Protocoles pour l'évaluation des radiofréquences Interactions avec des nanoparticules d'or et les systèmes biologiques pour la thérapie du cancer hyperthermie non invasive

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les propriétés de chauffage des nanoparticules d’or dans un champ électrique de radiofréquence de 13,56 mégahertz, in vitro et in vivo. Pour ce faire, on évalue d’abord la vitesse de chauffage des nanoparticules d’or concentrées et de leur tampon dans un vétérinaire de quartz. La deuxième étape de la procédure consiste à réaliser des études de toxicité in vitro de nanoparticules d’or avec des cellules cancéreuses en culture.

La troisième étape consiste à réaliser des études in vivo de nanoparticules d’or dans un modèle de cancer ectopique de souris. En fin de compte, les résultats peuvent montrer si la nanoparticule étudiée pourrait être un agent efficace à utiliser avec l’hyperthermie médiée par RF grâce à l’analyse des nanoparticules en suspension, in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hypothermie par radiofréquence non invasive médiée par des nanoparticules, telles que l’échauffement est-il dû aux particules elles-mêmes et peut-il être utilisé à des fins thérapeutiques ?

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il n’existe pas beaucoup de protocoles bien établis pour effectuer ce type d’expériences. La démonstration de la procédure sera faite par Cisneros, un assistant de recherche, Stuart Core, un scientifique postdoctoral, et Leila Green, une autre scientifique postdoctorale. À titre d’exemple, commencez avec une bouteille de 500 millilitres de nanoparticules d’or d’un diamètre de cinq nanomètres, disponible dans le commerce.

Prenez environ 125 millilitres de la solution de nanoparticules d’or et répartissez-la entre six tubes filtrants de centrifugeuse de 50 kilodaltons, centrifugez les nanoparticules à 3000 tr/min pendant deux minutes et cinq secondes. Retirez le surnageant, c’est-à-dire le tampon filtré, et remplissez chaque filtre. Avec plus de solution mère.

Poursuivez la centrifusion, retirez le tampon et rechargez les tubes jusqu’à ce que toute la solution de nanoparticules ait été filtrée. Après le dernier ajout, remplacez le tampon filtré par un volume similaire d’eau désionisée et répétez le processus environ huit fois de plus après avoir chargé l’échantillon de tampon filtré dans la machine RF. À l’aide du logiciel de caméra infrarouge, créez des boîtes sur le QVE pour capturer le profil de chauffage Après huit lavages, les données de chauffage du filtrat de nanoparticules d’or de cinq nanomètres se rapprochent de celles de l’eau désionisée.

L’analyse UV-vis peut également être utilisée pour surveiller l’absorption des contaminants. Pics. On voit ici un spectre propre. Une fois que les contaminants tampons ont été complètement éliminés, nous suspendons les nanoparticules dans 0,5 millilitre d’eau désionisée dans les tubes filtrants qui éliminent les nanoparticules du filtre.

Combinez ensuite les six suspensions en un seul tube de 15 millilitres. Maintenant, analysez l’échantillon à l’aide de l’UV, du VIS et du potentiel zêta pour les données de stabilité. Utilisez I-C-P-O-E-S et/ou la spécification de masse ICP pour déterminer la concentration en nanoparticules.

L’analyse MEB et/ou TEM peut également être utilisée pour obtenir des données morphologiques à l’aide d’un système RF du Kansas ou de dérivations de charge, d’une seringue de quartz de 1,3 millilitre, et de régler le champ électrique RF à environ 90 kilovolts par mètre dans l’air où résiderait le Q vete. Pour un échantillon de solution saline standard avec 0,9 % de chlorure de sodium, le champ électrique serait réduit à environ 1,1 kilovolts par mètre. Il s’agit des conditions approximatives utilisées pour permettre des comparaisons entre différents systèmes RF

Maintenant, chargez un vete de quartz propre avec 1,3 millilitre de suspension de nanoparticules d’or purifiées à une concentration de 1000 milligrammes par litre. Exposez l’échantillon au champ RF pendant une période de 120 secondes ou jusqu’à ce que l’échantillon atteigne 70 degrés Celsius. Une surexposition peut entraîner un arc électrique ou une ébullition rapide.

Capturez les données d’imagerie thermique ainsi que les zones de contrôle à l’aide d’une caméra IR et du logiciel associé. Répétez cette procédure trois fois sur le même échantillon. Filtrez maintenant l’échantillon à travers un autre filtre centrifuge de 50 kilodaltons pour extraire les nanoparticules d’or du tampon d’eau.

Ensuite, réexposez le tampon seul au champ RF. Encore une fois, trois fois la différence de hrs entre le colloïde de nanoparticules d’or et le filtrat détermine la HR due aux nanoparticules d’or elles-mêmes. Enfin, nous suspendons les nanoparticules d’or restantes du filtre dans 1,3 millilitre d’eau pour d’autres expériences.

Ces études in vitro peuvent être appliquées à tout type de cellule cancéreuse qui forme des monocouches 2D. Dans cet exemple, les cellules B dérivées du carcinome hépatocellulaire humain seront utilisées sur environ 50 000 cellules. Dans trois puits d’une plaque de 12 puits avec un millilitre de croissance.

Les milieux continuent de charger les cellules jusqu’à ce que trois plaques soient remplies pour l’étude des nanoparticules, et que trois plaques soient remplies comme témoins. Incuber les plaques à 37,5 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, introduisez 0,1 millilitre d’une solution de nanoparticules d’or de 1000 milligrammes par litre dans chaque puits des trois plaques de nanoparticules des plaques de contrôle.

À 0,1 millilitre d’eau dans chacune, incubez bien toutes les plaques pendant encore 24 heures. Après 24 heures supplémentaires, aspirez le milieu cellulaire et lavez-les avec du PBS pour éliminer toutes les nanoparticules d’or liées à la surface. Remplacez ensuite le support de la cellule.

Les cellules sont maintenant prêtes pour l’exposition RF. Placez chaque paquet de cellules de 12 puits dans le champ RF et attendez que les cellules aient refroidi à 31 degrés Celsius. Une fois légèrement refroidies, exposez les cellules à 3,5 minutes de rf.

La température finale du milieu cellulaire sera d’environ 37 degrés Celsius. Transférez les cellules dans un incubateur et attendez 24 heures avant de les analyser. Lorsque les cellules sont prêtes, aspirez le milieu et remplacez-le par deux millilitres de réactif MTT à 25 % dans le milieu.

Laissez ensuite les cellules incuber pendant quatre heures supplémentaires. Ensuite, remplacez le support MTT par deux millilitres de DMSO. Placez les plaques cellulaires sur une bascule de paillasse pendant 10 minutes pour permettre au DMSO de solubiliser les réactifs MTT.

Enfin, pipetez des échantillons de 100 microlitres de chaque puits vers une plaque de 96 puits et lisez optiquement la plaque à 570 nanomètres. Ces études in vivo peuvent être appliquées à tout type de cancer qui forme des tumeurs solides dans un modèle de miroir orthotopique ou ectopique. Dans cet exemple, les cellules cancéreuses du foie de l’hépatite 3 B sont utilisées avec des souris nues BPC.

Commencez avec environ 100 000 cellules de trypsine glace les cellules et produisez une solution de 2 millions de cellules par 25 microlitres. Ajoutez une quantité égale de matrigel glacé à la suspension cellulaire et mélangez-la soigneusement par aspiration répétée dans une pipette. Injectez maintenant la suspension mixte à la position souhaitée sur le dos de chaque animal.

Après quelques semaines, les tumeurs seront d’un demi-centimètre à ce moment-là, commenceront le traitement RF et anesthésient les souris avec la solution de kétamine et de xylazine par injection IP et les maintiennent au chaud. Ensuite, injectez les nanoparticules d’or directement dans la moitié des tumeurs à l’aide d’une seringue d’un cc avec une aiguille de calibre 27 ou 30. Utilisez un écouvillon chirurgical pour absorber le sang et essuyez le site d’injection avec une lingette imbibée d’alcool.

Comme contrôle, injectez uniquement du PBS dans l’autre moitié des tumeurs. Maintenant, traitez la moitié des souris de chaque groupe. Montez la souris sur la tête de réception du générateur RF et protégez les zones non traitées avec du ruban adhésif, y compris les yeux, les oreilles et les orteils.

La partie la plus importante de cette expérience est une bonne mise à la terre de vos souris. Sans une mise à la terre appropriée, l’accumulation de charge sur les animaux peut causer des lésions thermiques ou électrodermales. Cela peut être facilement évité.

Positionnez la tumeur hors de la tête de transmission d’au moins un centimètre de plus que la largeur du site de traitement souhaité. Maintenant, positionnez la caméra thermique IR de manière à ce que la tumeur et la zone de traitement soient visibles. Allumez le RF pendant cinq minutes et enregistrez la courbe de température résultante.

Si la température de surface de la peau dépasse 42 degrés Celsius, arrêtez le traitement immédiatement après l’exposition aux RF. Laissez les souris récupérer dans une chambre chaude jusqu’à ce qu’elles soient conscientes. Répétez les traitements deux fois par semaine pendant trois semaines.

Ensuite, euthanasiez les souris 48 heures après l’exposition finale aux RF et traitez les tumeurs. L’échauffement RF des nanoparticules d’or purifiées a été déterminé par la différence de hrs entre elles et la solution tampon d’eau désionisée de fond. Les résultats étaient conformes aux attentes pour des nanoparticules de cinq nanomètres et de 10 nanomètres.

Les nanoparticules d’or purifiées intégrées dans les cellules B Hep 3 dérivées du carcinome hépatocellulaire humain. Lorsque ces cellules sont exposées à un champ RF, elles deviennent généralement moins viables que celles exposées à la RF sans nanoparticules internalisées. La figure 3 illustre un scénario idéalisé où les nanoparticules d’or utilisées ont une toxicité limitée en elles-mêmes, mais où d’excellentes propriétés cytotoxiques initiées par RF consultent la littérature pour un examen complet des résultats in vitro obtenus à ce jour en utilisant divers types de nanomatériaux.

Les cellules cancéreuses de l’hépatite 3 ont été utilisées pour générer des tumeurs sur le dos de souris nues. Ces tumeurs ont été injectées avec des nanoparticules d’or en suspension PBS, suivies d’une exposition RF. L’analyse post-Thomas a révélé que le traitement contrôlait la croissance tumorale et diminuait la masse tumorale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer les nanoparticules pour une utilisation dans l’hypothermie médiée par RF en déterminant leurs propriétés et leur solution sensibles aux RF in vitro et in vivo. N’oubliez pas que travailler avec des champs électriques RF de haute puissance peut être extrêmement dangereux. Ne touchez jamais ou n’atteignez pas un champ électrique actif.

Prenez des mesures du champ électrique et, si nécessaire, utilisez un blindage approprié comme une cage de Faraday. En général, minimisez toujours votre exposition à des champs électriques soutenus de haute intensité.