Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l'analyse des souches périphériques migration cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les interactions entre les cellules souches et les cellules endothéliales in vivo. Ceci est accompli en introduisant d’abord un cathéter de l’artère fémorale dans un animal sous sédatif pour un accès intra-artériel. Au cours de la deuxième étape, le muscle chromatique est préparé chirurgicalement pour la microscopie à fluorescence intravitale.

Ensuite, la population de cellules souches d’intérêt est injectée via le cathéter de l’artère fémorale. En fin de compte, les interactions entre les cellules souches transférées par adoption et l’endothélium de la microcirculation musculaire maîtresse peuvent être visualisées et quantifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que : comment la migration des cellules souches appliquées à des fins thérapeutiques est-elle régulée au sein d’un organisme vivant ?

Avant de commencer la microchirurgie D air, un cathéter connecté à une seringue d’un millilitre avec 0,9 % de chlorure de sodium. Ensuite, rasez doucement la face antérieure du scrotum droit, ainsi que la cuisse et l’aine droites d’une souris mâle anesthésiée de 20 à 25 milligrammes. Ramassez tous les poils lâches à l’aide d’un coton-tige humidifié, puis placez la souris côté ventral vers le haut sur une platine d’observation en plexiglas, fabriquée sur mesure, composée d’une plaque de base et d’une deuxième plaque sur le bord de la dorlote de la plaque de base pour l’élévation des deux pattes arrière et du scrotum.

Après avoir fixé les pieds avec un drapé élastique, placez la scène sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de l’animal à 37 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’un grossissement de 10 à 16 fois, utilisez un microscope de dissection et une paire de ciseaux pour faire une incision initiale au niveau de la cuisse droite, juste en avant des vaisseaux fémoraux du genou à l’aine. Identifiez l’artère fémorale et suivez-la de près, en mobilisant l’artère des tissus mous environnants.

Ensuite, à l’aide de la thermocautérisation, identifiez et coupez une grande branche artérielle menant au testicule gauche. Placez une suture de six oh prolene stay superficiellement au testicule gauche. Ensuite, identifiez et thermo-cautérisez la grande branche artérielle qui court médialement au niveau de la cuisse.

Ensuite, en utilisant une traction douce, ligaturez l’artère fémorale au niveau de la partie distale de la cuisse droite, puis placez une suture autour de l’artère fémorale proximale aussi près que possible du centre de l’animal. Maintenant, placez un nœud lâche autour de l’artère fémorale, mais ne l’attachez pas. Appliquez ensuite une légère traction sur la suture pour créer un pli artériel.

Après avoir établi le pliage, utilisez une paire de micro-ciseaux pour dimensionner soigneusement l’artère, en prenant soin de ne pas endommager la veine fémorale. Ensuite, insérez le microcathéter préalablement préparé dans l’incision. Desserrer soigneusement le pliage pour faciliter le passage du cathéter.

Le flux sanguin artériel doit être immédiatement visible à l’intérieur du cathéter. Avancez lentement le cathéter de quelques millimètres au-delà du pli précédent. Attachez ensuite la ligature préparée pour la fixation du cathéter.

Maintenant, rincez doucement le cathéter avec le chlorure de sodium, puis aspirez la solution pour confirmer la position correcte du cathéter. Utilisez un morceau de ruban adhésif pour fixer davantage le cathéter à l’étape de l’opération. Une fois que le cathéter a été correctement fixé et déplacé sur le côté, coupez la peau et le fascia au-dessus de la face ventrale du scrotum droit.

En prenant soin de ne pas toucher le tissu sous-jacent avec des instruments. Étendez l’incision jusqu’au pli inguinal et dorlotez jusqu’à l’extrémité distale du scrotum. Ensuite, séparez soigneusement les tissus mous et conjonctifs sous-jacents au-dessus du sac crémaster sans toucher le tissu lui-même.

Placez ensuite une suture à six oh prolene stay à l’extrémité distale du crémaster pour étendre légèrement le muscle. Ensuite, tirez doucement le muscle vers l’avant et la moelle pour réséquer les tissus mous restants sous le sac musculaire. Après la séparation complète du tissu conjonctif, utilisez une paire de ciseaux pour ouvrir le sac C master au bord du crâne et étendez l’incision de cette ouverture jusqu’à l’extrémité distale du muscle.

Après la cautérisation thermique du petit vaisseau reliant le testicule sur le crémaster, utilisez des ciseaux pour couper les connexions restantes entre le muscle et le testicule. Le crémaster ouvert sera maintenant posé à plat sur la scène. Placez maintenant quatre six sutures de maintien oh prolene sur les bords du tissu et fixez-les avec le drapé élastique.

Afin d’étaler le tissu musculaire crémaster à partir de ce point, utilisez une seringue d’un millilitre pour humidifier continuellement le tissu avec du PBS. Après que la préparation ait reposé pendant 15 minutes, injectez 0,05 à 0,1 millilitre de dextrine à 1 % de rodine via l’artère fémorale gauche pour augmenter le contraste de la microvascularisation. Maintenant, déplacez la souris et la platine sous un dispositif couplé à la charge.

Microscope à fluorescence connecté par caméra vidéo, modifié pour l’éclairage épi, en prenant un soin particulier à ne pas disloquer le cathéter de l’artère fémorale. Après avoir ajusté l’objectif d’immersion dans l’eau pour une visualisation suffisante de la microcirculation chma, six SE post-capillaires ont été définis stochastiquement pour une analyse ultérieure de l’adhérence des cellules souches fermes. Ensuite, chargez une seringue d’un millilitre avec 200 microlitres de cellules souches de moelle osseuse de donneur fluorescentes précédemment étiquetées.

Tapotez doucement la seringue pour réanimer, suspendez la suspension cellulaire, puis administrez les cellules à travers le cathéter fémoral en injections de 40 microlitres pour un total de cinq injections consécutives. Enregistrez le roulement de la cellule souche immédiatement après l’injection de cellule. Définir le roulis comme une réduction de plus de 50 % de la vitesse cellulaire le long de la muqueuse endothéliale en combinaison avec les mouvements typiques de stick cellulaire et de relâchement.

Une fois la microscopie intra-vitale terminée, retirez soigneusement le muscle crémaster et rangez-le pour une analyse ultérieure. En général, l’interaction des cellules souches ou progénitrices directement injectées avec l’endothélium vasculaire dans la microcirculation musculaire crémaster est un événement rare et se produit exclusivement dans les cellules post-capillaires en raison du marquage fluorescent. Les cellules roulantes, comme l’indique la pointe de flèche noire, et les cellules souches fermement adhérentes, comme l’indiquent les flèches blanches, peuvent être clairement distinguées des leucocytes endogènes circulants dans l’es.

Les conditions micro-circulatoires représentées par la vitesse du flux sanguin et le taux de cisaillement de la paroi ne diffèrent généralement pas de manière significative entre les groupes expérimentaux respectifs avec différents traitements par chimiokine. Traitement local du tissu musculaire du maître ker avec différentes chimiokines ou médiateurs de la réponse inflammatoire. Par exemple, le facteur 1 alpha dérivé des cellules stromales ou le facteur alpha de nécrose tumorale est capable d’imiter des conditions microenvironnementales spécifiques.

De telles conditions améliorent les interactions entre les cellules souches et les cellules endothéliales à des degrés divers en fonction de la chimiokine ou du médiateur spécifique appliqué et de la population de cellules souches injectées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les interactions entre les cellules souches et les cellules ales in vivo grâce à la microscopie intravitale de la microcirculation musculaire CreER.