Name: Un Heterotopic porcine Hind Membre Transplant modèle modifié translationnelle vascularisé composite Allotransplantation (VCA) de recherche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez un modèle porcin fiable de transplantation d'extrémité postérieure avec moelle osseuse vascularisée intacte pour étudier les protocoles immunomodulateurs en allotransplantation composite vascularisée.

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Nous tenons à remercier les personnes suivantes pour leur contribution à ce projet: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Saami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, et Angelo Barone Leto MD, VCA Laboratoire, Département de chirurgie plastique et reconstructive, School of Medicine, Janis Taube, MD de l&#39;Université Johns Hopkins, Mark Fischer, MD, Département de chirurgie mini-invasive Centre de formation de dermatologie et de pathologie à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Johns Hopkins, Sue Eller, à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Johns Hopkins et Cheng-Hung Lin, Chang Gung Memorial Hospital MD, Linkou, Taiwan. Source de financement: Institut des Forces armées de la médecine régénérative (DoD W81XWH-08-2-0032)

Dans cette publication, vidéo, toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées conformément à un protocole d&#39;animaux approuvé par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université Johns Hopkins (IACUC). Une. Planification préopératoire <ol><li> Nous utilisons MHC-défini MGH inné porc miniature (15-20 kg) dans nos études translationnelles pour allogreffe membre dans lequel un donneur mâle offre des membres de deux femmes bénéficiaires (Figure 1). Avant la chirurgie, donateurs et bénéficiaires animaux soumis à une évaluation clinique approfondie par un vétérinaire. </li><li> Afin de minimiser l&#39;anesthésie et la durée de l&#39;ischémie, les procédures des donateurs et bénéficiaires sont effectuées simultanément sur trois tables d&#39;opération dans une grande salle d&#39;exploitation animale dédié. Travail d&#39;équipe et la coordination entre les équipes chirurgicales ainsi que le personnel vétérinaire sont essentielles à la réussite globale de cette procédure. Le plan de traitement chirurgical est discuté avec l&#39;équipe vétérinaire dans une réunion formelle 1-2 Semaines avant le jour de la chirurgie. </li><li> Un cathéter veineux central tunnel (7 double lumière Fr Hickman cathéter) est placé dans une veine jugulaire externe ou interne de chaque animal receveur avant la transplantation pour immunosuppresseur surveillance du niveau de la drogue et de l&#39;administration intraveineuse de immunosuppresseur et / ou immunomodulateurs. Ces cathéters sont placés sous vision directe par une technique veineux de coupe-bas et en tunnel postérieure à quitter haut sur le cou dorsale et fixé à l&#39;aide monofilament fils non résorbables et adhésif enveloppe de bandage autour du cou. </li><li> Gardez les animaux NPO (pas de nourriture solide, mais sont autorisés l&#39;eau à volonté) au moins 12 heures avant la chirurgie. </li><li> Le jour de la chirurgie, les animaux calmes avec de la kétamine à 20 mg / kg et de xylazine à 2 mg / kg IM. </li><li> Placer une sonde endotrachéale de taille appropriée et le connecter à l&#39;appareil d&#39;anesthésie et d&#39;un ventilateur (maintenu sur isoflurane 0,5-3%) </li><li> Placer un cathéter intraveineux dans une veine de l&#39;oreille marginale et administrerpoids basé saline à 0,9% tout au long de la procédure. </li><li> Administrer analgésie préventive (buprénorphine 0,02 mg / kg IV). </li><li> Administrer l&#39;antibiotique prophylactique (céfazoline 20-25 mg / kg IV) avant l&#39;incision initiale de donneur et les animaux receveurs. </li><li> Utiliser une technique stérile dans toutes les procédures pour les bénéficiaires et les donateurs. Cela inclut l&#39;utilisation d&#39;instruments stérilisés à l&#39;autoclave ou au gaz stérilisé, masques, bonnets de tête, des gants chirurgicaux stériles et des gants stériles. Rasez la zone de l&#39;incision avec une tondeuse et désinfecter avec une alternance de solution Betadine et l&#39;alcool. </li></ol> Surveillance peropératoire: <ol><li> Après l&#39;induction et l&#39;intubation, de maintenir l&#39;anesthésie par inhalation d&#39;un mélange de 0,5 à 3% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène. </li><li> Surveillance de la fréquence cardiaque, l&#39;oxymétrie de pouls, ECG, en fin d&#39;expiration de CO 2 et la température rectale et enregistrer en continu toutes les 15 min. </li><li> Prévenir l&#39;hypothermie avec une couverture chaude à air pulsé Bair Hugger. </li></ol><ol><li> Placez l&#39;animal donneur en position couchée sur la table d&#39;opération et le drapé de manière stérile. </li><li> Utilisez proche infra rouge angiographie laser pour identifier les navires de perforateur de la peau antéro-interne. Injecter indocyanine vert à environ 0,06 mg / kg dilués dans 2-5 ml de solution saline normale grâce à l&#39;accès vasculaire périphérique. Environ 10 secondes plus tard, effectuer 30 sec-2 min d&#39;enregistrements dans le proche infrarouge. Utilisez la vidéo à partir de ces enregistrements pour identifier les perforateurs. Sur la base de perforateurs, marquer une zone de peau (environ 100 cm 2) pour la surveillance. </li><li> Utiliser un scalpel pour faire une incision de la peau de l&#39;aine en continuité avec des marques pour la palette de peau (figure 2). </li><li> Identifier les vaisseaux fémoraux et les isoler de manière distale au niveau des branches de suprageniculate et de manière proximale au niveau du ligament inguinal. </li><li> Disséquer la peau et du tissu sous-cutané tout en preserving de la zone de la pale de la peau. Suturer les bords de la peau sous-jacente à la contraction des muscles afin d&#39;éviter lors de la récolte de rabat. </li><li> Effectuer une ostéotomie juste au-dessus du tarse utilisant une scie alternative (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Diviser les muscles de la cuisse proximale bistouri électrique. </li><li> Diviser le fémur à mi-arbre en laissant un rabat ostéo sur un pédicule vasculaire. Le volet contient la palette de la peau, les muscles de la cuisse sous-jacentes, l&#39;articulation du genou, le fémur distal et le tibia proximal qui comprend intact vascularisé moelle osseuse avec ses caractéristiques immunologiques uniques. </li><li> Utilisation de la cire d&#39;os pour réaliser l&#39;hémostase dans les espaces de la moelle osseuse. Bords os lisse utilisant ronjeurs en préparation pour le destinataire. </li><li> Gardez la greffe perfusé sur son pédicule vasculaire jusqu&#39;à vaisseaux fémoraux du destinataire sont préparés (figure 3). </li><li> Une fois la dissection du destinataire est terminée, ligaturer les vaisseaux fémoraux donateurs comme proximale que possible unee infuser la greffe avec l&#39;histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK, Custodiol, Newtown PA) avant la transplantation. NOTE: Le membre de donneur est transplanté sur le côté opposé du destinataire à savoir le membre de donneur gauche pour le côté droit du destinataire et la branche des donateurs droite pour le côté gauche du destinataire). </li><li> Euthanasier le porc donneur immédiatement après la récolte de la deuxième patte arrière à l&#39;aide de pentobarbital de sodium 100 mg / kg IV. La mort est confirmée par le personnel vétérinaire conformément au protocole établi. </li></ol> 4. Procédure du bénéficiaire (membre postérieur Allotransplantation) <ol><li> Lancer l&#39;induction et l&#39;intubation bénéficiaire immédiatement après l&#39;incision de donneur initial pour permettre la préparation des navires bénéficiaires tandis que le membre de donneur est en cours de récolte. Cela permet d&#39;éliminer le temps d&#39;attente nécessaire et réduit la durée totale de l&#39;anesthésie pour le donneur et les destinataires. </li><li> Placez le décubitus animal avec une rotation de 30 ° sur le côté de fonctionnement à alloexposition w du côté dorsolatéral. </li><li> Faire une incision de l&#39;aine et exposer les vaisseaux fémoraux, les isoler de manière distale au niveau des branches de suprageniculate et de manière proximale au niveau du ligament inguinal. </li><li> Créer une poche sous-cutanée de l&#39;aine à la paroi abdominale dorsolatéral pour l&#39;encart de greffage (Figure 4). </li><li> Ligaturer les vaisseaux donateurs et rincer la greffe avec HTK. </li><li> Effectuer le médaillon de la greffe d&#39;une manière inversée: Avez la palette de la peau face dorso-latérale pour permettre un suivi facile immunitaire dans une position debout et les extrémités des vaisseaux fémoraux face caudale pour permettre anastomoses vasculaires de bout en bout sans aucune tension sur les navires (coupées la figure 5). </li><li> Si possible, utilisez un dispositif d&#39;accouplement vasculaire (Synovis, St Paul MN) pour anastomoses veineuses (taille 2,5-3,5 convient pour 10-20 kg animaux). Cela réduit considérablement le temps d&#39;ischémie par rapport aux méthodes conventionnelles. </li><li> Effectuer artérielle anastomoses utilisant une technique de suture classique avec 9-0 suture (Synovis, St Paul MN) </li><li> Après la perméabilité vasculaire est confirmée, fixer la greffe en place avec 3-0 PDS sutures (figure 5). Les muscles du greffon sont suturées aux muscles de la paroi abdominale. Les muscles greffés doivent pas être suturées aux muscles de la cuisse de destinataire car il peut être nuisible lorsque l&#39;animal se déplace autour de la cage. </li><li> Extérioriser la palette de peau sur le côté dorsolatéral pour la surveillance immunitaire (figure 6) et suturer la peau adjacente en utilisant 3-0 Vicryl sutures sous-cutanées et 4-0 monofilament résorbable points séparés de la peau. </li><li> Fermez la peau de l&#39;aine en couches en utilisant 3-0 Vicryl sutures sous-cutanées et 4-0 monofilament résorbable points séparés de la peau. </li><li> Placez un patch 50-100 mcg / h de fentanyl pour l&#39;analgésie post-opératoire. </li><li> Après membres postérieurs transplantation d&#39;allogreffe, le réexpédier vers sa plume une fois éveillé et respirer confortablement sur son propre.</li>
</ol>

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<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Historiquement, la branche protocole de transplantation hétérotopique de derrière inclus extériorisation d&#39;une palette de peau de la paroi abdominale ventrale et les vaisseaux ont été anastomosée d&#39;une manière bout-à-côte (Hettiarachty 2004). Cependant, dans notre méthode modifiée, un volet inversée encartage et anastomoses bout-en-bout apporter la palette de peau plus latéralement et donc facilite la surveillance immunitaire dans une position debout de l&#39;animal. L&#39;identification de l&#39;artère saphène ...

Vascularisé composite Allotransplantation (VCA), tels que les greffes de mains et le visage sont maintenant une réalité clinique avec de nombreuses greffes de mains et le visage réalisées dans le monde entier 12. Malgré le fait que les premiers résultats intermédiaires et sont favorables et très encourageant 2, l&#39;exigence de l&#39;immunosuppression chronique multirésistante continue de limiter son application clinique généralisée. Les progrès dans les modèles murins de VCA, y compris les anastomoses super-microchirurgie et des techniques de manchette sans suture 13, 3 ont ouvert la voie à une meilleure compréhension des allo-réponses dans VCA. Des myriades de protocoles immunomodulateurs ont été proposés pour des applications cliniques fondées sur notre meilleure compréhension des mécanismes immunitaires chez VCA mais ils doivent être validés dans un grand modèle animal qui serait raisonnablement considérée comme prédictive de leur performance chez l&#39;homme 7. Sur la base de similitudes physiologiques et immunologiques entre les systèmes d&#39;organes humains et porcins <sup&gt; 6, modèles VCA porcs peuvent être considérés comme des alternatives fiables et rentables pour canine et 9 modèles de primates non humains 1. Cet article fournit une vue d&#39;ensemble détaillée de la méthodologie utilisée dans notre modèle MHC-défini porcine hétérotopique membres postérieurs greffe, qui sert de bases pour nos stratégies immunomodulateurs actuels et futurs visant à induire une tolérance immunitaire à VCA et donc élargir son application clinique. Nous utilisons des porcs consanguins bien caractérisés élevés à l&#39;homozygotie au locus de l&#39;antigène leucocytaire porcine spécifiquement pour leur utilisation dans la recherche sur la transplantation 11. Nous élevons un volet ostéo vascularisé basé sur vaisseaux fémoraux. Le volet contient intact vascularisé moelle osseuse dans le fémur distal et le tibia proximal. La peau de la cuisse antéro-interne est également inclus dans le greffon est extériorisé et à l&#39;aspect dorso-latérale de l&#39;animal receveur pour la surveillance immunitaire de l&#39;élément le plus immunogène of le VCA. Positionnement dorsolatéral facilite l&#39;examen clinique en position debout ou assise positions et maintient la peau de l&#39;allogreffe relativement propre aussi. Ustener et al. Introduit l&#39;un des premiers grands modèles de translation des animaux dans VCA par transplantation radiales volets membres antérieurs de ostéo chez les porcs d&#39;élevage consanguins 15. Le groupe a utilisé ce modèle pour démontrer pour la première fois que le rejet aigu en VCA qui comprenait le composant hautement immunogène de la peau pourrait être retardée et traité avec une stratégie cliniquement pertinente sans complications importantes spécifiques à un médicament et des effets secondaires. Les résultats favorables obtenus dans cette étude ont construit la suite d&#39;une étape fondamentale dans la conception des schémas thérapeutiques pour la transplantation humaine reconstructive. Bien que ces modèles VCA de porcs au début étaient bien adaptés à l&#39;élaboration de protocoles pour prévenir le rejet de la peau, les muscles, les os, les nerfs et les vaisseaux, ils n&#39;avaient pas de structures spécialisées telles que articulaire cartilage et les membranes synoviales des articulations. Les efforts ultérieurs ont porté sur notamment le chiffre médian de l&#39;animal, ce qui a nécessité le placement en fonte pleine longueur pour éviter greffe délogement 14. Bien adapté pour enquêter sur le rejet de toutes les composantes majeures du membre transplantation, l&#39;une des principales limites de ce modèle a été post-transplantation difficulté ambulatoire en raison de jeter placement. Ainsi, les modèles membre de allogreffe porcine hétérotopiques, constitué du tibia, péroné, l&#39;articulation du genou, le fémur distal, le muscle environnant, et une palette de peau, ont été créés pour étudier principalement les aspects immunologiques de VCA, tout en permettant à l&#39;animal de déambuler librement après l&#39;opération avec un minimum de morbidit 8 . Le développement des porcs consanguins SLA définis bien caractérisées par le travail de pionnier du Dr David H. Sachs a conduit à une nouvelle ère de la recherche translationnelle VCA. Utilisant un modèle de greffe de membre postérieur hétérotopique dans un cadre antigène décalage mineur, Mathes et al. 10 ont démontré la survie indéfinie de composants musculo-squelettiques avec un traitement de courte durée de la cyclosporine. La survie des composants de la peau, toutefois, n&#39;a été prolongée par rapport aux pas de contrôle de traitement. La perte de la composante de la peau de la greffe a été attribuée à une réponse immunitaire très forte et d&#39;isolement, en particulier à l&#39;épiderme. De même, l&#39;utilisation du porc entièrement incompatibles avec l&#39;épuisement des cellules T, un bref cours de la cyclosporine et des cytokines mobilisé donateurs cellules mononucléaires du sang périphérique induits tolérance uniquement aux composants musculo-squelettiques et la composante de la peau a été encore rejeté 5. Ce phénomène, appelé «tolérance diviser&quot;, a apporté un changement de paradigme dans la recherche VCA avec davantage l&#39;accent sur la composante de la peau hautement immunogène, qui est une partie intégrante de la majorité des greffes de reconstruction menées à ce jour. Dans ce modèle modifié, nous utilisons une anastomose bout-à-bout par ligating destinataire artère fémorale et le faisant tourner en direction céphalique (Figure 1). Ceci réduit non seulement le temps d&#39;ischémie en permettant l&#39;utilisation d&#39;un dispositif de couplage conventionnel, mais diminue aussi les risques d&#39;échec anastomotique. Nous n&#39;avons pas observé d&#39;événements ischémiques suivants ligature de l&#39;artère fémorale dans nos bénéficiaires indiquant que la circulation collatérale était suffisante pour assurer la vascularisation de la jambe d&#39;origine. En outre, dans ce procédé modifié, le composant de peau est extériorisée mobilisé sur la base des vaisseaux perforants sous-jacents et est positionné latéralement (figure 1), contrairement à une position ventrale de l&#39;aine dans le modèle traditionnel 10. Cela permet une visualisation facile de la greffe pour la surveillance immunitaire dans une position debout ou assise de l&#39;animal. Ainsi, un modèle fiable et reproductible grands animaux est essentiel d&#39;étudier les stratégies d&#39;induction de tolérance à l&#39;égard de la composante de la peau de VCA et à développer de nouveaux nstratégies de surveillance immunitaire oninvasive pour une meilleure prédiction de la survie du greffon.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>HTK</td><td>Custodial</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Electric Pen</td><td>Drive Synthes, Westchester PA 05.001.011</td><td></td><td>Scie alternative</td></tr><tr><td>Dispositif de couplage vasculaire</td><td>Synovis, Newtown PA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

un heterotopic porcine hind membre transplant modèle modifié translationnelle vascularisé composite allotransplantation (vca) de recherche

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularisé composite Allotransplantation (VCA), tels que les greffes de mains et le visage représente une option de traitement viable pour les traumatismes musculo-squelettiques complexes et la perte de tissu dévastateur. Malgré les résultats fonctionnels favorables et très encourageants début et intermédiaires, le rejet de la composante de la peau hautement immunogène d&#39;un VCA et les effets indésirables potentiels de l&#39;immunosuppression chronique multi-drogue continuent d&#39;entraver l&#39;application clinique généralisée de VCA. Par conséquent, la recherche dans ce nouveau domaine doit se concentrer sur les études translationnelles sont liés aux caractéristiques immunologiques uniques de VCA et de développer de nouvelles stratégies immunomodulatrices pour l&#39;immunomodulation et l&#39;induction de tolérance suivants VCA sans la nécessité d&#39;immunosuppression à long terme. Cet article décrit un modèle de grand animal de translation fiable et reproductible de VCA qui est composé d&#39;un volet ostéo dans un porc hétérotopique membres postérieurs allogreffe MHC-défini. BriEfly, une palette bien vascularisé peau est identifié dans la région de la cuisse antéro utilisant près angiographie laser infrarouge. Les muscles sous-jacents, l&#39;articulation du genou, le fémur distal et le tibia proximal sont récoltées sur un pédicule vasculaire fémoral. Cette allogreffe peut être considéré comme à la fois une EVC et une greffe de moelle osseuse vascularisée avec ses caractéristiques immunitaires privilégiés uniques. Le greffon est transplanté dans une poche sous-cutanée abdominale de l&#39;animal receveur avec un composant de la peau extériorisé dans la région dorso-latérale de la surveillance immunitaire. Trois équipes chirurgicales travaillent simultanément d&#39;une manière bien coordonnée pour réduire l&#39;anesthésie et les temps d&#39;ischémie, améliorant ainsi l&#39;efficacité de ce modèle et de réduire les facteurs de confusion potentiels dans les protocoles expérimentaux. Ce modèle sert de bases de futures stratégies thérapeutiques visant à réduire et éventuellement éliminer la nécessité d&#39;une immunosuppression chronique multi-drogue en VCA.

Vingt-quatre hétérotopiques greffes des pattes postérieures porcs SLA définis ont été réalisées en utilisant notre technique modifiée avec un temps d&#39;ischémie moyenne de 78 min (Range: 62-94 min). Greffon encastré et dorsolatéral positionnement de palette de peau ont été atteints sans difficulté à tous les animaux. Près angiographie laser infrarouge a montré une excellente perfusion du greffon dans tous les destinataires. Les douze premiers anastomoses veineuses ont été effectuées en utilisant des techniques de sutu...

Vascularisé composite allotransplantations (VCA) sont devenus une réalité clinique. Cependant, une large application clinique de VCA est limitée par l&#39;immunosuppression chronique multi-drogue. Les auteurs présentent un modèle animal grand fiable et reproductible de traduire de nouvelles stratégies immunomodulateurs qui peuvent réduire ou potentiellement éliminer le besoin de l&#39;immunosuppression en VCA.

Un Heterotopic porcine Hind Membre Transplant modèle modifié translationnelle vascularisé composite Allotransplantation (VCA) de recherche

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'établir un modèle translational fiable et reproductible sur grand animal de transplantation de membre inférieur contenant une moelle osseuse vascularisée intacte, afin d'étudier les résultats immunologiques de protocoles immunomodulateurs cliniquement pertinents. Cela est réalisé en prélevant d'abord un lambeau ostéomyocutané pour étudier les caractéristiques immunologiques uniques de la composante cutanée de la greffe composite vascularisée (VCA) conjointement avec la moelle osseuse vascularisée. Ensuite, l'allogreffe est transplantée dans une poche sous-cutanée de la paroi abdominale, ce qui en fait un modèle techniquement réalisable sans entraver la locomotion du receveur.Ensuite, la composante cutanée est extériorisée vers la paroi abdominale dorsolatérale afin de surveiller la greffe par inspection visuelle directe de l'animal en position debout. Les résultats montrent qu'il s'agit d'un modèle fiable et reproductible pour tester des protocoles immunomodulateurs cliniquement pertinents utilisant des thérapies cellulaires et des agents biologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles existants, tels que les modèles canins et de primates non humains de la greffe vasculisée composite (VCA), est qu'elle est plus rentable, comporte le risque le plus faible d'infection zoonotique et bénéficie de souches de donneurs et de receveurs définies par l'antigène leucocytaire porcin (SLA).Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transplantation reconstructive concernant la particularité unique de privilège immunitaire de la moelle osseuse vascularisée, et ouvrira la voie au développement d'un protocole immunomodulateur cliniquement pertinent qui minimise l'immunosuppression. Nous avons d'abord développé l'idée de ce modèle de greffe en testant l'immunogénicité de divers composants d'une allogreffe de membre et en démontrant le phénomène de tolérance séparée il y a près de deux décennies. Avant la récolte du membre allogreffé, le porc donneur est sédaté et raccordé à un ventilateur afin d'administrer de l'isof, du fluor et de l'oxygène tout au long de l'intervention.Après avoir rasé, lavé et désinfecté le site chirurgical, placez l'animal donneur en position supine sur la table d'opération et recouvrez-le d'un champ stérile. Ensuite, utilisez l'angiographie laser infrarouge proche pour identifier les perforants de la peau intermédiaire. Puis, injectez du vert d'indocyanine en solution saline par voie d'accès vasculaire périphérique.Environ 10 secondes plus tard, effectuez un enregistrement en lumière infrarouge proche pendant 30 secondes à deux minutes. Ensuite, en fonction des perforants identifiés, délimitez une zone cutanée destinée à un lambeau cutané qui sera utilisé ultérieurement pour la surveillance immunitaire. Après avoir vérifié la profondeur de l'anesthésie chez l'animal à l'aide des réflexes palpébral et de pincement des orteils, utilisez un scalpel pour réaliser une incision cutanée au niveau de l'aine, en prolongeant les repères tracés pour le lambeau cutané, puis disséquez la peau et le tissu sous-cutané tout en préservant la zone de peau du lambeau.Recoudre les bords de la peau aux muscles sous-jacents afin d'éviter toute contraction pendant la récolte du lambeau. Ensuite, identifier les vaisseaux fémoraux et les isoler proximalement jusqu'au niveau du ligament inguinal. Liger les branches distalement jusqu'au niveau du paddle cutané pour obtenir une longueur optimale de quatre centimètres ; à l’aide d’une scie oscillante, pratiquer une ostéotomie juste au-dessus de l’articulation de la cheville.Ensuite, utilisez l'électrocoagulation pour diviser les muscles de la cuisse proximale. Sectionnez le fémur du donneur au niveau du tiers médian de la diaphyse, en laissant un lambeau ostéomyocutané sur une palette cutanée vascularisée. Ce lambeau contient la palette cutanée, les muscles sous-jacents de la cuisse, le fémur inférieur et l'articulation du genou, le tibia supérieur, et donc une moelle osseuse vascularisée intacte.En raison de ses caractéristiques immunologiques uniques, maintenir le greffon du donneur perfusé par son pédicule vasculaire jusqu'à ce que les vaisseaux fémoraux du receveur soient prêts. Immédiatement après l'initiation de l'incision sur le donneur, connecter le porc receveur à un ventilateur et commencer l'anesthésie à l'isoflurane, comme démontré avec le porc donneur. Insérer un cathéter pour l'administration de sérum physiologique et administrer de la buprénorphine préemptive ainsi que des antibiotiques prophylactiques.Placer l'animal en position supine avec une bonne exposition de la surface latérale dorsale et vérifier le niveau d'anesthésie. Ensuite, pratiquer une incision inguinale afin d'exposer les vaisseaux fémoraux et les isoler sur trois à quatre centimètres, en direction distale et proximale par rapport au niveau du ligament inguinal. Puis créer une poche sous-cutanée allant de l'aine jusqu'à la paroi abdominale latérale dorsale pour l'insertion de la greffe.Procédez maintenant à la ligature des vaisseaux donneurs et utilisez une solution d'histidine, de tryptophane, de cétoglutarate ou solution HTK pour rincer le tissu greffé. Si c'est la dernière récolte effectuée sur le donneur, euthanasiez immédiatement l'animal conformément au protocole animalier afin de réaliser l'insertion de la greffe. Positionnez-la de manière inversée de sorte que l'extrémité coupée du fémur soit orientée vers le bas, permettant ainsi une anastomose sans tension sur les vaisseaux à l'aide d'un dispositif de couplage vasculaire.Si possible, préparez une anastomose veineuse. Le dispositif réduira considérablement la durée de l'ischémie. Ensuite, à l'aide de fils 8/0 et d'une technique de suture conventionnelle, réalisez une anastomose artérielle après avoir confirmé la perméabilité vasculaire.Utilisez trois sutures OPDS pour fixer la greffe en place en suturant les muscles de la greffe aux muscles de la paroi abdominale du receveur afin de permettre la surveillance immunitaire. Externez le lambeau cutané sur le côté dorsolatéral. Ensuite, sutures les couches profondes à l’aide de trois sutures Vicryl et fixez le tissu à la peau du receveur à l’aide de quatre sutures cutanées continues absorbables monofilament. Enfin, fermer la peau de l'aine par couches à l’aide de trois points de suture sous-cutanés en Vicryl 4-0, suivis de quatre points de suture cutanés interrompus en monofilament absorbable 4-0. Pour l’analgie postopératoire, appliquer un patch de fentanyl de 50 microgrammes par heure sur l’animal une fois qu’il est réveillé et respire confortablement de manière autonome.Retournez l'animal dans son enclos et laissez-le manger et boire à volonté. Surveillez l'animal toutes les quatre heures pendant les 24 premières heures pour détecter tout signe de douleur ou de détresse, puis deux fois par jour. Dix-neuf transplantations hétérotopiques de membres postérieurs chez des porcs définis pour le CMH ont été réalisées à l'aide de notre technique modifiée.Ces greffes ont été réalisées dans le but de développer des stratégies thérapeutiques visant à induire une tolérance immunitaire dans les allogreffes de tissus composites vascularisés (VCA). Ce modèle a été utilisé avec succès pour élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'obtenir une tolérance immunitaire dans les VCA avec un rejet à long terme. Les groupes témoins, non traités, ont présenté un rejet accéléré de la greffe après l'arrêt de l'immunosuppression conventionnelle. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en une à deux heures pour chaque membre donneur et de deux à trois heures pour chaque intervention chez le receveur, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le membre controlatéral du donneur est transplanté dans la poche de la paroi abdominale du receveur de telle sorte que le membre droit est greffé dans l'aine gauche et vice versa, après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transplantation reconstructive pour explorer de nouveaux protocoles immunomodulateurs capables de réduire au minimum la nécessité d'une immunosuppression à vie et, par conséquent, d'améliorer le rapport bénéfice-risque de cette modalité innovante. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des aspects techniques de la greffe hétérotopique de membre postérieur contenant une moelle osseuse vascularisée intacte. Ce modèle fiable et reproductible de transplantation de membre ouvrira la voie au développement de nouveaux protocoles immunomodulateurs permettant de réduire, voire d'éliminer potentiellement, la nécessité d'une immunosuppression chronique à base de plusieurs médicaments.

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