Name: Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Découvrez une méthode simple pour induire la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) in vitro dans diverses lignées cellulaires humaines. Cette technique permet d'analyser les changements morphologiques et d'expression de marqueurs par immunocytochimie.

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Les auteurs tiennent à remercier Julia Hatler et Martin Ramsden (R &amp; D Systems) pour une discussion utile et évaluation des manuscrits.

Une. L&#39;induction de l&#39;EMT <ol><li> Des milieux de culture chaud à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Le milieu de culture utilisé est le même que les supports utilisés pour la culture standard de vos cellules d&#39;intérêt. Par exemple, la ligne de poumon de cellules de carcinome humain A549 est cultivé en F12 de Kaighn supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et de la glutamine 2 mM. </li><li> Récolte de cellules d&#39;intérêt en utilisant une solution de dissociation (par exemple TrypLE Express). </li><li> Suspendre les cellules dans un milieu de culture préchauffé dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant en le versant dans un conteneur à déchets. </li><li> Suspendre le culot cellulaire dans un milieu de culture préchauffé. </li><li> Compter les cellules viables à l&#39;aide au bleu Trypan. Suppression d&#39;un échantillon de la suspension cellulaire et diluer dans 0,4% solution bleu Trypan. Placer 10 ml de l&#39;échantillon dilué sur un hémocytomètre et compter les cellules viables (cellules qui ne se transforment pas en bleu). Utilisez le nombre de cellules pour déterminer la cellule densité dans votre solution. </li><li> cellules de plaque sur la culture de tissus traités plaques ou flacons de 0,9 à 1,0 x 10 4 cellules par cm 2. Par exemple, 0,5 x 10 6 cellules étalées dans une plaque de 100 mm dans des milieux de culture contenant 1X Supplément EMT induisant Media (6 ml de milieu par plaque de 100 mm). </li><li> Cellules plaqué Culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. Surveillance de la morphologie des cellules quotidien. </li><li> Trois jours après l&#39;étalement, retirer le support et la remplacer par un milieu de culture préchauffé frais contenant Supplément 1X EMT induisant des médias. Continuer de culture dans un rapport C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. </li><li> Cinq jours après l&#39;étalement, les cellules sont prêtes pour l&#39;analyse. La morphologie cellulaire est visualisé par microscopie optique inversé. </li></ol> 2. Analyse de l&#39;expression des protéines par immunocytochimie <ol><li> Préparer des lamelles stériles de 12 mm pour une plaque de 24 puits en plaçant des lamelles dans une boîte de Pétri contenant 95% d&#39;éthanol. Retirez délicatement les lamelles dans de l&#39;éthanol nousment une aiguille et pince courbe et flamme stériliser. Placez lamelle stérile dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits. Répéter l&#39;opération avec les lamelles restantes. </li><li> Préparer la suspension cellulaire comme décrit dans la section 1.1 à 1.7. </li><li> Plate 1,6 x 10 4 cellules / puits dans 0,5 ml de milieu de culture préchauffé contenant Supplément 1X EMT induisant des médias. </li><li> Développer et nourrir les cellules comme décrit dans les sections 1.9 à 1.11. </li><li> Cinq jours après l&#39;étalement, retirer le support et fixer les cellules avec 300 pl / puits de 4% de paraformaldéhyde dans 1X tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Retirer fixateur et rincer les cellules 2x avec du PBS 1X, 500 pl / puits. </li><li> Incuber les cellules dans 400 ul / puits de tampon de blocage (PBS 1X contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 10% de sérum d&#39;âne normal, et 0,3% de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps primaire aux fabricants recommandé concentration dans 400 pl / puits de tampon de blocage pendant 3 heures à la salle température ou une nuit à 4 ° C. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un anticorps primaire directement conjugué à un fluorochrome, incuber les échantillons à l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules trois fois dans 500 pl / puits de PBS 1X contenant 0,1% de BSA pendant 5 minutes à chaque lavage. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un anticorps primaire directement conjugué à un fluorochrome, passez directement à l&#39;étape 2.12. </li><li> Incuber les cellules à un anticorps secondaire à la concentration recommandée par le fabricant dans 400 pl / puits de PBS 1X contenant 1% de BSA pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules trois fois dans 500 pl / puits de PBS 1X contenant 0,1% de BSA pendant 5 minutes à chaque lavage. </li><li> Si vous le souhaitez, les noyaux avec DAPI contre-colorer. </li><li> Rincer les cellules dans de l&#39;eau déminéralisée et de montage des lamelles face vers le bas sur une lame en utilisant les médias de montage. </li></ol>

<ol><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
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<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

R &amp; D Systems, Inc. est une société publique à but lucratif. La production et le libre accès à cet article est parrainé par R &amp; D Systems, Inc.

Les méthodes précédentes pour EMT induction ont généralement utilisé stimulation TGF-β ou de la modification génétique. Bien que le TGF-β seul a été représenté pour induire EMT dans certains types cellulaires, il a maintenant été démontré que le TGF-β est nécessaire pour EMT, mais elle n&#39;est pas suffisante dans tous les types cellulaires 6,14. Utilisation de la modification génétique pour EMT induction prend du temps et de main-d&#39;œuvre. La méthode décrite ici utilise une combinaison de facteurs, y compris, la E-cadhérine anti-humain, sFRP-1 anti-humain, DKK-1 anti-humain, Wnt-5a humaine recombinante, et TGF-β1 humain recombinant pour induire de manière fiable EMT. Cette combinaison de facteurs est conçu pour bloquer l&#39;adhésion sur la base E-cadhérine, une étape cruciale pour EMT induction 4, et d&#39;améliorer la signalisation Wnt en ajoutant la protéine Wnt-5a ainsi que l&#39;utilisation des anticorps bloquant les inhibiteurs de Wnt, sFRP-1 et Dkk -1. Wnt et la signalisation du TGF-β se sont révélés agir dans une boucle autocrine pour induire et maintenir la stat des cellules mésenchymateusese 6. Cette méthode permet d&#39;éviter l&#39;induction d&#39;une manipulation génétique et est plus efficace que d&#39;utiliser le TGF-β seuls. Fait important, nous sommes en mesure d&#39;observer l&#39;induction de l&#39;EMT dans des types cellulaires, y compris les cellules MCF7 et des cellules PANC-1, qui ont été précédemment montré non seulement de répondre à la stimulation de TGF-β (figure 5) 14. Les cellules traitées avec le Supplément spectacle EMT induisant Media morphologie fusiforme moins compact et augmenté (figure 1). En outre, il existe une diminution de l&#39;expression de surface E-cadhérine concurrente avec une augmentation de l&#39;expression de la fibronectine, qui sont caractéristiques d&#39;EMT (figures 2 et 3). Marqueurs mésenchymateuses supplémentaires tels que des escargots et vimentine sont également régulés à la hausse dans les cellules induites EMT que par rapport aux témoins non induites (figure 4). Migration et l&#39;invasion des capacités accrus sont les principales caractéristiques fonctionnelles des cellules mésenchymateuses. Dans in vitro </em&gt; Migration et l&#39;invasion des essais, les cellules traitées avec le supplément EMT induisant médias ont démontré une capacité accrue de manière significative à migrer et envahir (Figure 6). Cette méthode simple pour EMT induction est utile pour l&#39;étude de la signalisation EMT comme démontré à l&#39;aide des données d&#39;expression de matrice d&#39;anticorps présentés dans la figure 7. Différents types de cellules peuvent être comparées pré-et post-EMT induction pour obtenir les signatures d&#39;expression communs associés à EMT, comme l&#39;augmentation de la CREB phosphorylée et ERK1 / 2 vu dans les deux cellules MCF7 et induit EMT-A549. S133 phosphorylation de CREB et stimule la liaison de l&#39;ADN a été montré à agir en aval de TGF-β1 induit par EMT-15. ERK1 / 2 phosphorylation a également été montré à agir en aval de TGF-β1 induit par EMT-16. Les différences dans les voies de signalisation entre les différents types de cellules peuvent aussi être élucidées comme on le voit avec l&#39;augmentation de la GSK-3β phosphorylation dans les cellules A549 par rapport p70S6K phosphorylation in MCF7. GSK-3β phosphorylation sur la serine 9 diminue elle fonction, et GSK-3β a été montré pour inhiber le facteur de transcription pro-EMT, Snail 17. En revanche, p70S6K induit une activité d&#39;escargot et sa phosphorylation est associée à l&#39;activation de cette protéine 18. Dans l&#39;ensemble, l&#39;induction simple et fiable de EMT, en particulier dans les cellules précédemment indiquées ne pas répondre uniquement à TGF-β, est utile pour comprendre la biologie des EMT, l&#39;identification des signatures d&#39;expression communs pour une utilisation en tant que marqueurs pronostiques, et le développement et l&#39;évaluation de nouveaux traitements pour le cancer et les maladies fibrotiques.

Épithéliales de transition mésenchymateuses (EMT) est le processus par lequel une cellule épithéliale polarisée subit une série de changements résultant dans une cellule très mobiles fibroblaste mésenchymateuses. Ce processus se produit, en partie, par des changements d&#39;expression génique et de la dégradation des jonctions adhérentes, ce qui entraîne une plus grande capacité à migrer et à envahir. Physiologiquement, EMT joue un rôle important au cours du développement embryonnaire et la cicatrisation des plaies. Perte de contrôle adéquat sur ​​EMT peut conduire à la fibrose et les métastases des cancers 1,2. La réduction de la E-cadhérine à la surface des cellules épithéliales est une étape critique dans la progression d&#39;une cellule dans EMT 3,4. La E-cadhérine est une protéine transmembranaire à passage unique qui interagit directement avec les protéines de cadhérine sur les cellules adjacentes. En plus de son rôle dans l&#39;adhésion cellulaire, la E-cadhérine influences de signalisation cellulaire par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions entre la queue cytoplasmique de la E-cadhérine unda variété de protéines régulatrices, notamment β-caténine. β-caténine joue un rôle dans la stabilisation des jonctions adhérentes. Au cours de la signalisation Wnt canonique, β-caténine est libéré de la E-cadhérine et de translocation vers le noyau où elle agit comme un facteur de transcription en aval dans la voie Wnt 3,4,5. Dans le noyau, β-caténine a été démontré que l&#39;augmentation de la transcription de plusieurs facteurs liés à l&#39;EMT-torsion notamment, Slug, la fibronectine, et une variété de métalloprotéases matricielles 3,6. En plus de Wnt, la signalisation du TGF-β a été montré à jouer un rôle important dans l&#39;induction EMT fois au cours du développement normal et dans les Etats malades 7,8,9. TGF-β est impliqué dans l&#39;EMT qui se produit pendant la formation du voile du palais et dans le cœur en développement 10. Il a également été impliquée dans la fibrose et à la progression du cancer à métastases 7. La procédure décrite ici provides induction uniforme des EMT dans une variété de types de cellules, sans la nécessité d&#39;une manipulation génétique. Cette procédure utilise un cocktail de la E-cadhérine, sFRP-1, et Dkk-1 anticorps bloquants et Wnt-5a et protéines recombinantes TGF-β1. Ce cocktail est conçu pour bloquer E-cadhérine sur la base d&#39;adhérence tout en améliorant Wnt et la signalisation du TGF-β. La capacité de robuste EMT induction est essentiel pour la compréhension de la biologie de ce processus et comment le manipuler à des fins thérapeutiques. Marqueurs communs actuels de EMT, la E-cadhérine (downregulated dans EMT) et la vimentine (régulés à la hausse dans EMT), peuvent être trouvés co-exprimé dans les cancers et donc ne fournissent pas les meilleurs marqueurs de diagnostic de cellules métastatiques potentiels 12. Fait important, l&#39;analyse d&#39;une variété de types de cellules qui ont subi EMT est utile de développer des signatures d&#39;expression des gènes communs qui peuvent être utilisés à des fins diagnostiques dans le cancer et la fibrose 11. En outre, des études récentes ont démontré que EMT peut jouer un rôle dans la formation des cellules souches cancéreuses, ce qui suggère que les cellules qui ont subi EMT peuvent être utiles pour le criblage de médicaments pour identifier des composés qui peuvent cibler ces cellules 13.

<table><tbody><tr><td>Cellules épithéliales d’intérêt</td><td></td><td></td><td>Nous avons testé : A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 et PANC1</td></tr><tr><td>EMT Inducting Media Supplement</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>TGF humain recombinant-&#946 ; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B</td><td>Utilisé à 10ng/ml</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadhérine NL557 anticorps conjugués</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Utilisé à une dilution de 1:10 pour l’immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadhérine </td><td>R& D Systems</td><td>MAB1838</td><td>Utilisé à 0,1 &mu ; g/ml pour Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1918</td><td>Utilisé à 10 &mu ; g/ml pour l’immunocytochimie ; Utilisé à 0,5 &mu ; g/ml pour western blot</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>Utilisé à 0.2 &mu ; g/ml pour Western blot</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-souris NL493 Anticorps secondaire</td><td>R& D Systems</td><td>NL009</td><td>Utilisé à une dilution de 1:200 pour l’immunocytochimie</td></tr><tr><td>Âne Anti-chèvre HRP Anticorps secondaire</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>Utilisé à 1:2000 pour le western blot</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-souris HRP Anticorps secondaires</td><td>R& D Systems</td><td>HAF007</td><td>Utilisé au 1:2000 pour le western blot</td></tr><tr><td>EMT Kit d’immunocytochimie 3 couleurs</td><td>R& D Systems</td><td>SC026</td><td>Utilisé selon le fabricant' . Ce kit contient des anticorps directement conjugués contre l’E-cadhérine, la Vimentine et l’escargot.</td></tr><tr><td>96 puits BME Cell Invasion Assay</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Ce kit a été utilisé conformément aux recommandations du fabricant.</td></tr><tr><td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td><td>R& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Ce kit a été utilisé conformément aux recommandations du fabricant 19.</td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypan Blue Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X Phosphate Tamponné Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % d’éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td><td>Diluer dans 1X PBS pour obtenir une solution mère à 10</td></tr> % <tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluer dans 1X PBS à une concentration de travail de 4 %.</td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Préparer une solution mère à 14,3 mM en la dissolvant dans l’eau. La solution de travail est une dilution de 1:5000 de la solution mère dans 1X PBS.</td></tr><tr><td>Pince incurvée fine et pointue</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>Lait</td><td></td><td></td> écrémé en poudre <td>Utilisé à 5 % en TBST pour le blocage en western blot</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,1 % Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Pour le blocage et le lavage par western blot</td></tr><tr><td>Membrane</td><td></td><td></td> <td>PVDFPour le western blot </td></tr><tr><td>4-20 % SDS-page gel</td><td></td><td></td><td>Pour le western blot</td></tr><tr><td>Substrat</td><td></td><td></td> ECL <td>Pour le western blot</td></tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td><td></td>coniques de 15 ml</tr><tr><td>Plaques/flacons, traités pour culture</td><td></td><td></td><td></td>tissulaire</tr><tr><td>Plaques 24 puits, culture tissulaire traitée</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes / pointes</td><td></td> <td>de pipette</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette / pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C/5 %CO2 Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>à<td>lumière inversée</td></tr><tr><td>Microscope à</td><td></td><td></td><td></td> fluorescence</tr></tbody></table>

induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Épithéliales de transition mésenchymateuses (EMT) est essentiel pour la morphogenèse correcte au cours du développement. Une mauvaise régulation de ce processus a été impliqué comme un événement clé dans la fibrose et la progression des cancers à un état métastatique. Comprendre les processus qui sous-tendent EMT est impératif pour le diagnostic précoce et le contrôle clinique de ces états pathologiques. Fiable induction de EMT in vitro est un outil utile pour la découverte de médicaments, ainsi que d&#39;identifier des signatures d&#39;expression génique communes à des fins de diagnostic. Ici, nous démontrons une méthode simple pour l&#39;induction de l&#39;EMT dans une variété de types de cellules. Méthodes d&#39;analyse de cellules pré-et post-EMT induction par immunocytochimie sont également inclus. En outre, nous démontrons l&#39;efficacité de cette méthode à travers l&#39;analyse de réseau à base d&#39;anticorps et des essais de migration / invasion.

. L&#39;EMT induisant des conditions de culture décrites ici fournissent une méthode robuste pour l&#39;induction de l&#39;EMT dans une variété de types de cellules figures 1 et 2 montrent la morphologie et les niveaux d&#39;expression de marqueur de 4 lignes cellulaires humaines: cellules de glioblastome T98G, des cellules HT29 d&#39;adénocarcinome du côlon , des cellules de carcinome du poumon A549 et MCF10A cellules épithéliales mammaires. Les cellules qui ont été traités avec le supplément EMT induisant médias ont changé de morphologie classique épithéliale (Figures 1A - 1D) à un mésenchymateuses, morphologie fusiforme (figures 1E - 1H). Cellules EMT-induites sont apparus moins dense en colonies serrées par rapport aux cellules non induites. Échantillons non induit MCF10A contenues grappes serrées entourées par des cellules plus tassées. Ces grappes serrées étaient la E-cadhérine positif (figure 2D) et ont disparu lors d&#39;un traitement avec l&#39;EMT induisant médias Supplement (figure 2H). EMT a également été évaluée par la régulation négative de marqueurs épithéliaux et la régulation positive des marqueurs mésenchymateuses. La régulation à la baisse de l&#39;expression de la E-cadhérine est typiquement observée après EMT induction dans des types 3,4 cellulaires différentes La figure 2 montre l&#39;expression de surface de la E-cadhérine dans la majorité des cellules non traitées (figures 2A - 2D; rouge). Par rapport à son absence, après induction EMT (figures 2E - 2H, rouge). Une lignée cellulaire, T98G, s&#39;est révélé avoir un très faible niveau de base de la E-cadhérine avant EMT induction, ce qui a empêché son analyse. La régulation positive du marqueur mésenchymateuses, fibronectine, est également visible après induction avec le supplément EMT induisant Media (Figures 2A - 2D par rapport figures 2E - 2H; vert). Les niveaux de la E-cadhérine et la fibronectine expression vus par immunocytochimieont en outre été confirmée par Western blot de lysats de cellules totales (Figure 3). Le western blot a confirmé la régulation négative de la E-cadhérine et de la régulation positive de l&#39;expression de la fibronectine vu par immunocytochimie. Les bandes ont été quantifiés par densitométrie et normalisée de GAPDH à déterminer par rapport facteur de variation suivant EMT induction. Niveaux E-cadhérine ont été réduits de 6,4 et 3,4 fois en A549 et les cellules MCF10A, respectivement. niveaux de la fibronectine ont été augmenté de 4,6, 4,1, et 2,3 fois dans T98G, A549, et les cellules MCF10A, respectivement. Bien que le transfert de western ne montre pas de réduction significative des niveaux de protéine E-cadhérine dans les cellules HT29 à induction post-EMT, les résultats d&#39;immunocytochimie démontrent une réduction de l&#39;expression de surface de la E-cadhérine (Figure 2B par rapport à 2F), qui est incapable de se distinguer en Western blot de lysats de cellules totales. Pour mieux évaluer l&#39;état de EMT, marqueur connue supplémentairess pour EMT ont été analysés avant et après-EMT induction. En accord avec les résultats précédents, la E-cadhérine a été régulée à la baisse dans toutes les lignées cellulaires examinées, ce qui indique que EMT a été induite. En outre, les marqueurs mésenchymateuses, vimentine et escargot, ont été régulés à la hausse dans A549, T98G, et les cellules MCF10A après un traitement avec supplément EMT induisant Media (Figure 4). La lignée cellulaire HT29 n&#39;a pas montré d&#39;expression de ces marqueurs mésenchymateuses, avec ou sans induction EMT (données non présentées), ce qui pourrait indiquer que ces cellules utilisent des voies alternatives pour EMT induction. Bien que le TGF-β est suffisante pour induire EMT dans certains contextes 7,8,9 cellule, d&#39;autres types de cellules ne répondent pas à la seule addition de TGF-β 14. MCF7 cellules de cancer du sein humaines PANC-1 et des cellules de carcinome pancréatique humain sont tous deux signalés ne pas répondre à la signalisation du TGF-14 seul β. Pour déterminer si les deux lignes pourraient subir EMT dans vitro, les cellules ont été cultivées en présence du supplément EMT induisant des médias. Les cellules ont été stimulées avec du TGF-β1 recombinant seul, à la concentration dans le supplément EMT induisant des médias. Ces cellules conservent leur morphologie épithéliale, composée de colonies serrées de cellules (données non présentées) et les niveaux E-cadhérine surface ont été similaires à ceux observés dans les cellules témoins (figures 5C et 5D contre les figures 5A et 5B). En revanche, les cellules stimulées par le supplément EMT induisant médias ont montré une diminution drastique des niveaux E-cadhérine surface (figures 5E et 5F). Ces cellules ont également obtenu une morphologie plus mésenchymateuses, les cellules sont devenues moins compact et plus broche-like (données non présentées). Ces résultats démontrent que la méthode EMT induire décrit ici est capable de promouvoir l&#39;expression EMT morphologie et des changements des marqueurs dans les cellules en général résistants à TGF-β-iEMT nduced. En plus des changements dans l&#39;expression des marqueurs, une autre caractéristique des cellules mésenchymateuses est leur capacité à migrer et envahir. Migration et l&#39;invasion des cellules cultivées avec ou sans le supplément EMT induisant des médias ont été analysées en utilisant le 96 et BME invasion cellulaire dosage selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits (50 000 cellules / puits) contenant des inserts de filtres avec 8,0 um pores. Après 48 h, la migration a été évaluée par calcéine AM coloration des cellules qui avaient migré à travers le filtre. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires deux fois avec des résultats similaires. Des résultats représentatifs de l&#39;une expérience sont présentés sur la figure 6A. Augmentation statistiquement significative (valeur p &lt;0,003) dans la migration cellulaire ont été observés avec les deux A549 et PANC-1 cellules après induction EMT. Pour évaluer la capacité de ces cellules à envahir (c.-à migrer à travers la matrice extracellulaire), le même essai a étéeffectuée avec un filtre de l&#39;extrait revêtu membrane basale. EMT-induite des cellules ont montré une (valeur P &lt;0,001) augmentation statistiquement significative des capacités d&#39;invasion par rapport aux cellules non traitées comme on le voit sur ​​la figure 6B. L&#39;induction robuste de EMT est utile pour l&#39;analyse des changements d&#39;expression des gènes et la signalisation qui ont lieu dans ces cellules. L&#39;analyse de la matrice à base d&#39;anticorps en utilisant des lysats de cellules à la fois traitées et non traitées est une méthode pour analyser les niveaux d&#39;une variété de molécules d&#39;expression dans un seul échantillon. A titre d&#39;exemple, nous avons analysé les niveaux de membres de la famille MAPK phosphorylée dans des lysats de non-induite et EMT induite cellules MCF7 et A549 en utilisant le kit de tableau du protéome humain Profiler Phospho-MAPK. La matrice a été exécutée deux fois à partir de traitements EMT-induction indépendantes avec des résultats similaires. Figure 7 montre les données représentatives d&#39;une matrice. Les deux types de cellules présentaient une augmentation de la phosphorylation de la protéine CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), et ERK2 (T185/Y187) dans des cellules EMT-induites comparées à des témoins. Les différences dans les événements de signalisation ont été observées entre les deux types cellulaires aussi bien. Les cellules A549 ont montré une augmentation de la GSK-3 β (S9) la phosphorylation, alors que les cellules MCF7 ont montré une augmentation p70S6K (T421/S424) phosphorylation. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 1. Mésenchymateuses morphologie induction après stimulation par le supplément EMT induisant Media (A - D). Morphologie épithéliale dans les types cellulaires quatre indiquée ci-dessous 5 jours de culture dans des milieux de culture standard sans supplément EMT induisant Media (E - H). Morphologie mésenchymateuses dans le quatre types de cellules indiqué cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. nt &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 2. La régulation négative de l&#39;expression du marqueur épithélial et la régulation positive de l&#39;expression du marqueur mésenchymateux dans des cellules EMT-induits. Cellules ont été colorées par immunofluorescence pour détecter l&#39;expression du marqueur épithélial, la E-cadhérine (rouge), et le marqueur mésenchymateux, la fibronectine (vert). (A - D) des cellules cultivées sans supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours de contrôle (E - H.) Les cellules cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Toutes les cellules sont DAPI (bleu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Confirmation de l&#39;expression du marqueur épithélial et mésenchymateuses avec un Western blot<html> . alysis Western blot de lysats totaux de cellules de types cellulaires quatre indiqué, traité avec (EMT) ou sans (-) le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Bandes pour la E-cadhérine, la fibronectine, et le contrôle GAPDH de chargement sont indiquées sur la gauche. Le marqueur de taille est indiquée sur la droite. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. La régulation positive des marqueurs mésenchymateux, la vimentine et Snail dans les cellules EMT-induits. Cellules ont été colorées par immunofluorescence multicolore pour détecter l&#39;expression du marqueur épithélial, la E-cadhérine (gris), et les marqueurs mésenchymateux, la vimentine (vert) et d&#39;escargot (rouge) Les cellules témoins cultivées sans le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. - (C A). (D - F) Les cellules cultivées avec le supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. oujours &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figure 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figure 5. L&#39;induction de l&#39;EMT dans des cellules non sensibles au TGF-β1. (A et B) Les cellules cultivées avec le milieu seul pendant 5 jours. (C et D) Les cellules cultivées dans un milieu contenant 10 ng / ml de TGF-β1 pendant 5 jours. (E et F) les cellules cultivées en supplément EMT induisant des médias pendant 5 jours. Toutes les cellules sont colorées pour l&#39;expression E-cadhérine (rouge) et DAPI (bleu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Cellules induite EMT-ont augmenté les capacités de migration et d&#39;invasion. A. Nombre moyen de cellules qui ont migré à travers un filtre de pores de 8 pm après incubation pendant 48 heures. B. Effectif moyen decellules qui étaient capables d&#39;envahir à travers un filtre à pores de 8 um revêtue d&#39;un extrait de la membrane basale après une incubation de 48 h. Les barres d&#39;erreur indiquent l&#39;écart-type sur trois puits. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Base-Anticorps Figure 7. Tableau analyse de l&#39;expression des EMT induction. Lysats de A549 (A et C) et MCF7 (B et D) des cellules en culture avec ou sans supplément EMT induisant des médias ont été utilisés pour l&#39;analyse de réseau en utilisant le kit de tableau du protéome humain Profiler Phospho-MAPK. Spots mis en évidence dans A et B ont ensuite été quantifiés par densitométrie. Les comparaisons des lysats à EMT-induites non induits sont présentés dans les graphiques à barres correspondant ci-dessous (C et D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure &lt;</a>/ A&gt;.

Une méthode simple est décrit pour l&#39;induction de la transition épithélio mésenchymateuse (EMT) dans une variété de types de cellules. Méthodes d&#39;analyse de cellules dans les Etats EMT par immunocytochimie sont inclus.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode simple et reproductible pour induire une transition épithélio-mésenchymateuse, ou EMT, in vitro. Cela est réalisé en premier lieu en ensemencant le type cellulaire épithélial d'intérêt en présence d'un supplément de milieu inducteur d'EMT. La deuxième étape de la procédure consiste à remplacer le milieu de culture par un milieu frais contenant le supplément de milieu inducteur d'EMT, trois jours après l'ensemencement initial.La dernière étape consiste à récolter les cellules cinq jours après le semis initial pour une caractérisation ultérieure, telle qu'une immunomarquage. En fin de compte, les résultats peuvent montrer que les cellules acquièrent des caractéristiques mésenchymateuses par microscopie optique, cytochimie immunohistochimique, analyse par matrice de western blot ou toute autre procédure d'analyse au choix. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la stimulation par TGF bêta ou la modification génétique sont qu'elle est rapide et facile, contrairement à la modification génétique, et qu'elle permet l'induction d'EMT dans une variété de types cellulaires, dont certains pourraient ne pas répondre uniquement à la stimulation par TGF bêta.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des métastases cancéreuses. Cette méthode permet aux chercheurs de développer des signatures d'expression communes aux cellules métastatiques pouvant être utilisées pour le diagnostic. Elle fournit également des cellules pouvant être utilisées pour le criblage de médicaments.Commencez par réchauffer le milieu de culture des cellules d'intérêt à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Ensuite, récoltez les cellules à l'aide d'une solution de dissociation, comme la triple E express. Puis, suspendez les cellules dans un milieu de culture préchauffé dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez la suspension cellulaire à 400 ×g pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le surnageant en le versant dans un contenant pour déchets et resuspendez le culot cellulaire dans un milieu de culture préchauffé. Comptez maintenant les cellules viables, diluez un échantillon de la suspension cellulaire dans une solution de bleu de Tripan à 0,4 %. Déposez 10 microlitres de l'échantillon dilué sur un hémo-cytomètre et comptez les cellules viables.Cellules viables. Ne deviennent pas bleues après le calcul de la densité cellulaire dans votre plaque de solution. Neuf à 10 000 cellules par centimètre carré dans un milieu de culture préchauffé contenant un supplément de milieu inducteur XEMT, en utilisant des plaques ou des flacons de culture tissulaire traités.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et surveiller leur morphologie quotidiennement à l’aide d’un microscope optique inversé. Trois jours plus tard, remplacer le milieu par un milieu de culture frais préchauffé contenant un supplément de milieu inducteur XEMT. Cinq jours après le semis, les cellules sont prêtes à être analysées.Visualisez la morphologie des cellules au microscope optique inversé. Les cellules peuvent désormais être fixées ou récoltées pour des études ultérieures. Préparez des lamelles stériles de 12 millimètres pour une plaque de 24 puits en plaçant les lamelles dans une boîte de Pétri contenant de l'éthanol à 95 %. Retirez délicatement les lamelles de l'éthanol à l’aide d’une pince courbe.Stérilisez chaque lame au flamme et transférez-la dans un puits d'une plaque de 24 puits. La manipulation des lames requiert de la prudence et de la pratique. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture préchauffé contenant un milieu inducteur XEMT. Complétez avec les cellules et semez 16 000 cellules par puits.Incubez et nourrissez maintenant les cellules comme décrit précédemment. Cinq jours après la mise en culture des cellules, retirez le milieu et fixez-les avec 300 microlitres par puits de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS 1X ; laissez la fixation se poursuivre pendant 20 minutes à température ambiante. Retirez ensuite le fixateur et rincez les cellules deux fois avec 500 microlitres de PBS 1X par puits.Ensuite, incuber les cellules fixées dans 400 microlitres de tampon de blocage par puits pendant une heure à température ambiante. Après application du blocage, préparer l'anticorps primaire à la concentration recommandée par le fabricant dans 400 microlitres de tampon de blocage par puits. Puis retirer la solution de blocage des puits et ajouter le mélange d'anticorps aux cellules.Incubez les cellules pendant trois heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Et si l'anticorps primaire est directement conjugué à un fluorochrome, incubez-les à l'abri de la lumière. Ensuite, retirez l'anticorps primaire et lavez les puits trois fois avec 500 microlitres par puits de PBS 1X contenant 0,1 % de BSA, en laissant chaque lavage durer cinq minutes, et si nécessaire, protégez les cellules de la lumière.Si nécessaire, incubez maintenant les cellules dans un anticorps secondaire à la concentration recommandée par le fabricant. Diluez l'anticorps dans 400 microlitres par puits d'un PBS 1 % BSA. Incubez pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière après une heure.Lavez les cellules trois fois, comme précédemment pour éliminer l'anticorps primaire après les lavages. Si désiré, appliquez une contre-coloration DPI aux cellules. Enfin, rincez les cellules avec de l'eau déionisée et montez les lamelles face vers le bas sur des lames à l'aide d'un milieu de montage.Encore une fois, manipulez soigneusement les lamelles. Les conditions de culture induisant l'EMT fournissent une méthode robuste pour induire l'EMT dans divers types cellulaires. Ceci a été testé sur quatre lignées cellulaires humaines différentes.Les cellules traitées avec le supplément de milieu inducteur de la MTE ont changé d'une morphologie épithéliale classique à une morphologie allongée de type mésenchymateuse. Une double coloration pour l'expression de l'e-cadhérine et de la fibronectine a montré la régulation négative du marqueur épithélial e-cadhérine en rouge et la régulation positive du marqueur mésenchymateux fibronectine en vert. Les échantillons de CF10A non induits présentaient des agrégats densément compacts entourés de cellules plus lâchement organisées. Ces agrégats étaient positifs pour l'e-cadhérine, visualisés en rouge.Les agrégats ont disparu après traitement avec le supplément de milieu inducteur d'EMT. Ceci a coïncidé avec une augmentation de l'expression de la fibronectine en vert. T 98.Il a été constaté que G présentait un niveau basal extrêmement faible de terrine avant l'induction de l'EMT, ce qui a empêché son analyse. Toutefois, avec ce marqueur, les niveaux de fibronectine ont augmenté significativement suite à l'induction de l'EMT dans ces cellules. Les niveaux d'expression de l'e-adhérine et de la fibronectine ont été confirmés ultérieurement par immunotransfert à partir de lysats totaux de cellules.Bien que le western blot ne montre pas de réduction significative des niveaux totaux de la protéine EAD herrin dans les cellules HT 29, une réduction de l'expression membranaire de la terrine observée par immunochimie a été notée afin d'évaluer davantage le statut d'EMT. Les marqueurs mésenchymateux caractéristiques de l'EMT, le menton en vert et le snail en rouge, ont été analysés avant et après l'induction de l'EMT, ce qui est conforme aux résultats précédents. L'Eki, ici en gris, était régulé à la baisse dans toutes les lignées cellulaires examinées, indiquant que l'EMT avait été induite. De plus, une surexpression du snail en rouge et du menton en vert a été observée dans les cellules 5 49 T 98 G et MCF 10 A. Les cellules CCF sept, cellules humaines de cancer du sein, et les cellules PanIN, carcinome pancréatique humain, sont toutes deux décrites comme n'entrant pas en EMT par la seule signalisation du TGF bêta.Ces résultats ont été confirmés à l'aide de la TGF bêta recombinante seule. À la concentration présente dans le supplément du milieu inducteur de la MET, les cellules ont conservé leur morphologie épithéliale et les niveaux d'E cohérente à la surface étaient similaires à ceux des cellules témoins. En revanche, les cellules stimulées avec le supplément du milieu inducteur de la MET ont montré une diminution drastique de leurs niveaux d'E cadhérine à la surface.Ces cellules ont également acquis une morphologie plus mésenchymateuse. Un autre critère caractéristique des cellules mésenchymateuses est leur capacité à migrer et à envahir. Ceci a été analysé à l’aide du test d’intrusion cellulaire BME en plaque de 96 puits.Selon les instructions du fabricant, des augmentations significatives de la migration cellulaire ont été observées avec les cellules 5 49 et les cellules pan un. Après l'induction de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), le même test a été réalisé avec un filtre recouvert d'un extrait de membrane basale afin d'évaluer l'invasion. Les cellules ayant subi l'EMT ont montré une augmentation significative de leurs capacités invasives par rapport aux cellules non traitées.L'induction robuste de l'EMT est utile pour l'analyse des modifications de l'expression génique et des voies de signalisation ayant lieu dans ces cellules. Un tableau d'anticorps commercial utilisant des lysats provenant des cellules MCF seven et a 5 49 a été utilisé pour analyser les niveaux de phosphorylation des membres de la famille des kinases MA. Les deux types cellulaires ont montré une augmentation de la phosphorylation de kreb irk one et irk two dans les cellules induites en EMT par rapport aux témoins.Les cellules A549 ont également montré une augmentation de la phosphorylation de GSK-3β. Les cellules Mc7 ont présenté une phosphorylation accrue de P70S6K en plus de la phosphorylation accrue de Kreb ou 1 et de DIRK2. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'il peut exister une certaine variabilité des résultats selon les types cellulaires, et ce, non pas dans toutes les cellules.Nous utilisons les mêmes voies en aval pour l'induction de l'EMT, ce qui conduit à des différences d'expression des marqueurs entre les types cellulaires. De plus, de nombreux marqueurs de l'EMT ne présentent pas d'états strictement activés ou inactivés et peuvent présenter des niveaux basaux dans les cellules épithéliales. Ces marqueurs peuvent montrer un échange accru de leur localisation lors de la transition mésenchymateuse suite à cette procédure.D'autres méthodes, comme le criblage de médicaments, peuvent être utilisées pour répondre à d'autres questions, par exemple quels composés sont capables de moduler la transition épithélio-mésenchymateuse. Ces composés pourraient être très utiles dans le traitement du cancer et de la fibrose.

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