Name: Protocoles pour lévaluation des radiofréquences Interactions avec des nanoparticules dor et les systèmes biologiques pour la thérapie du cancer hyperthermie non invasive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez l'évaluation des propriétés thermiques des nanoparticules d'or dans un champ électrique de radiofréquence 13,56 MHz pour l'hyperthermie cancéreuse. Cette méthode combine analyses in vitro et in vivo.

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Ce travail a été financé par le NIH (U54CA143837), les MD Anderson Cancer Center subventions de soutien aux NIH (__gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ CA016672), la Fondation V (SAC), et une bourse de recherche de la Fondation Kanzius recherche (SAC, Erie, Pennsylvanie). Nous remercions Kristine Ash du Département d&#39;oncologie chirurgicale, MD Anderson Cancer Center, de l&#39;assistance administrative.

Un survol complet expérimental est représenté sur la figure 1. De plus amples détails sont décrits dans les étapes 1 à 3 ci-dessous. Une. Évaluation de chauffage RF de NP colloïdes: AuNPs comme un exemple <ol><li> En général, pour chaque échantillon NP objet d&#39;une enquête, d&#39;abord laver les échantillons à plusieurs reprises à travers un filtre de centrifugation avec (DI) de l&#39;eau déminéralisée pour éliminer les ions et les contaminants fond. Tous les ions et les contaminants ont été retirés de la suspension AUNP lorsque le liquide lavé a des vitesses de chauffage RF similaires (RR) que de l&#39;eau DI. Ce processus de purification permet également de fortes concentrations de NP être obtenus. Il est à noter que, bien que l&#39;aide AuNPs dans cet exemple, les principes fondamentaux peuvent être appliqués à d&#39;autres matières NP. </li><li> A titre d&#39;exemple, une bouteille de purifier AuNPs disponibles dans le commerce d&#39;un diamètre de 5 nm de 500 ml, puis les soumettre à un champ électrique de fi-RF 13,56 MHzchamp de force 90 kV / m. <ol><li> Prenez ~ 125 ml de la solution mère de AUNP et répartis entre six 50 kDa tubes de filtre de la centrifugeuse. Centrifuger à 3000 rpm. pendant 2 min 5 sec. Retirer les filtres tampons et recharge filtrés avec plus de solution stock. Répétez jusqu&#39;à ce que tous les 500 ml a été filtré. </li><li> Remplacez la solution filtrée avec un volume similaire de l&#39;eau DI et répéter environ 8 fois (ou jusqu&#39;à ce que les tampons RR RF filtrés sont équivalentes à l&#39;eau DI). Notez, analyse UV-Vis peut également être utilisé pour surveiller les pics d&#39;absorption des contaminants. Une fois les contaminants tampons ont été entièrement enlevés, pipette environ 0,5 ml d&#39;eau déminéralisée dans chaque filtre et remettre en suspension les AuNPs par pipetage répété. Cela devrait éliminer complètement les AuNPs du filtre et permettre la pleine remise en suspension. Mélanger tous les six suspensions dans un tube de 15 ml Eppendorf. </li><li> Une fois les AuNPs ont été purifiés et concentrés, d&#39;analyser l&#39;échantillon en utilisant l&#39;ICP-OES et / ou ICP-MS, UV-vis et le potentiel Zeta de données sur concentration et la stabilité NP, respectivement. SEM et / ou analyse MET peuvent également être utilisés pour obtenir des données morphologiques. Préparation de l&#39;échantillon pour ces techniques détaillées peuvent être trouvées dans la littérature 4. </li></ol></li><li> En utilisant le système Kanzius RF décrit dans les études précédentes 8 ou dérivations de ce système, placez un cylindrique cuvette de quartz de 1,3 ml de sorte que le champ électrique RF dans l&#39;air (sans échantillon présent) serait ~ 90 kV / m à l&#39;intérieur de la cuvette. Pour un échantillon de sérum physiologique standard (0,9% de NaCl), le champ électrique sera réduite à environ 1,1 kV / m. Ce sont les conditions approximatives utilisées pour permettre d&#39;effectuer des comparaisons entre les différents systèmes. <ol><li> Pipette 1,3 ml d&#39;un 1,000 mg / l échantillon de AUNP colloïde purifié dans la cuvette de quartz et d&#39;introduire ce dans le champ de RF. Cela peut être fait en utilisant un porte-échantillon en Téflon sur mesure. Exposer l&#39;échantillon au champ de RF pendant une période de 120 secondes ou jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon atteigne 70 ° C pour éviter la formation d&#39;un arc électrique ou une ébullition rapide. Californiepture les données d&#39;imagerie thermique (ainsi que les zones de contrôle) à l&#39;aide d&#39;une caméra infrarouge et le logiciel associé. Répétez cette procédure trois fois. </li><li> Filtrer l&#39;échantillon à travers un autre filtre de la centrifugeuse 50 kDa pour extraire les AuNPs à partir du tampon d&#39;eau DI. Ré-exposer le tampon sur le champ RF, de nouveau trois fois. La différence en heures entre le colloïde AUNP et le tampon de l&#39;eau déminéralisée de fond détermine la RH en raison des AuNPs eux-mêmes. Attendez-vous à obtenir RR de ~ 0,3 ° C / s et 0,05 ° C / sec pour donner un HR dépend AUNP de ~ 0,25 ° C / sec. Reprendre les AuNPs restants du filtre dans 1,3 ml d&#39;eau pour expériences in vitro / in vivo. </li></ol></li></ol> 2. Hyperthermie induite RF assistée nanoparticules: études in vitro <ol><li> Ces études in vitro peuvent être appliqués à n&#39;importe quel type de cancer type de cellules qui forment des monocouches 2D. Dans cette expérience, utiliser carcinome hépatocellulaire humain dérivé de cellules Hep3B. <ol><li> Plate ~ 50000 cells dans les trois frontales puits d&#39;une plaque à 12 puits avec 1 ml de milieu de croissance. Répétez cette 6 fois (utiliser trois plaques pour les études NP et trois plaques de témoins). Incuber à 37,5 ° C pendant 24 heures avant d&#39;introduire les infirmières praticiennes. Stériliser les IP de la première utilisation de biosécurité Cabinet exposition aux UV-lumière pendant 5 min. </li><li> Dans chaque puits introduire 0,1 ml d&#39;une solution 1,000 mg / L AUNP et quitter pour un autre 24 heures. Ajouter 0,1 ml d&#39;eau dans chaque puits des trois plaques de cellules de contrôle et de laisser aussi pendant 24 heures. </li><li> Après 24 heures se sont écoulées, aspirer les milieux cellulaires et laver avec du PBS pour éliminer toute AuNPs liés à la surface. Remplacez le support de cellule. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;exposition aux RF. </li></ol></li><li> Placez chaque paquet de cellules de 12 puits dans le champ de RF. Attendez jusqu&#39;à ce que les cellules ont refroidi à 31 ° C. Allumez le générateur RF et exposer pour 3,5 min. La température finale du milieu cellulaire sera de ~ 37 ° C. Désactiver le champ RF. Éliminer les cellules et les placer dans un incubateur pendant 24 heures avant l&#39;analyse. <ol> &lt;li&gt; Supprimer des cellules de l&#39;incubateur et les médias de la cellule d&#39;aspiration. Ajouter 1,6 ml de milieu de cellules dans chaque puits ainsi à 0,4 ml de réactif MTT. Incuber les cellules pendant 4 heures. Aspirer le milieu et remplacer par 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Placez les plaques de cellules sur une bascule de banc et laisser reposer 10 minutes pour permettre le DMSO pour solubiliser les réactifs de MTT. Enfin, pipette 100 pi de chaque puits dans une plaque de 96 puits et la lecture optique du puits à 570 nm en utilisant un lecteur de plaque, comme le lecteur de plaque SPECTROstar Nano. </li></ol></li></ol> 3. Hyperthermie induite RF assistée nanoparticules: Les études in vivo <ol><li> Ces études in vivo peuvent être appliquées à n&#39;importe quel type de cancer qui se forme de tumeurs solides chez un modèle murin orthotopique ou ectopique. Cette expérience utilise des cellules de cancer du foie Hep3B dans un modèle de souris BALB-C ectopique de souris Nude tumorale. </li><li> Remarque: toutes les expériences in vivo sont exécutées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. En outre, le protocole étant démontré a été réalisée sous la direction et l&#39;approbation de l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Centers soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC). <ol><li> Cultiver un nombre approprié de cellules (~ 100 k) dans un ballon de culture de tissu avec le milieu de croissance approprié. Incuber dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant toute la durée de la culture cellulaire. </li><li> Traiter les cellules avec de la trypsine (à détacher du ballon) et de produire une solution de 2 millions de cellules pour tous les 25 pi. Ajouter une quantité égale de Matrigel (sur la glace) et bien mélanger pour préparer la solution finale d&#39;injection. Injecter cette solution dans la position souhaitée sur le dos de la souris et d&#39;attendre une période de temps appropriée pour que les tumeurs se développer jusqu&#39;à la taille désirée (2-4 semaines pour la plupart des cellules). Avant l&#39;exposition RF, souris nude BALB-C doivent porter tumeurs ectopiques solides 0,5-1 cm de diamètre. </li></ol></li><li><ol><li> Préparer les souris à utiliser (dans ce cas BALB-C souris Nude) par anéles sthetizing avec une solution de kétamine et de xylazine par injection IP. Alors que les souris s&#39;endorment, les garder dans une chambre à température contrôlée à 37 ° C. 20 souris au total seront nécessaires, tous portant des tumeurs de taille similaire. Dix souris seront utilisés en conjonction avec et sans AuNPs (ces derniers étant les injections de PBS), tandis que les 10 souris restantes seront réparties entre les RF-exposée témoins non exposés et RF: les deux groupes sans injections de AUNP. </li><li> Une fois anesthésié, injecter les AuNPs directement dans la tumeur en utilisant une seringue de 1 cc avec une aiguille 27 G. La solution AUNP devrait être à une concentration de 200 mg de Au / L dans 0,1 ml de PBS. Après l&#39;injection, utiliser un tampon chirurgical pour absorber le sang et essuyez le site d&#39;injection avec un tampon imbibé d&#39;alcool. </li><li> Puis monter la souris à traiter sur la tête de réception du générateur RF. La souris doit être placé de sorte que la tumeur est le plus proche de la tête de transmission. Protéger les zones qui ne doivent pas être traités, ainsi que sensiblestion des domaines tels que les yeux, les oreilles et les orteils, avec une bande de cuivre. Assurez-vous que la bande de cuivre est en contact de façon appropriée au plan de mise à la terre de sorte qu&#39;aucune accumulation de charge se produit. En outre, la zone d&#39;exposition doit avoir un intervalle d&#39;au moins 1 cm plus grande que la taille du site de traitement souhaité. </li><li> Position caméra infrarouge thermique de sorte que la tumeur et la zone de traitement sont visibles. Mettez RF pendant 5 min. Enregistrer la courbe de température qui en résulte. Si le traitement permet d&#39;obtenir des températures supérieures à 42 ° C de traitement de l&#39;arrêt immédiatement. </li></ol></li><li><ol><li> Après l&#39;exposition aux RF récupérer la souris de l&#39;anesthésie dans une chambre chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient conscients. </li><li> Répéter l&#39;expérience avec les mêmes souris 48 heures plus tard (étapes 3.3.1 - 3.4.1). </li><li> Après l&#39;expérience, euthanasier les souris selon des protocoles et des procédures institutionnelles. Noter le poids de la tumeur. Pour l&#39;analyse histologique fixer les tumeurs à l&#39;aide de formol et de les intégrer dans de la paraffine. sections de tumeurs sont généralement colorées esprith hématoxyline et l&#39;éosine et des cibles pertinentes pour évaluer l&#39;efficacité thérapeutique, par exemple Ki-67, caspase-3, etc. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gannon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-enhanced+thermal+destruction+of+cancer+cells+in+a+noninvasive+radiofrequency+field%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field.</a> Cancer. 110, 2654(2007).</li>
<li>Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+radiofrequency+field-induced+hyperthermic+cytotoxicity+in+human+cancer+cells+using+cetuximab-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Ther.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles.</a> J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).</li>
<li>Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+enhance+non-invasive+radiofrequency+thermal+destruction+of+human+gastrointestinal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).</li>
<li>Raoof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+antibody-conjugated+gold+nanoparticles+in+the+endolysosomal+nanoenvironment%3A+implications+for+noninvasive+radiofrequency-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy.</a> Nanomedicine. 8, 1096(2012).</li>
<li>Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinoma+cells+are+susceptible+to+noninvasive+radio+frequency+fields+after+treatment+with+targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles.</a> Surgery. 148, 319(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+field-induced+thermal+cytotoxicity+in+cancer+cells+treated+with+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles.</a> Cancer. 116, 3285(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+radiofrequency+ablation+of+malignancies+mediated+by+quantum+dots%2C+gold+nanoparticles+and+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).</li>
<li>Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate-Capped+Gold+Nanoparticle+Electrophoretic+Heat+Production+in+Response+to+a+Time-Varying+Radiofrequency+Electric-Field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field.</a> J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).</li>
<li>Kruse, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Radio-Frequency+Coupling+Network+for+Heating+of+Citrate-Coated+Gold+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%3A+Design+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+absorption+of+radiofrequency+radiation+by+colloidal+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles.</a> J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).</li>
<li>Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+heating+of+gold+nanoparticle+dispersions+for+non-invasive+thermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies.</a> Nanoscale. , (2012).</li>
<li>Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio+frequency+absorption+in+gold+nanoparticle+suspensions%3A+a+phenomenological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study.</a> J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).</li>
<li>Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oops+they+did+it+again%21+Carbon+nanotubes+hoax+scientists+in+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays.</a> Nano Lett. 6, 1261(2006).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ces protocoles permettent à l&#39;expérimentateur d&#39;analyser pleinement la mesure dans laquelle les nanomatériaux (dans ce cas AuNPs) peut augmenter l&#39;hyperthermie induite RF-pour le traitement du cancer. Le premier protocole traite spécifiquement de l&#39;analyse de la production de chaleur à partir d&#39;échantillons AUNP hautement concentré et purifié. Bien que d&#39;autres groupes ont rapporté la production de chaleur principalement à partir des tampons dont les AuNPs sont suspendus à l&#39;intérieur et pas ...

L&#39;absorption de l&#39;énergie RF par un tissu biologique (à cause de leur permittivité électrique intrinsèque) se traduit par des températures élevées de tissu en fonction du temps, ce qui conduit finalement à la mort cellulaire par hyperthermie. On suppose que l&#39;hyperthermie du cancer peut être optimisée par l&#39;utilisation de nanomatériaux ciblées qui internalisent l&#39;intérieur de la cellule cancéreuse et agissent comme des capteurs RF-thermiques, en laissant les cellules saines normales, voisins intacts. Plusieurs rapports ont déjà montré qu&#39;une variété de IP peut agir sources de chaleur RF efficaces qui aident à la nécrose de cancer 1-4. À ces égards, les IP or (AuNPs) 3-5, les nanotubes de carbone 1, et les points quantiques 6, 7 ont présenté des caractéristiques intéressantes lorsqu&#39;il est utilisé à la fois in vitro et in vivo expériences RF. Bien que la nature exacte du mécanisme de chauffage de ces NP lorsqu&#39;ils sont exposés à un champ RF est encore en discussion, une série deexpériences fondamentales en utilisant AuNPs a accordé une grande importance à la fois sur la taille NP et états d&#39;agrégation. Il a été montré que seuls AuNPs de diamètre &lt;10 nm va chauffer lorsqu&#39;il est exposé à un champ RF-8. En outre, ce mécanisme de chauffage est significativement atténuée lorsque les AuNPs sont agrégés. Cette condition d&#39;agrégation a également été validé dans les modèles in vitro qui ont placé d&#39;importance à l&#39;optimisation AUNP stabilité colloïdale dans des compartiments intracellulaires endolysomal pour la thérapie RF efficace 4. Cependant, les techniques et les principes expérimentales utilisées pour recueillir et évaluer ces données peut être problématique, surtout dans le cas de la validation des profils de chaleur RF de colloïdes NP. Plusieurs rapports ont montré que l&#39;effet Joule de la suspension ionique de fond que les IP sont en suspension dans peut-être la principale source de production de chaleur RF et pas les mêmes IP 9-12. Bien que notre récent article 8 a validé til utiliser des interactions de RF dans la production de chaleur à partir de AuNPs de diamètre inférieur à 10 nm, nous visons à décrire ces protocoles plus en détail dans cet article. Nous démontrons également les protocoles et les techniques nécessaires pour évaluer l&#39;efficacité de AuNPs comme agents thermiques hyperthermie à la fois in vitro et in vivo pour les modèles de cancer du foie. Bien que nous nous intéressons principalement sur les colloïdes simples de AuNPs de citrate coiffés, les mêmes techniques peuvent être appliquées à d&#39;autres hybrides tels que AUNP-anticorps et des complexes conjugué de chimiothérapie. En adhérant à ces principes, l&#39;expérimentateur devrait, espérons être en mesure d&#39;évaluer rapidement le potentiel pour tout nanomatériau d&#39;être un agent hyperthermique thermique RF-induite efficace.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>réactif/matériau</fort</td></tr><tr><td>>500 ml de nanoparticules d’or (5 nm)</td><td>Ted Pella, INC</td><td>15702-5</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-4/-15 (50 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC805024/UFC910096</td><td>(volumes de 4 ml et 15 ml)</td></tr><tr><td>MEM X1 Milieu de culture cellulaire</td><td>Cellgro</td><td>10-101-CV</td><td>(ajouter des nutriments supplémentaires si nécessaire)</td></tr><tr><td>Fœtal bovin Serum</td><td>Sigma</td><td>F4135-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Copper Tape</td><td>Ted Pella</td><td>16072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kanzius RF System (13.56 MHZ)</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra IR</td><td>FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)</td><td>Contact FLIR</td><td></td></tr><tr><td>1.3 ml Quartz Cuvette</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon en téflon avec platine rotative</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano Lecteur de microplaques</td><td>BGM Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre UV-Vis</td><td>Applied Nanofluorescence, Houston, TX)</td><td>NS1 NanoSpectralyzer</td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211 ; S</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 4300 DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Zen 3600 Zetasizer</td><td></td></tr></tbody></table>

protocoles pour l&#39;évaluation des radiofréquences interactions avec des nanoparticules d&#39;or et les systèmes biologiques pour la thérapie du cancer hyperthermie non invasive

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

les thérapies du cancer qui sont moins toxiques et invasive que leurs homologues existants sont très souhaitables. L&#39;utilisation de RF électriques champs qui pénètrent profondément dans le corps, provoquant une toxicité minimale, sont actuellement à l&#39;étude comme un moyen viable de traitement du cancer non invasif. Il est prévu que les interactions de l&#39;énergie RF avec des nanoparticules internalisées (IP) peuvent libérer de la chaleur qui peut alors provoquer une surchauffe (hyperthermie) de la cellule, terminant finalement à une nécrose cellulaire. Dans le cas des systèmes non biologiques, nous présentons des protocoles détaillés relatifs à la quantification de la chaleur dégagée par les colloïdes NP hautement concentrés. Pour les systèmes biologiques, dans le cas d&#39;expériences in vitro, nous décrivons les techniques et les conditions qui doivent être respectées afin d&#39;exposer efficacement les cellules cancéreuses à l&#39;énergie RF sans vrac artefacts de chauffage médias obscurcissant considérablement les données. Enfin, nous donnons une méthodologie détaillée fou dans des modèles murins in vivo avec des tumeurs de cancer du foie ectopiques.

Une. L&#39;évaluation de chauffage RF de colloïdes NP: AuNPs titre d&#39;exemple. Après avoir suivi la section 1.1 - 1.2.3 s&#39;attendre à avoir une solution très concentrée, stable et purifiée de 5 nm et 10 nm AuNPs de diamètre. De les 500 ml de solution-acheté des actions, s&#39;attendre à obtenir au moins 4 ml d&#39;une solution à une concentration de 1,000 mg / L. La différence en heures entre les AuNPs et la solution tampon de l&#39;eau DI de fond à cette concentration doit être ~ 0,25 ° ...

Nous décrivons les protocoles utilisés pour étudier les interactions de 13,56 MHz radiofréquence (RF) électriques champs avec des colloïdes de nanoparticules d&#39;or dans les deux systèmes non biologiques et biologiques (in vitro / in vivo). Ces interactions sont à l&#39;étude pour des applications dans le traitement du cancer.

Protocoles pour l&#39;évaluation des radiofréquences Interactions avec des nanoparticules d&#39;or et les systèmes biologiques pour la thérapie du cancer hyperthermie non invasive

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer les propriétés thermiques de nanoparticules d'or dans un champ électrique radiofréquence de 13,56 mégahertz, in vitro et in vivo. Cela est réalisé en évaluant d'abord la vitesse de chauffage de nanoparticules d'or concentrées et de leur tampon dans une cuvette en quartz. La deuxième étape de la procédure consiste à réaliser des études de toxicité in vitro des nanoparticules d'or sur des cellules cancéreuses en culture.La troisième étape consiste à réaliser des études in vivo de nanoparticules d'or dans un modèle de cancer chez la souris ectopique. En fin de compte, les résultats peuvent montrer si la nanoparticule étudiée pourrait constituer un agent efficace à utiliser avec l'hyperthermie induite par radiofréquence, grâce à l'analyse des nanoparticules en suspension, in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hyperthermie par radiofréquence non invasive médiée par des nanoparticules, telles que savoir si l'effet de chauffage est dû aux particules elles-mêmes et s'il peut être utilisé à des fins thérapeutiques.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car il existe peu de protocoles bien établis pour réaliser ce type d'expériences. La procédure sera démontrée par Cisneros, une assistante de recherche, Stuart Core, un chercheur postdoctoral, et Leila Green, une autre chercheuse postdoctorale. À titre d'exemple, commencez avec une bouteille commerciale de 500 millilitres de nanoparticules d'or de diamètre cinq nanomètres.Prenez environ 125 millilitres de la solution mère de nanoparticules d'or et répartissez-la dans six tubes de filtration centrifuge de 50 kilodaltons. Centrifugez les nanoparticules à 3000 tr/min pendant deux minutes et cinq secondes. Éliminez le surnageant, qui correspond au tampon filtré, puis remplissez à nouveau chaque filtre avec de la solution mère.Poursuivre la centrifugation, éliminer le tampon et recharger les tubes jusqu'à ce que toute la solution de nanoparticules ait été filtrée. Après la dernière addition, remplacer le tampon filtré par un volume similaire d'eau déionisée et répéter le processus environ huit fois supplémentaires après avoir chargé l'échantillon de tampon filtré dans la machine RF. À l'aide du logiciel de caméra infrarouge, créer des zones autour du QVE pour capturer le profil de chauffage. Après huit lavages, les données de chauffage du filtrat de nanoparticules d'or de cinq nanomètres s'approchent de celles de l'eau déionisée.L'analyse UV-visible peut également être utilisée pour surveiller l'absorption des contaminants. Pics. Ce spectre est propre. Une fois que les contaminants du tampon ont été complètement éliminés, nous suspendons les nanoparticules dans 0,5 millilitre d'eau déionisée dans les tubes à filtre, ce qui permet d'extraire les nanoparticules du filtre.Ensuite, combiner les six suspensions dans un seul tube de 15 millilitres. Analyser ensuite l'échantillon par UV-VIS et par potentiel zêta pour obtenir des données de stabilité. Utiliser la spectroscopie d'émission ICP ou la spectrométrie de masse ICP pour déterminer la concentration des nanoparticules.L'analyse MEB et/ou MET peut également être utilisée pour obtenir des données morphologiques à l'aide d'un système RF Kansas ou de dérivés de charge, d'une seringue en quartz de 1,3 millilitre, et en réglant le champ électrique RF à environ 90 kilovolts par mètre dans l'air, là où se trouverait le vete Q. Pour un échantillon standard de sérum physiologique contenant 0,9 % de chlorure de sodium, le champ électrique serait réduit à environ 1,1 kilovolt par mètre. Ce sont là les conditions approximatives utilisées afin de permettre des comparaisons entre différents systèmes RF.À présent, chargez une cuvette en quartz propre avec 1,3 millilitre de suspension purifiée de nanoparticules d'or à une concentration de 1000 milligrammes par litre. Exposez l'échantillon au champ RF pendant une durée de 120 secondes ou jusqu'à ce que l'échantillon atteigne 70 degrés Celsius. Une exposition excessive peut entraîner un arc électrique ou une ébullition rapide.Acquérir les données d'imagerie thermique ainsi que celles des zones de contrôle à l'aide d'une caméra infrarouge et du logiciel associé. Répéter cette procédure trois fois sur le même échantillon. Filtrer maintenant l'échantillon à l'aide d'un autre filtre de centrifugation de 50 kilodaltons afin d'extraire les nanoparticules d'or du tampon aqueux.Ensuite, réexposez le tampon seul au champ RF. Encore une fois, trois fois la différence en heures entre le colloïde de nanoparticules d'or et le filtrat détermine le taux d'HR dû aux nanoparticules d'or elles-mêmes. Enfin, nous suspendons les nanoparticules d'or restantes provenant du filtre dans 1,3 millilitres d'eau pour des expériences ultérieures.Ces études in vitro peuvent être appliquées à tout type de cellule cancéreuse formant des monocouches en deux dimensions. Dans cet exemple, des cellules Hep trois B, dérivées d'un carcinome hépatocellulaire humain, seront utilisées pour ensemencer environ 50 000 cellules dans trois puits d'une plaque de 12 puits avec un millilitre de milieu de croissance.Continuer d'ajouter le milieu aux cellules jusqu'à ce que trois plaques soient remplies pour les études sur les nanoparticules, et trois autres plaques soient remplies comme témoins. Incuber les plaques à 37,5 degrés Celsius pendant 24 heures. Le jour suivant, introduire 0,1 millilitre d'une solution de nanoparticules d'or à 1000 milligrammes par litre dans chaque puits des trois plaques contenant des nanoparticules, ainsi que dans les plaques témoins.Ajouter 0,1 millilitre d'eau dans chaque puits et incuber toutes les plaques pendant encore 24 heures. Après ces 24 heures supplémentaires, aspirer le milieu cellulaire et laver les cellules avec du PBS afin d'éliminer les nanoparticules d'or éventuellement liées à la surface. Puis remplacer le milieu cellulaire.Les cellules sont désormais prêtes pour l'exposition aux RF. Placer chaque plaque de cellules à 12 puits dans le champ RF et attendre que les cellules atteignent une température de refroidissement de 31 degrés Celsius. Une fois légèrement refroidies, exposer les cellules à 3,5 minutes de rf.La température finale du milieu cellulaire sera d'environ 37 degrés Celsius. Transférez les cellules dans une étuve et attendez 24 heures avant de les analyser. Lorsque les cellules sont prêtes, aspirez le milieu et remplacez-le par deux millilitres de réactif MTT à 25 % dans le milieu.Ensuite, laissez les cellules incuber pendant quatre heures supplémentaires. Puis, remplacez le milieu de MTT par deux millilitres de DMSO. Placez les plaques de cellules sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes afin de permettre au DMSO de solubiliser les réactifs de MTT.Enfin, prélevez par pipette des échantillons de 100 microlitres de chaque puits vers une plaque de 96 puits et lisez optiquement la plaque à 570 nanomètres. Ces études in vivo peuvent être appliquées à tout type de cancer formant des tumeurs solides dans un modèle de reproduction orthotopique ou ectopique. Dans cet exemple, des cellules de cancer du foie Hep trois B sont utilisées avec des souris nues BPC.Commencez avec environ 100 000 cellules ; mettez les cellules en suspension dans du trypsine sur glace et préparez une solution contenant 2 millions de cellules par 25 microlitres. Ajoutez une quantité égale de matri gel glacé à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement par aspirations répétées à l’aide d’une pipette. Injectez ensuite la suspension mixte à l’emplacement souhaité sur le dos de chaque animal.Après quelques semaines, les tumeurs auront une taille d'environ un demi-centimètre à un centimètre de diamètre ; à ce stade, commencez le traitement par radiofréquence et anesthésiez les souris à l'aide d'une solution de kétamine et de xylazine par injection intrapéritonéale, en les maintenant au chaud. Ensuite, injectez directement les nanoparticules d'or dans la moitié des tumeurs à l'aide d'une seringue d'un cm³ équipée d'une aiguille de 27 ou 30 gauge. Utilisez un tampon chirurgical pour absorber le sang et nettoyez le site d'injection avec un tampon imbibé d'alcool.En tant que témoin, injectez uniquement du PBS dans l'autre moitié des tumeurs. Ensuite, traitez la moitié des souris dans chaque groupe. Placez la souris sur la tête réceptrice du générateur RF et protégez les zones non traitées avec du ruban de cuivre, y compris les yeux, les oreilles et les orteils.La partie la plus importante de cette expérience est la mise à la terre adéquate de vos souris. En l'absence de mise à la terre appropriée, l'accumulation de charge sur les animaux peut provoquer des lésions thermiques ou électrodermiques. Cela peut être facilement évité.Positionnez la tumeur à au moins un centimètre de plus que la largeur du site de traitement souhaité par rapport à la tête de transmission. Placez maintenant la caméra thermique infrarouge de manière à ce que la tumeur et la zone de traitement soient visibles. Activez le courant radiofréquence (RF) pendant cinq minutes et enregistrez la courbe de température résultante.Si la température de surface de la peau dépasse 42 degrés Celsius, arrêtez immédiatement le traitement après l'exposition aux ondes radiofréquence. Laissez les souris se remettre dans une chambre chaude jusqu'à ce qu'elles reprennent connaissance. Répétez les traitements deux fois par semaine pendant trois semaines.Ensuite, euthanasier les souris 48 heures après la dernière exposition aux RF et traiter les tumeurs. Le chauffage par RF des nanoparticules d'or purifiées a été déterminé par la différence de température en °C entre celles-ci et la solution tampon d'eau déionisée du fond. Les résultats étaient conformes aux attentes pour les nanoparticules de cinq nanomètres et de 10 nanomètres.Les nanoparticules d'or purifiées se sont intégrées dans des cellules Hep trois B dérivées de carcinome hépatocellulaire humain. Lorsque ces cellules sont exposées à un champ RF, elles deviennent généralement moins viables que celles exposées au champ RF sans nanoparticules internalisées. La figure trois illustre un scénario idéalisé dans lequel les nanoparticules d'or utilisées présentent une toxicité limitée en elles-mêmes, mais des propriétés cytotoxiques excellentes activées par le champ RF ; consulter la littérature pour une revue complète des résultats in vitro obtenus à ce jour à l'aide de divers types de nanomatériaux.Des cellules cancéreuses du foie Hep trois B ont été utilisées pour induire des tumeurs sur le dos de souris nues balsi. Ces tumeurs ont été injectées avec des nanoparticules d'or en suspension dans du PBS, puis exposées à un champ RF. L'analyse post-traitement effectuée par Thomas a révélé que le traitement permettait de contrôler la croissance tumorale et de réduire la masse tumorale.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer les nanoparticules destinées à être utilisées en hypothermie induite par radiofréquence, en déterminant leurs propriétés de réponse à la radiofréquence ainsi que leur comportement en solution in vitro et in vivo. N'oubliez pas que le travail avec des champs électriques de haute puissance en radiofréquence peut être extrêmement dangereux. Ne touchez jamais ni n'approchez d'un champ électrique actif.Effectuez des mesures du champ électrique et, si nécessaire, utilisez un blindage approprié tel qu'une cage de Faraday. En général, minimisez toujours votre exposition aux champs électriques intenses prolongés.

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