatique et mesure de fluorescence. Cette méthode permet de quantifier précisément les niveaux de glycogène dans les échantillons cellulaires.

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Nous sommes reconnaissants au Dr Thierry Pourcher pour nous permettre d&#39;utiliser le spectromètre de fluorescence et pour son aide. Le laboratoire est financé par la Nationale Contre le Cancer le Ligue (Equipe de labellisée), l&#39;Association pour la Recherche contre le cancer, l&#39;Institut National du Cancer (INCa), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programme FP7), le Centre A. Lacassagne, le Centre National de la Recherche Scientifique, l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale et l&#39;Université de Nice ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Nous remercions le Dr Christiane M Brahimi-Horn pour la lecture critique et correction rédactionnelle.

Titration biochimique de glycogène Une. Lyse cellulaire <ol><li> cellules de semences à une concentration de 0,5-2 x 10 6 par boîte de 100 mm de diamètre. </li><li> Traitement: incuber les cellules 24, 48, ou 72 heures de la concentration d&#39;oxygène basse (hypoxie) dans un Bug-Box station de travail anaérobie (Ruskinn technologie Biotrace International Plc, Bridgend, UK) fixé à 1% ou 0,1% O 2, 94% ou 94,9% de N 2 et 5% de CO 2. En parallèle, les cellules incuber à la normoxie (21% O 2, 5% CO 2). Changer le milieu (milieu 25 mM contenant du glucose) toutes les 24 heures afin de minimiser les variations de la concentration de glucose au cours du temps de l&#39;expérience. </li><li> Après traitement, les cellules de lavage 2 fois avec du PBS pour éliminer les traces de glucose du milieu de culture. Grattez les cellules dans du PBS froid. </li><li> Centrifuger la solution à 1000 rpm pendant 5 min, jeter le surnageant et laver le culot une fois avec PBS. Le culot peut être congelé à -20 ° C avant de poursuivre.</li><li> Remettre en suspension le culot dans 100 pl d&#39;eau distillée. Ajouter 100 ul de tampon d&#39;hydrolyse du glycogène fournies avec le kit d&#39;analyse de glycogène (Abcam). Faire bouillir le lysat à 95 ° C pendant 5 min pour inactiver les enzymes. </li><li> Vortex et centrifuger le lysat à 13 000 rpm pendant 10 min pour éliminer les produits insolubles. Gardez le surnageant. </li><li> Pour normaliser les taux de glycogène de la teneur en protéines entre les échantillons, la quantification des protéines peut être effectuée avec 25 à 35 ul du surnageant en utilisant le test à l&#39;acide bicinchoninique (BCA-Interchim). </li></ol> Une partie du lysat peut être utilisé pour mesurer la concentration de glucose libre dans les cellules. 2. L&#39;hydrolyse du glycogène <ol><li> Mélanger 50 ul de surnageant (étape 1) avec 1 pi de l&#39;hydrolyse enzymatique de mélange. Ce mélange contient glucoamylase. Incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Préparer la courbe de calibration par dilution de la glycogène standard (2 mg / ml) supplied avec le kit pour une solution de 10 ug / ml dans le tampon d&#39;hydrolyse. Ensuite, préparer six tubes séparés avec 0, 4, 8, 12, 16, et 20 pi de 10 pg / ml standards et ajuster chaque tube à un volume final de 50 ul avec du tampon d&#39;hydrolyse pour donner une concentration de glycogène de 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 et 0,2 ug / ml. Ajouter 1 pi de mélange d&#39;hydrolyse enzymatique dans les normes et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li></ol> La concentration de glucose dans le fond de la lignée cellulaire, donnée par la valeur de la concentration libre de glucose, doit être soustraite de la valeur de la concentration en glucose total (glucose à partir du glycogène hydrolyse + glucose libre) pour déterminer le niveau de glycogène dans la cellule. 3. Développement et de la lecture de la fluorescence <ol><li> Pour chaque condition, préparer un tube (tube 1) pour mesurer la concentration de glucose libre et deux tubes (tubes 2 et 3) pour mesurer la concentration totale en glucose (chaque esprit du tubeha différente volume de glycogène hydrolysé). </li><li> Ajouter 15 ul de surnageant extraites à la fin de l&#39;étape 1 dans le tube 1. Ajouter 35 ul de tampon d&#39;hydrolyse pour compléter à un volume final de 50 ul. Fluorescence obtenue va donner la concentration en glucose libre. </li><li> Ajouter X pi de glycogène hydrolysées (obtenu à l&#39;étape 2) dans le tube 2. Ajuster à un volume final de 50 ul. Volume de l&#39;échantillon (X ul) doit être ajusté en fonction de la densité cellulaire et / ou du type de cellule afin d&#39;obtenir des valeurs de fluorescence qui ne sont pas au-delà de la concentration de la courbe d&#39;étalonnage. </li><li> Ajouter 2 X pi de glycogène hydrolysé dans le tube 3. Ajuster à un volume final de 50 ul. </li><li> Préparer une solution de développement pour les échantillons et les normes en mélangeant pour chaque tube 48,7 ul de tampon de développement, 1 pl de développement Enzyme Mix et 0,3 pi de OxiRed Probe (fourni dans le kit d&#39;analyse de glycogène). Par exemple, pour deux conditions, préparer un mélange de 12 tubess (6 pour les normes, 2 pour le glucose libre et 4 pour la fluorescence totale de glucose). </li><li> Ajouter 50 ul de ce mélange à chaque tube et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Mesurer la fluorescence à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 535 nm, une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 587 nm comme recommandé, et une fente de 3 nm pour l&#39;excitation et d&#39;émission. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Titrage biochimique de glycogène in vitro permet une quantification précise des cellules contenu glycogène. Comparé à d&#39;autres techniques (PAS, immunofluorescence avec un anticorps de glycogène, etc.), Ce titrage est très spécifique, sensible et reproductible. En outre, le procédé est commode car il ne nécessite pas de radioactivité, mais un spectromètre à fluorescence. Cependant, cette technique est purement quantitative et ne fournit pas d&#39;informations sur la distribution de glycogène dans la...

Le glycogène est un polymère multibranche de résidus de glucose, qui est présent dans le cytoplasme de nombreux types de cellules. Elle est l&#39;une des principales formes de stockage d&#39;énergie dans les cellules et joue un rôle important dans le métabolisme du glucose. La plupart des cellules de mammifères sont capables de produire et stocker du glycogène, qui peut être rapidement dégradé en glucose pour promouvoir la glycolyse et de l&#39;ATP production au cours du stress métabolique. Les hépatocytes produisent des quantités massives de glycogène pour réguler le niveau de sucre sanguin fournissant ainsi une alimentation continue en glucose dans le corps. En revanche, la concentration de glycogène dans les autres cellules (muscles, les globules rouges, etc) est relativement faible. Cependant, localement, ces quantités sont suffisantes pour fournir de l&#39;énergie à court terme quand les cellules sont soudainement exposés à un environnement privé de nutriments. la synthèse de glycogène et la dégradation du glycogène suit les mêmes étapes dans tous les tissus (Figure 1). Tout d&#39;abord, le glucosepénètre dans les cellules par des transporteurs du glucose (GLUT), et est rapidement transformé à partir de glucose-6-phosphate (G6P) en glucose-1-phosphate (G1P) par phosphoglucomutase. G1P est alors modifiée en UDP-glucose et le carbone C1 de l&#39;UDP-glucose est attaché à un résidu de tyrosine de glycogénine, la protéine d&#39;ancrage de glycogène. Cette molécule, considérée comme une amorce de glycogène, est prolongée par la fixation de l&#39;UDP-glucose au glucose terminal par un α (1 → 4) liaison via la glycogène synthase. Enfin, quand une chaîne linéaire de plus de 11 résidus de glucose est formée, l&#39;enzyme de branchement transmet une borne oligosaccharide constitué par un minimum de six résidus glucose glucose à l&#39;autre de la chaîne à proximité par le biais d&#39;une α (1 → 6) de liaison. La répétition de ce processus donne une structure massive fractale contenant branches qui forment une hélice avec 6,5 glucose par tour. Le glycogène peut être inverse hydrolysé en glucose par l&#39;action concertéede déramification enzymes qui hydrolysent l&#39;α (1 → 6) et lié glycogène phosphorylase qui hydrolyse l&#39;α (1 → 4) lié glycosidique entre le dernier résidu de glucose et une branche de la molécule de glycogène. Cette réaction appelé glycogénolyse est activée en augmentant les niveaux d&#39;AMP (reflétant la consommation d&#39;ATP), et inhibée par le glucose et l&#39;ATP 2,3. Par microscopie électronique, les molécules de glycogène ont été décrits dans de nombreux types cellulaires que les particules libres (ou β monoparticules de glycogène) de 15 à 30 nm de diamètre. Dans des types cellulaires spécifiques, telles que les hépatocytes, les particules β peuvent être assemblés en un ensemble pour former des rosettes, également connus en tant que particules α qui varient en diamètre de 80 nm à un maximum de 200 nm 4 </sup&gt;. La manière dont ces particules β sont liés pour former de plus grands agglomérats de particules α n&#39;est pas encore totalement élucidé. Certaines preuves tend à prouver que les particules β peuvent être liés par liaison covalente 5, une liaison hydrogène, ou encore au moyen d&#39;interactions protéine-protéine 6. La quantité de glycogène dans les cellules dépend de nombreux paramètres: (I) la quantité de glycogénine dans la cellule qui initie la synthèse du glycogène, (II) l&#39;activité de la glycogène synthase et phosphorylase régulée par la phosphorylation des protéines / déphosphorylation, (III) la concentration du glucose dans les cellules, ce qui est dépendante de plusieurs paramètres, tels que la fourniture de glucose à partir du système vasculaire et de la captation du glucose par les cellules. les réserves de glycogène sont strictement réglementées par régulation allostérique d&#39;hormones biosynthétiques par les métabolites intermédiaires, par des hormones de régulation du métabolisme énergétique, et par des éléments nutritifs de détection de signalisation des voies 7. Il est important d&#39;êtremesure de quantifier le glycogène dans des échantillons biologiques afin de mieux comprendre l&#39;importance du métabolisme du glycogène dans le corps entier et au niveau cellulaire. Nous décrivons ici un biochimique précis, reproductible et pratique dans le test in vitro pour le glycogène. Cette technique est basée sur la quantification de la fluorescence du glucose avant et après l&#39;hydrolyse spécifique de glycogène. D&#39;autres méthodes existent pour estimer le niveau de glycogène dans les cellules, mais la plupart d&#39;entre eux ne sont pas quantitatifs. Une des premières techniques décrites pour la quantification de glycogène dans les cellules était basée sur la mesure de la [14C]-glucose en glycogène 8,9 incorporation. L&#39;utilisation de la radioactivité qui rend ce procédé plus difficile à manipuler mais elle a l&#39;avantage d&#39;offrir le taux d&#39;incorporation du glucose dans le glycogène et à faire la distinction entre la distribution des résidus de glucose sur les branches extérieures et dans le noyau de la molécule (elle nécessite également un supplémentaire β-amylolysis et une étape de chromatographie). Une autre technique a été développée plus récemment et est basé sur l&#39;incorporation de 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazole-4-yl] amino}-2-désoxyglucose), un 2-désoxyglucose dérivé fluorescent, en glycogène 10. L&#39;intensité de fluorescence mesurée reflète la quantité de glycogène produit et peut être mesurée avec un lecteur de fluorescence. La distribution de la fluorescence de la cellule peut aussi être évaluée par microscopie confocale. Parmi les autres techniques non quantitatives, l&#39;acide périodique de Schiff coloration (PAS) est peut-être le plus commun. Il peut être utilisé pour la détection de glycogène dans les cellules fixées, les coupes de tissu dans de la paraffine ou de gelée. Cette histologiques couleurs de technique non spécifiquement polysaccharides, des glycolipides, des glycoprotéines, la cellulose et les mucines neutres en violet. La spécificité de ce test peut être augmentée par le traitement des cellules fixes ou des sections de tissu avec diastase, qui digère spécifiquement le glycogène. Par la suite,le niveau de glycogène peut être estimée qualitativement en comparant des échantillons non hydrolysées (tous les hydrates de carbone modifié de macromolécules) à des échantillons hydrolysées (glucides macromolécules modifié, sauf glycogène). La coloration et l&#39;analyse microscopique, à la différence des essais biochimiques de glycogène, fournit des informations concernant la distribution de glycogène dans la cellule, qui peut être diffusé ou concentré dans une certaine partie de la cellule. Cependant, même si les estimations de coloration PAS des différences dans l&#39;accumulation de glycogène entre des conditions différentes, il n&#39;est pas quantitative 11. Un anticorps monoclonal de souris à l&#39;origine faite en utilisant cartilage condylien mandibulaire a été montré que l&#39;antigène de réagir avec du glycogène dans les cellules et à la glycogène purifiée in vitro 12. Comme cet anticorps reconnaît spécifiquement des chaînes de sucres liées glycogène, il est un outil utile pour la détection de glycogène par immunohistochimie d&#39;une manière plus précise que la coloration PAS. </p&gt; La microscopie électronique est une autre technique qui permet la visualisation des grains de glycogène dans les cellules et l&#39;évaluation du degré de stockage du glycogène. En fait, les particules β de glycogène sont facilement reconnaissables avec un microscope électronique en électrons granules denses 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Assay Kit</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Spectromètre de fluorescence</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

titration biochimique de glycogène<em&gt; in vitro</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Le glycogène est le principal polymère énergétique de glucose chez les animaux vertébrés et joue un rôle essentiel dans le métabolisme du corps tout entier, ainsi que dans le métabolisme cellulaire. Beaucoup de méthodes de détection glycogène existent déjà, mais seulement quelques-uns sont d&#39;ordre quantitatif. Nous décrivons ici un procédé utilisant la trousse de dosage Abcam glycogène, qui est basé sur la dégradation spécifique du glycogène en glucose par la glucoamylase. Le glucose est ensuite oxydé spécifiquement à un produit qui réagit avec la sonde OxiRed pour produire la fluorescence. Le titrage est précise, sensible et peut être réalisé sur des extraits cellulaires ou des coupes de tissus. Cependant, contrairement à d&#39;autres techniques, elle ne donne pas d&#39;informations sur la distribution de glycogène dans la cellule. Comme exemple de cette technique, nous décrivons ici le titrage de glycogène dans les deux lignées cellulaires, les Chinois CCL39 de fibroblastes de poumon de hamster et LS174 de carcinome du côlon humain, incubées en normoxie (21% O 2) par rapport à l&#39;hypoxie (1% d&#39;O 2). Nous émettons l&#39;hypothèse que l&#39;hypoxie est un signalnal qui prépare les cellules à synthétiser et stocker du glycogène pour survivre 1.

Un faible niveau d&#39;oxygène (hypoxie) dans les signaux de tumeurs à cellules de tumeur de la nécessité de stocker de l&#39;énergie pour gérer la suite épuisement des nutriments, de façon à survivre. Sous forme de glycogène est la principale polymère énergétique du glucose dans les cellules de mammifères, nous avons étudié la régulation de stockage de glycogène dans l&#39;hypoxie. Le calcul et la normalisation de la concentration de glycogène dans les lysats cellulaires doivent être réalisées sur les données brutes de...

Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l&#39;hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence.

Titration biochimique de glycogène<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

L’objectif global de cette procédure est de titrer le glycogène in vitro dans des échantillons de cellules. Ceci est accompli en lysant d’abord les cellules par perturbation mécanique. La deuxième étape consiste à hydrolyser le glycogène avec de l’alpha-amylase pour obtenir le glucose.Ensuite, le glucose est oxydé en produisant une espèce fluorescente. La dernière étape consiste à mesurer la fluorescence. En fin de compte, le titrage biochimique du glycogène est utilisé pour montrer les changements dans la teneur en glycogène des cellules.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle est compétitive, sensible, précise et très spécifique. Pour commencer cette procédure, ensemencez des cellules à une concentration de 0,5 à 2 millions par boîte de 100 millimètres de diamètre. Incuber les cellules pendant 24, 48 ou 72 heures en hypoxie dans un poste de travail anaérobie réglé à 1 % d’oxygène, 94 % d’azote et 5 % de dioxyde de carbone.En parallèle, incuber un autre ensemble de cellules en normoxie pour chaque condition d’oxygène. Changez le milieu contenant du glucose de 25 millimolaires toutes les 24 heures pour minimiser les variations de la

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