Name: Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez la microdissection laser de neurones à partir de cellules neuroprogenitrices humaines différenciées. Cette méthode permet d'isoler des populations neuronales pures pour l'analyse d'expression génique en neurosciences.

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Une. Expansion des PNJ humaines (Figure 1) <ol><li> Renouer avec le stock congelé de PNJ humains de cerveau fœtal (Lonza, Walkersville, MD, USA) et de la culture leur en suspension dans flacons T-75 que neurosphères (figure 1A) en milieu neurobasal contenant des suppléments de prolifération, l&#39;EGF (10 ng / ml) et FGF (10 ng / ml). </li><li> Après 3 jours de culture, les neurosphères transférer à un tube de 15 ml et centrifuger à 500 rpm pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant laissant derrière lui ~ 100 ul de milieu au-dessus du culot de cellules et les transférer dans un tube Eppendorf. Un culot cellulaire 100 pi est assez de se scinder en deux T-75 flacons. Si moins, réduire le nombre de flacons que les cellules neuroprogenitor incapables de proliférer si diviser mince. </li><li> On triture le culot avec un embout de 200 ul 50x tout en maintenant la pointe de 200 pi par rapport au fond du tube. Divisez la suspension cellulaire aussi en deux parties et les ajouter à 2 T-75 flacons (1-2 split), un pour la poursuitel&#39;expansion et l&#39;autre pour la différenciation. </li><li> Continuer la culture des cellules neuroprogenitor d&#39;expansion (premier flacon) en changeant le milieu tous les 4-5 jours jusqu&#39;à ce que les neurosphères atteignent leur taille originale de 300 à 500 um. Changer le milieu par centrifugation (500 rpm, 5 min), jetez le support et ajouter un nouveau milieu. </li></ol> 2. Différenciation des PNJ humain dans une culture Neuron riche (Figure 2) <ol><li> Pour la différenciation des cellules dans un neuroprogenitor riche culture des neurones, placer une lamelle couvre-objet unique dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits et le manteau avec 100 ug / ml de poly-L-lysine en ajoutant 500 ul dans chaque puits. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer le-poly L-lysine solution et rincez la plaque avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Ensuite, recouvrir les puits de la plaque avec 500 pi de 5 ug / ml de laminine de la souris et incuber pendant 30 min. Après incubation, laver les puits avec du PBS. </li><li> 4 jours après splitting les cellules (étape 1.4), transférer les petites neurosphères dans le flacon étiqueté «pour la différenciation» dans les boîtes revêtues à une densité de ~ 500 neurosphères par puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Après 6 heures, lorsque les neurosphères attachent à plat, retirez le support de la prolifération et ajouter du milieu de différenciation consistant en milieu neurobasal, supplément B27, NGF (20 ng / ml), le BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), et l&#39;acide rétinoïque (2 uM). </li></ol> 3. Immunofluorescence de PNJ différenciés (Figure 3) <ol><li> Suite à la culture de cellules dans un milieu de neuroprogenitor différenciation neuronale pendant deux semaines, une culture de neurones riche est obtenu. Rincer les neurones une fois dans du PBS, puis les fixer à 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Une fois fixé, rincer les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Incuber les cellules avec un tampon de perméabilisation (5% de BSA et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS) à température ambiante pendant 60 min. </li><li> Incuber les boîtes O / N à 4 ° C ina shaker avec la combinaison suivante d&#39;anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3% de BSA dans du PBS: NeuN (1:250) et synapsine (1:250); acétylcholinestérase (1:500) et la synaptophysine (1:250); BDNF (1 : 500) et GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) et GFAP (1:1000). </li><li> Laver trois fois les lamelles couvre-objet avec du PBS, puis de les incuber avec des anticorps anti-lapin-Cy3 et des anticorps secondaires anti-souris-FITC à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 90 min. Après l&#39;incubation, les lamelles laver trois fois avec du PBS. </li><li> Placer 10 ul de milieu de montage sur une lame de verre, prendre la lamelle de la boîte de culture avec une pince, et placez-le à l&#39;envers sur le support de montage. Doucement, essuyer tout support de montage excès et sceller les bords avec du vernis à ongles. </li><li> Examiner les neurones immunocolorées dans un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. Microdissection laser de neurones (Figure 4) <ol><li> Différencier les PNJ dans une culture de neurones riches sur PEN lame de membranes recouvertes de poly-L-lysine et de laminine de souris en suivant les procédures décrites pour la figure 2. </li><li> Effectuez toutes les étapes ultérieures dans des conditions RNAse-libres. </li><li> Colorer les cultures en utilisant HistoGene Stain (Arcturus) pour visualiser les cellules. </li><li> Trouver les zones de populations neuronales purs dépourvus des astrocytes en utilisant l&#39;image de feuille de route de la diapositive entière avec le système Veritas LCM. Marquez les neurones en utilisant les outils de dessin. </li><li> Effectuer capture laser de ces zones à l&#39;aide de précision contrôlé par ordinateur et d&#39;automatisation d&#39;un processus en deux étapes. Tout d&#39;abord, IR (infrarouge) est tiré à plusieurs endroits avec un réglage de la puissance du laser de 70 mW et une impulsion de 2500 microsecondes pour obtenir la membrane joindre à la capsule. Ensuite, la zone marquée est excisée à l&#39;aide d&#39;un outil de coupe UV à un réglage bas de niveau de 10 mV. </li><li> Combinaison de ces procédés capture sélectivement les zones marquées de la membrane PEN sur CapSure LCM macro bouchons. Lorsque le capuchon est levé, la membrane avec le neurons adhère à la capsule. </li><li> Isoler l&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons LCM en utilisant un kit d&#39;isolement PicoPure ARN (Arcturus) et traiter avec de la DNase. </li><li> Amplifier l&#39;ARN isolé en utilisant le kit d&#39;amplification RiboAMP ARN en suivant les instructions du kit. </li><li> Effectuer l&#39;analyse en temps réel RT-PCR utilisant des sondes TaqMan pour détecter neurofilaments humaine chaîne lourde (hNFHc). </li></ol> Abréviations: AD, la maladie d&#39;Alzheimer; BDNF, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau; CREB, protéine de liaison à l&#39;élément de réponse à l&#39;AMP cyclique; DBC, dibutyryl AMP cyclique, l&#39;EGF, le facteur de croissance épidermique; FGF, facteur de croissance fibroblastique, GFAP, protéine acide fibrillaire gliale, LCM, laser microdissection, NGF, facteur de croissance nerveuse; PNJ, neuroprogenitor cellule; PEN, polyéthylènenaphtalate.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Nous décrivons dans la présente étude, un modèle de culture cellulaire neurone-riche par différenciation de cellules humaines neuroprogenitor auto-renouvellement et une méthode pour isoler une population pure de neurones par microdissection par capture laser. Nous avons utilisé une combinaison de NGF, BDNF, DBC et l&#39;acide rétinoïque pour la différenciation neuronale des PNJ. DBC est utilisé pour activer CREB, un facteur de transcription qui augmente la neurogénèse 12. L&#39;acide rétinoïque induit la sort...

Long de la vie neurogénèse est connu pour se produire dans la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et dans la couche sous-granulaire du gyrus denté de l&#39;adulte cerveau des mammifères 1. cellules Neuroprogenitor (PNJ) qui proviennent de ces régions sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes 2. PNJ ont suscité un intérêt en raison de leur potentiel à être transplantés chez des patients atteints de divers troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, accidents vasculaires cérébraux et la maladie (AD) 3 d&#39;Alzheimer. Des études avec des PNJ ont généralement porté sur cet angle de la transplantation mais le potentiel de neurones NPC dérivés comme un modèle de culture cellulaire afin de déterminer le mécanisme de neurodégénérescence n&#39;a pas été pleinement exploité. Des études antérieures ont généralement utilisé des neurones post-mitotiques, isolé à partir de tissus de cerveau de rongeur qui doivent être isolés pour chaque expérience comme ils ne sont pasauto-renouvellement. Bien que des lignées de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, y compris les cellules et SK-N-MC peuvent être étendus, ils n&#39;ont pas les caractéristiques des neurones primaires. PNJ humains, d&#39;autre part, offrent des avantages car ils peuvent être développées pour de multiples passages et peuvent être différenciées pour générer une population de cellules avec des caractéristiques de neurones primaires 4,5. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole de différenciation pour obtenir une population de neurones riches en uniforme de PNJ disponibles dans le commerce isolées de cerveau fœtal humain. Parce que ces cultures ne contiennent un petit pour cent des cellules gliales, nous avons besoin d&#39;autres méthodes pour isoler une population pure de neurones pour la caractérisation moléculaire. microdissection par capture laser (LCM) est une nouvelle technique par laquelle une population homogène de cellules provenant d&#39;une section de tissu peut être capturé de manière sélective pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène 6. Le cerveau est un tissu hétérogène constitué par les neurones, des cellules gliales et des cellules d&#39;autres types. LCM a été utilisée pour déterminer l&#39;expression génique spécifique des neurones analyses 7-10. Nous avons déjà effectué LCM de neurones de l&#39;hippocampe de AD (Tg2576) des coupes de cerveau de souris pour montrer diminution de l&#39;expression de la protéine de liaison cyclique élément de réponse AMP (CREB) et BDNF spécifiquement dans les neurones hippocampiques 11. Dans la présente étude, nous décrivons les procédures pour l&#39;expansion des PNJ humains, la différenciation neuronale, immunofluorescence pour marqueurs neuronaux et LCM pour l&#39;isolement des neurones cultivés sur des lames de membrane PEN.

<table><tbody><tr><td>Cellules neuroprogénitrices (NPC) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Milieu basal humain</td><td>Technologie des cellules souches</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Supplément de prolifération</td><td>Technologie des cellules souches</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Supplément de différenciation</td><td>Technologie des cellules souches</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain</td><td>Technologie des cellules souches</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé </td><td>du cerveau Signalisation cellulaire</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclique AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Laminine de souris </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps STAT3</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFAP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GAP43</td><td>Laboratoires de transduction</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps BDNF</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Acétylcholinestérase </td><td>Anticorps Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-synaptophysine</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps NeuN</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Synapsin</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti souris FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoires</td><td></td><td></td>de recherche</tr><tr><td>Anti Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoires</td><td></td><td></td>de recherche</tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (Big circle cover slip)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage (Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de stylo</td><td>Biosystems</td><td>appliqués LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Histogene LCM kit de coloration de section congelée</td><td>Biosystems Applied</td><td>biosystems KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp RNA Amplification</td><td></td><td>Kit KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARN Picopure</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM caps</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées neuroprogenitor humaines en culture

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

cellules Neuroprogenitor (PNJ) isolés du cerveau fœtal humain ont été développés dans des conditions de prolifération en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) de fournir une offre abondante de cellules. NPC ont été différenciées en présence d&#39;une nouvelle combinaison de facteur de croissance nerveuse (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le dibutyryl cAMP (DBC) et de l&#39;acide rétinoïque sur des boîtes revêtues de poly-L-lysine et de laminine de souris pour obtenir neurone riches cultures. NPC ont également été différenciés en l&#39;absence de neurotrophines, DBC et l&#39;acide rétinoïque et en présence de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) pour produire des cultures d&#39;astrocytes riches. PNJ différenciés ont été caractérisées par immunofluorescence pour un panel de marqueurs neuronaux dont NeuN, synapsine, l&#39;acétylcholinestérase, synaptophysine et GAP43. Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et STAT3, marqueurs d&#39;astrocytes, ont été détectés dans 10-15% des PNJ différenciées. Pour faciliterCaractérisation moléculaire spécifique de type cellulaire, microdissection par capture laser a été réalisée pour isoler des neurones en culture sur le polyéthylène naphtalate (PEN) coulisse de la membrane. Les méthodes décrites dans cette étude constituent des outils précieux pour faire avancer notre compréhension du mécanisme moléculaire de la neurodégénérescence.

Expansion des PNJ (Figure 1) Lorsque neurosphères sont décomposées à une suspension de cellules individuelles par la trituration, l&#39;embout de pipette a besoin de toucher le fond du tube de sorte qu&#39;il existe une certaine résistance lorsque la suspension est introduite à la pipette de haut en bas. Le nombre de fois de trituration varie entre les individus et doit être décidé par essais et erreurs en examinant la suspension cellulaire obtenue sous un microscope. Il est es...

Cellules neuroprogenitor humaines (CNP) ont été élargis dans des conditions de prolifération. NPC ont été différenciées en cultures de neurones riches en présence d&#39;une combinaison de neurotrophines. Marqueurs neuronaux ont été détectés par immunofluorescence. Pour isoler une population pure de neurones, les PNJ ont été différenciés sur des lames de membrane PEN et microdissection laser a été effectuée.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de développer un modèle de culture neuronale humaine, d'identifier des marqueurs neuronaux et d'isoler une population pure de neurones pour une analyse d'expression génique. Ceci est réalisé en premier lieu en amplifiant des cellules souches neurales humaines afin de créer un approvisionnement continu en cellules progénitrices. Dans un deuxième temps, les cellules progénitrices neurales sont cultivées en présence de suppléments de différenciation et de facteurs de croissance neurotrophiques, dans des boîtes traitées avec des facteurs d'attachement.Ensuite, une coloration immunofluorescente pour les marqueurs neuronaux est réalisée afin de déterminer le destin des cellules progénitrices neuronales différenciées. Enfin, une microdissection au laser de neurones cultivés sur des lames en membrane PEN est effectuée pour faciliter l'analyse de l'expression génique spécifique aux neurones. Les résultats obtenus montrent que les cellules progénitrices neuronales différenciées sont principalement de nature neuronale.Sur la base de la coloration immunofluorescente et de la capture de neurones. Par microdissection laser assistée, les cellules so

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Compartmentalisation des neurones dérivés des cellules souches humaines dans des puces microfluidiques en plastique pré-assemblées

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.

Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Découvrez la microdissection laser de neurones à partir de cellules neuroprogenitrices humaines différenciées. Cette méthode permet d'isoler des populations neuronales pures pour l'analyse d'expression génique en neurosciences.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

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