Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

L’objectif global de l’expérience suivante est de développer un modèle de culture neuronale humaine, d’identifier des marqueurs neuronaux et d’isoler une population pure de neurones pour l’analyse de l’expression génique. Ceci est réalisé en développant d’abord les cellules neuroprogénitrices humaines pour créer un approvisionnement continu de cellules progénitrices. Dans un deuxième temps, les cellules neuroprogénitrices sont cultivées en présence de suppléments de différenciation et de facteurs de croissance neurotrophiques dans des boîtes recouvertes de facteurs d’attachement.

Ensuite, une coloration immunofluorescente des marqueurs neuronaux est effectuée pour déterminer le devenir des cellules neuroprogénitrices différenciées. Enfin, la microdissection par capture laser de neurones cultivés sur des lames de membrane PEN est réalisée pour faciliter l’analyse de l’expression génique spécifique aux neurones. Les résultats obtenus montrent que les cellules neuroprogénitrices différenciées sont principalement de nature neuronale.

Basé sur la coloration immunofluorescente et la capture des neurones. Par microdissection par capture laser, les cellules neuroprogénitrices humaines peuvent être développées et différenciées en cultures riches en neurones. Pour les études in vitro, comme ces cultures ont des cellules gal, nous pouvons utiliser la microdissection par capture laser pour isoler une population pure de neurones.

Ron Bouchard, associé de recherche principal à notre plateforme de microscope, fera la démonstration de ces procédures. Pour commencer cette procédure, faites revivre un stock congelé de cellules neuroprogénitrices humaines isolées du cerveau fœtal en les réchauffant rapidement à 37 degrés Celsius, puis en les ajoutant à un T 75 contenant 15 millilitres de milieu neurobasal préchauffé, complété par 10 nanogrammes par millilitre, EG, F et FGF. Après avoir cultivé les cellules pendant trois jours, transférez les neurosphères dans un tube de 15 millilitres et granulez-les par centrifugation à 1000 tr/min pendant cinq minutes après la centrifugation, jetez le surnageant, laissant derrière vous environ 100 microlitres de milieu, et transférez la pastille cellulaire dans un tube einor.

Une pastille de 100 microlitres suffit à diviser en deux flacons T 75. S’il y en a moins, réduisez le nombre de flacons, car les cellules neuroprogénitrices ne prolifèrent pas. S’ils sont divisés finement, décomposez complètement les neurosphères en une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas 50 fois tout en maintenant l’embout de 200 microlitres contre le fond du tube.

Vérifiez visuellement la progression à l’aide d’un microscope pour assurer la dissociation des neurosphères. Ensuite, divisez la suspension cellulaire en parts égales et ajoutez-la dans deux flacons T 75. L’un pour l’expansion continue et l’autre pour la différenciation.

Incuber ensuite les flacons. Changer le milieu des cellules neuroprogénitrices dans le ballon marqué pour l’expansion par centrifugation. Ensuite, j’ai jeté l’ancien support et ajouté un nouveau support.

Changez de milieu tous les quatre à cinq jours jusqu’à ce que les neurosphères atteignent leur taille d’origine de 300 à 500 microns. Pour commencer la différenciation cellulaire des neuroprogéniteurs en une culture riche en neurones, placez une seule lamelle dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et enduisez-la en ajoutant 500 microlitres de 100 microgrammes par millilitre de lysine poly L à chacun. Bien incuber les plats pendant 30 minutes à température ambiante, puis aspirer la solution de polyol lysine.

Rincez la plaque avec de l’eau stérile déminéralisée et aspirez à nouveau. Ensuite, enduisez les puits de la plaque avec 500 microlitres de cinq microgrammes par millilitre, de la laminine de souris et incubez pendant 30 minutes après l’incubation, lavez à nouveau les puits avec de l’aspiration PBS et laissez-les sécher dans le capot de culture tissulaire. Quatre jours après la division des cellules, transférez les petites neurosphères du flacon marqué pour la différenciation dans la plaque à 24 puits revêtue.

Ajoutez une densité d’environ 500 neurosphères par puits après l’incubation pendant six heures lorsque les neurosphères se sont fixées à la parabole, retirez le milieu de prolifération et ajoutez de la différenciation. Milieu composé d’un milieu neurobasal B27, d’un supplément N-G-F-B-D-N-F-D-B-C et d’acide rétinoïque. Remettre la plaque dans l’incubateur après culture de cellules neuroprogénitrices dans un milieu de différenciation neuronale pendant deux semaines, une culture riche en neurones est obtenue.

Rincez les neurones une fois dans du PBS, puis fixez-les dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % pendant 30 minutes. Une fois fixées, rincez les cellules trois fois avec du PBS. Préparez ensuite les cellules pour l’immunocoloration en les incubant avec un tampon perméable à température ambiante pendant 60 minutes.

Ensuite, ajoutez des anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3 % de BSA dans le PBS dans les puits. En ajoutant une paire d’anticorps différente dans chacun, incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans un agitateur le lendemain matin. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS, puis incubez-les avec des anticorps secondaires anti-lapin P SI trois et anti-US, à température ambiante, dans l’obscurité, pendant 90 minutes après l’incubation.

Lavez les lamelles trois fois avec du PBS. Placez ensuite 10 microlitres de support de montage sur une lame de verre. Retirez la lamelle du plat de culture et placez-la à l’envers sur le support de montage.

Essuyez délicatement tout excès de support de montage et scellez les bords avec du vernis à ongles. Pour préparer d’abord les cellules à la microdissection, différenciez les cellules neuroprogénitrices en une culture riche en neurones sur la membrane du PEN. Lames recouvertes de poly L, de lysine et de laminine.

Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions sans ARN. Ensuite, colorez les cultures à l’aide de la coloration du gène histo pour visualiser les cellules Le gène histo colore les noyaux en violet et le cytoplasme, en rose clair, ce qui permet de différencier facilement les neurones et les cellules gliales par leurs morphologies distinctes. Placez la lame dans de l’éthanol à 75 % et de l’eau stérile désionisée pendant 30 secondes.

Placez ensuite la diapositive sur une lingette Kim. Ajoutez 200 microlitres de gène histo et attendez 20 secondes. Ensuite, placez la lame séquentiellement pendant 30 secondes chacune dans de l’eau stérile désionisée, 75 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et 100 % d’éthanol.

Ensuite, placez dans du xylène pendant cinq minutes et séchez sur une lingette Kim pendant cinq minutes. Placez ensuite une membrane PEN Slide sur la lame ordinaire et placez-les dans le système de micro-dissection à capture laser Veritas ou LCM à l’aide du logiciel. Prenez une image de carte routière pour trouver les zones de populations neuronales pures dépourvues d’astrocytes.

Marquez ces neurones à l’aide des outils de dessin. Ensuite, effectuez une capture laser de ces zones à l’aide de la précision et de l’automatisation contrôlées par ordinateur dans un processus en deux étapes. Tout d’abord, l’IR est tiré à plusieurs endroits avec un réglage de puissance laser de 70 milliwatts et une impulsion de 2 500 microsecondes pour fixer la membrane au capuchon.

Ensuite, la zone marquée est excisée à l’aide d’un outil de coupe UV à un réglage de bas niveau de 10 millivolts. La combinaison de ces processus permet de capturer de manière sélective les zones marquées sur les macro-capuchons LCM de capture. Lorsqu’un minimum de 100 neurones ont été capturés, utilisez un microscope pour retirer la membrane du capuchon et la placer sur un tube.

Isolez l’ARN total des échantillons de PPL à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN P OPU et traitez-le avec de l’ADN. Amplifiez ensuite l’ARN isolé à l’aide du kit d’amplification d’ARN ribo amp en suivant les instructions du kit. Enfin, effectuez une analyse R-T-P-C-R en temps réel à l’aide de sondes TAC MAN pour détecter la chaîne lourde de neurofilaments humains.

Une culture riche en neurones est obtenue par la différenciation de neurosphères âgées de quatre jours à l’aide de surfaces recouvertes de poly L lysine et de stratifié en combinaison avec des facteurs de croissance spécifiques à la différenciation. Après deux semaines, une culture riche en neurones montrée ici est obtenue dans les zones de faible densité. Les cellules peuvent se différencier en astrocytes comme ceux que l’on voit ici.

La différenciation des astrocytes peut également être dirigée en utilisant le facteur de croissance CNTF au lieu de ceux utilisés pour la différenciation des neurones. La différenciation des neurones peut être identifiée à l’aide d’anticorps dirigés contre les marqueurs neuronaux spécifiques, le nouveau N et la synapsine, l’acétylcholinestérase et la synaptophysine, et le BDNF et le GAAP 43. De plus, les astrocytes peuvent être identifiés grâce à une statistique trois positive et à une immunocoloration GAP.

La microdissection par capture laser des neurones est effectuée sur des cellules qui ont été différenciées sur une membrane PEN recouverte de poly L lysine et de laminine Les lames montrées ici sont des neurones colorés avec une coloration histo. Pour visualiser les cellules, les cellules d’intérêt peuvent ensuite être décrites à l’aide d’un laser, qui fait fondre la membrane du PEN, la faisant adhérer au capuchon de capture placé au-dessus d’elle. En fin de compte, de nombreuses cellules peuvent être délimitées et capturées sur le même chapeau pour l’analyse de l’ADN ou de l’ARN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neurones à l’aide de la microdissection par capture laser.