Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

L'objectif général de l'expérience suivante est de développer un modèle de culture neuronale humaine, d'identifier des marqueurs neuronaux et d'isoler une population pure de neurones pour une analyse d'expression génique. Ceci est réalisé en premier lieu en amplifiant des cellules souches neurales humaines afin de créer un approvisionnement continu en cellules progénitrices. Dans un deuxième temps, les cellules progénitrices neurales sont cultivées en présence de suppléments de différenciation et de facteurs de croissance neurotrophiques, dans des boîtes traitées avec des facteurs d'attachement.

Ensuite, une coloration immunofluorescente pour les marqueurs neuronaux est réalisée afin de déterminer le destin des cellules progénitrices neuronales différenciées. Enfin, une microdissection au laser de neurones cultivés sur des lames en membrane PEN est effectuée pour faciliter l'analyse de l'expression génique spécifique aux neurones. Les résultats obtenus montrent que les cellules progénitrices neuronales différenciées sont principalement de nature neuronale.

Sur la base de la coloration immunofluorescente et de la capture de neurones. Par microdissection laser assistée, les cellules souches neurales humaines peuvent être amplifiées et différenciées en cultures riches en neurones. Pour les études in vitro, comme ces cultures contiennent quelques cellules gal, nous pouvons utiliser la microdissection laser assistée pour isoler une population pure de neurones.

Les procédures seront démontrées par Ron Bouchard, un chercheur associé senior de notre plateforme de microscopie. Pour commencer cette procédure, décongelez rapidement un stock congelé de cellules souches neurales humaines isolées du cerveau fœtal en les réchauffant à 37 degrés Celsius, puis ajoutez-les à un flacon T75 contenant 15 millilitres de milieu neurobasal préchauffé, enrichi de 10 nanogrammes par millilitre d'EGF et de FGF. Après avoir cultivé les cellules pendant trois jours, transférez les neurosphères dans un tube de 15 millilitres et faites-les précipiter par centrifugation à 1000 tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, jetez le surnageant en laissant environ 100 microlitres de milieu, puis transférez le culot cellulaire dans un tube Eppendorf.

Un culot cellulaire de 100 microlitres suffit pour être réparti entre deux flacons T 75. S'il est moindre, réduire le nombre de flacons car les cellules progénitrices neuronales ne parviennent pas à proliférer. Si la répartition est faible, alors dissocier soigneusement les neurosphères en une suspension monocellulaire en aspirant et expulsant 50 fois à l’aide d’une pipette, tout en maintenant la pipette de 200 microlitres contre le fond du tube.

Vérifiez visuellement l'avancement à l'aide d'un microscope afin de vous assurer de la dissociation des neurosphères. Ensuite, divisez équitablement la suspension cellulaire et ajoutez-la à deux flacons T 75. L'un pour la poursuite de l'expansion et l'autre pour la différenciation.

Incuber ensuite les flacons. Changer le milieu des cellules progénitrices neuronales dans le flacon destiné à l'expansion par centrifugation, puis éliminer l'ancien milieu et ajouter du milieu neuf.

Changer le milieu toutes les quatre à cinq journées jusqu'à ce que les neurosphères atteignent leur taille initiale de 300 à 500 microns. Pour commencer la différenciation des cellules progénitrices neuronales en une culture riche en neurones, placer un seul lambeau dans chaque puits d'une plaque de 24 puits et recouvrir en ajoutant 500 microlitres de poly-L-lysine à 100 microgrammes par millilitre dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 30 minutes à température ambiante, puis aspirer la solution de poly-L-lysine.

Rincez la plaque avec de l’eau stérile déionisée et aspirez à nouveau. Ensuite, recouvrez les puits de la plaque de 500 microlitres de laminine murine à cinq microgrammes par millilitre et incubez pendant 30 minutes. Après l’incubation, lavez les puits au PBS, aspirez à nouveau, puis laissez-les sécher dans la hotte de culture tissulaire. Quatre jours après le fractionnement des cellules, transférez les petits neurosphères du flacon marqué pour la différenciation vers la plaque 24 puits revêtue.

Ajouter une densité d'environ 500 neurosphères par puits après une incubation de six heures. Une fois que les neurosphères se sont fixées au plat, retirer le milieu de prolifération et ajouter le milieu de différenciation, composé du milieu neurobasal, du supplément B-27, du N-G-F, du B-D-N-F, du D-B-C et de l'acide rétinoïque. Remettre la plaque dans l'incubateur. Après deux semaines de culture des cellules progénitrices neuronales dans le milieu de différenciation neuronale, on obtient une culture riche en neurones.

Rincez les neurones une fois dans du PBS, puis fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes. Une fois la fixation terminée, rincez les cellules trois fois avec du PBS. Préparez ensuite les cellules pour la coloration immunohistochimique en les incubant avec un tampon perméabilisant à température ambiante pendant 60 minutes.

Ensuite, ajoutez des anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3 % de BSA en PBS dans les puits. Ajoutez une paire différente d'anticorps dans chaque puits, puis incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius dans un agitateur. Le lendemain matin, lavez les lamelles trois fois avec du PBS, puis incubez-les avec les anticorps secondaires anti-lapin P SI trois et anti-US fitzy, à température ambiante et à l'abri de la lumière, pendant 90 minutes après l'incubation.

Lavez les lamelles trois fois au PBS. Ensuite, déposez 10 microlitres de milieu de montage sur une lame de verre. Retirez la lamelle de la boîte de culture et placez-la à l’envers sur le milieu de montage.

Essuyez délicatement tout excès de milieu de montage et scellez les bords avec du vernis à ongles. Pour préparer les cellules en vue de la microdissection, différenciez d'abord les cellules progénitrices neuronales en une culture riche en neurones sur une membrane PEN. Lames recouvertes de poly-L-lysine et de laminine.

Réalisez toutes les étapes suivantes dans des conditions sans ARN. Ensuite, coloriez les cultures à l’aide de la coloration histo gene afin de visualiser les cellules : la coloration histo gene colore les noyaux en violet et le cytoplasme en rose pâle, ce qui permet facilement de distinguer les neurones des cellules gliales selon leurs morphologies distinctes. Placez la lame dans de l’éthanol à 75 % puis dans de l’eau stérile désionisée pendant 30 secondes.

Ensuite, placez la lame sur un essuie-tout Kim. Ajoutez 200 microlitres d'histo-gène et attendez 20 secondes. Ensuite, placez la lame successivement pendant 30 secondes chacun dans de l'eau stérile désionisée, de l'éthanol à 75 %, de l'éthanol à 95 % et de l'éthanol à 100 %.

Ensuite, placer dans le xylène pendant cinq minutes et sécher sur un essuie-tout Kim pendant cinq minutes. Puis placer une lame avec membrane PEN par-dessus une lame ordinaire et insérer le tout dans le système de microdissection par capture laser Veritas ou dans le système LCM à l’aide du logiciel. Acquérir une image de repérage pour localiser les zones contenant des populations neuronales pures, dépourvues d'astrocytes.

Marquez ces neurones à l'aide des outils de dessin. Ensuite, effectuez la capture laser de ces zones à l'aide d'une précision et d'une automatisation contrôlées par ordinateur selon un processus en deux étapes. Premièrement, un rayon infrarouge est émis à plusieurs endroits avec un réglage de puissance laser de 70 milliwatts et une impulsion de 2 500 microsecondes afin d'attacher la membrane au capuchon.

Ensuite, la zone marquée est excisée à l’aide d’un outil de découpe UV réglé sur un niveau bas de 10 millivolts. La combinaison de ces procédés permet de capturer de façon sélective les zones marquées sur des embouts macro LCM. Lorsqu'au moins 100 neurones ont été capturés, utilisez un microscope pour retirer la membrane de l'embout et la placer sur un tube.

Isoler l'ARN total à partir d'échantillons de microdissection laser en utilisant un kit d'isolement d'ARN P OPU et traiter avec des DNAses. Ensuite, amplifier l'ARN isolé à l'aide d'un kit d'amplification d'ARN ribo amp en suivant les instructions du fabricant. Enfin, réaliser une analyse de R-T-P-C-R en temps réel à l'aide de sondes TAC MAN pour détecter la chaîne lourde du neurofilament humain.

Un enrichissement en neurones est obtenu par la différenciation de neurosphères âgées de quatre jours, en utilisant des surfaces revêtues de poly-L-lysine et de laminine, en combinaison avec des facteurs de croissance spécifiques à la différenciation. Après deux semaines, un enrichissement en neurones, tel que montré ici, est observé dans les zones de faible densité. Les cellules peuvent se différencier en astrocytes, comme ceux visibles ici.

La différenciation des astrocytes peut également être induite en utilisant le facteur de croissance CNTF, au lieu de ceux employés pour la différenciation neuronale. La différenciation neuronale peut être identifiée à l'aide d'anticorps dirigés contre les marqueurs neuronaux spécifiques, comme le nouveau N et la synapsine, l'acétylcholinestérase et la synaptophysine, ainsi que le BDNF et le GAAP 43. Une coloration positive constitue la preuve que les cellules différenciées possèdent des caractéristiques propres aux neurones primaires. De plus, les astrocytes peuvent être identifiés par une coloration immunohistochimique positive pour Stat3 et GAP.

La microdissection par capture laser de neurones est réalisée sur des cellules différenciées sur des lames recouvertes de membrane PEN enduites de poly-L-lysine et de laminine. Les lames illustrées ici montrent des neurones colorés avec un colorant histologique. Afin de visualiser les cellules, les cellules d'intérêt peuvent ensuite être délimitées à l'aide d'un laser, qui fait fondre la membrane PEN, provoquant son adhérence au capteur placé au-dessus. En fin de compte, de nombreuses cellules peuvent être délimitées et capturées sur le même capteur pour une analyse d'ADN ou d'ARN.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des neurones à l'aide de la microdissection par capture au laser.