Amélioration de la préparation et la conservation de l'hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme

Cet article présente une méthodologie complète pour préparer et conserver

L’objectif global de cette procédure est de pouvoir enregistrer une potentialisation à long terme très stable et reproductible dans des coupes aiguës de l’hippocampe. Ceci est accompli en extrayant d’abord le cerveau de la souris et en disséquant l’hippocampe dans un LCR A froid au microscope. La deuxième étape consiste à couper des tranches transversales d’hippocampe à l’aide d’un hachoir à tissus.

Ensuite, la tranche est placée dans la chambre d’enregistrement d’interface, qui sera perfusée avec du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné. La dernière étape consiste à placer les électrodes et à enregistrer l’activité synaptique dans la région CA one de l’hippocampe. En fin de compte, un protocole de stimulation à haute fréquence est utilisé pour montrer l’induction d’une potentialisation à long terme très stable.

Grâce à cette méthode, il est possible de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent à la plasticité synaptique. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les modèles animaux du système neurodégénératif ou nerveux, ou aux maladies immunitaires. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car toutes les manipulations nécessitent une grande habileté et beaucoup de pratique.

Commencez cette procédure en rinçant le circuit de perfusion avec de l’eau distillée pendant au moins 20 minutes. Allumez ensuite les systèmes de chauffage. Démarrez le carbogen en bouillonnant dans le circuit.

Le carbogène est acheminé vers le bain-marie situé sous la chambre d’enregistrement par des diffuseurs d’air. Ensuite, contrôlez le débit dans le bain-marie à l’aide d’un débitmètre, vidangez le circuit et remplissez-le avec un tapotement CSF filtré pour éliminer les bulles. Placez ensuite l’anneau, qui soutiendra la tranche dans la chambre de maintien.

Retirez soigneusement toutes les bulles d’air du circuit. Ajustez ensuite le niveau de LCR A dans la chambre d’enregistrement à l’aide de la vis de l’aiguille d’aspiration, la vitesse de la pompe d’entrée est ajustée à un millilitre par minute et la pompe de sortie est réglée à cinq millilitres par minute. Avant la dissection, préparez tous les instruments chirurgicaux.

Pour enlever le cerveau d’une souris sacrifiée. Tenez sa tête avec votre index et votre pouce, et faites une incision avec les ciseaux de dissection le long du milieu du haut de la tête, en commençant par le bord de la guillotine, coupée et allant jusqu’à l’os frontal. Ensuite, coupez le muscle cutané de chaque côté de la tête pour exposer complètement les plaques du crâne.

Retirez ensuite les muscles du côté du dorlotement de la tête. Coupez ensuite le muscle temporal de chaque côté le long de la plaque temporale. Coupez ensuite les plaques frontales au milieu transversalement.

Faites maintenant une petite incision sur l’os occipital entre les deux plaques. Coupez à la base du dorlotet des plaques occipitales de chaque côté. Puis avec les ciseaux à ressort, coupez le long de la suture sagittale.

Enfin, retirez le crâne en écartant les moitiés les unes des autres à l’aide d’une pince. Maintenant, avec le scalpel coupé juste avant le cervelet et juste après le bulbe olfactif, transférez transversalement puis le cerveau extrait dans la boîte de dissection avec un LCR A froid. Une fois que le cerveau est émergé dans la boîte de dissection, séparez les deux hémisphères l’un de l’autre avec un scalpel inséré au milieu sous un microscope chirurgical binoculaire, étalez soigneusement la structure d’un hémisphère pour révéler le ventricule latéral.

Retirez le tronc cérébral et le céphalon en plaçant une spatule sur le cortex frontal et l’autre spatule sur le céphalon. Attention à ne pas toucher l’hippocampe avec la spatule et à ne pas l’étirer lors de la section des tissus. Après cela, coupez le fornix.

Ensuite, poussez doucement l’hippocampe hors du cortex en insérant une spatule dans le ventricule. Lorsque l’hippocampe est extrait, retirez l’excès de tissu cortical et les vaisseaux sanguins restants à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique à large ouverture. Transférez l’hippocampe dans une cuillère avec sa surface alvi vers le haut jusqu’à la plate-forme du hachoir.

Retirez l’excès de liquide de la cuillère à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique standard. Après cela, inclinez la cuillère vers le haut verticalement et touchez presque le papier filtre sur le hachoir. Déposez l’hippocampe en touchant rapidement le papier filtre.

Retirez ensuite la cuillère. Ensuite, orientez l’hippocampe et coupez-le. Transversalement à 400 microns avec le hachoir.

Effectuez la procédure le plus rapidement possible. Par la suite, retirez le papier filtre avec les tranches d’hippocampe et enroulez-le autour du cylindre métallique afin d’étaler un peu les tranches. Ensuite, libérez les tranches avec des pulvérisations de A LCR à l’aide d’une pipette pastorale en plastique standard et recueillez-les dans une boîte de Pétri remplie de froid.

Un CSF. Transférez la tranche sélectionnée dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette en plastique standard. Laissez la tranche se remettre du traumatisme de dissection dans la chambre d’interface d’enregistrement à 28 degrés Celsius.

Si la tranche s’enfonce, abaissez le niveau A CSF au niveau de tranche, puis augmentez à nouveau le niveau A CSF pour faire flotter la tranche. Après cela, orientez la tranche vers la position qui faciliterait le positionnement des électrodes dans la région CA un. Arrêtez d’abaisser le niveau de LCR A lorsqu’il est à l’interface.

Le ménisque du milieu autour de la tranche est indicatif d’un niveau suffisant de LCR A. Le grillage doit être saturé de fluide mais pas complètement immergé. Gardez ensuite la chambre recouverte de papiers filtres sur le couvercle perforé.

Laissez reposer la tranche pendant au moins une heure et 30 minutes à 28 degrés Celsius avant d’enregistrer. Voici un croquis qui montre deux entrées synaptiques indépendantes comme un et S deux pour la même population neuronale. La voie S un a été utilisée pour induire la LTP tandis que la voie S deux a agi comme un contrôle.

Il s’agit de l’échantillon de traces F-E-P-S-P enregistrées juste avant l’induction de la LTP comme indiqué par les traces rouges et une heure après l’induction de la LDP indiquée par les traces bleues. Voici les EPSP F d’une tranche parfaitement saine, et voici les EPSP F d’une tranche présentant un haut niveau d’excitabilité lorsque les tranches ne sont pas parfaitement saines. Des réponses polysynaptiques sont observées et la potentialisation de la pente F-E-P-S-P est réduite.

Voici une comparaison des trajectoires temporelles de la pente F-E-P-S-P après LTP induite par un seul train de stimulation à haute fréquence enregistrée en 2005, 2010 et 2011 dans notre laboratoire. Les premières expériences ont été enregistrées en 2005, indiquées par des cercles remplis. Les enregistrements ultérieurs indiqués par des carrés remplis ont bénéficié d’une procédure de dissection améliorée.

Les résultats actuels proviennent de l’optimisation de l’oxygénation de l’interface et du contrôle de la température, ainsi que de la standardisation des électrodes comme indiqué par des cercles ouverts. Nous montrons ici que l’augmentation du débit d’oxygène dans le bain d’eau sous la chambre d’enregistrement de 0,15 à 0,25 litre par minute, comme l’indique la courbe bleue, induit une diminution de la pente F-E-P-S-P de 20 %, augmentant la température de 28 à 29 degrés Celsius. Comme indiqué, la courbe verte induit une augmentation de plus de 50 % de la pente F-E-P-S-P.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque étape est cruciale et que les erreurs dans le protocole peuvent conduire à des résultats différents. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’obtenir une potentialisation très stable à long terme. Enregistrement dans des tranches aiguës d’hippocampe.