Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets
8 février 2014
Les emplacements en trois dimensions des objets faiblement diffusion peuvent être identifiés de manière unique à l'aide en ligne numérique microscopie holographique (SMIH), ce qui implique une modification mineure à un microscope standard. Notre logiciel utilise une heuristique d'imagerie simple, couplé avec Rayleigh-Sommerfeld rétro-propagation pour obtenir la position en trois dimensions et la géométrie d'un objet de phase microscopique.
L’objectif général de l’expérience suivante est de reconstruire la position 3D en géométrie d’une chaîne de cellules bactériennes nageantes. Pour ce faire, il faut d’abord faire croître les cellules bactériennes à la bonne concentration afin de fournir un échantillon approprié pour l’imagerie. Dans un deuxième temps, la source lumineuse LED est configurée et alignée, ce qui permet d’obtenir des images holographiques.
Ensuite, le logiciel de reconstruction est utilisé afin d’obtenir les coordonnées 3D d’une chaîne de cellules bactériennes. Les résultats montrent la capacité de reconstruire la position 3D et la configuration des cellules bactériennes sur la base de l’imagerie holographique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale est que l’imagerie volumétrique sans marquage est possible à des fréquences d’images élevées.
Pour commencer à inoculer, 10 millilitres de milieu KTY avec des cristaux de glace provenant d’un stock congelé de souche de streptocoque V 4 0 5 1 1 97 incuber la culture de démarrage dans un agitateur rotatif pendant la nuit à 35 degrés Celsius et 150 tr/min. Une fois qu’il a grandi, inoculez 10 millilitres de milieu KTY frais avec 500 microlitres de la culture de démarrage saturée. Incuber pendant 3,5 heures à 35 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres de 0,8 à 1,0.
Cela représente environ cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre. Diluez ensuite les cellules à une à 400 dans un milieu frais pour obtenir la concentration finale d’environ 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, remplissez une seringue de vaseline et faites un anneau de graisse d’un millimètre de hauteur sur une lame de microscope.
Placez ensuite une goutte de la solution d’échantillon au centre. Placez délicatement un verre de protection sur l’échantillon et appuyez légèrement sur le verre pour sceller les bords, en vous assurant que le liquide est en contact avec la lame et le verre de protection. La chambre d’échantillonnage résultante doit se trouver à une profondeur de 100 à 200 micromètres.
Faites pivoter une lentille d’immersion dans l’huile 60x en place et ajoutez une goutte d’huile. Placez ensuite la chambre d’échantillonnage sur la platine du microscope avec le verre de protection vers le bas. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme entre la lamelle en verre et la lentille.
Concentrez-vous sur la surface inférieure de la chambre d’échantillonnage, puis concentrez-vous sur le condenseur. Ensuite, éteignez l’éclairage standard et placez la tête LED derrière l’ouverture du condenseur du microscope. Assurez-vous que le condenseur est réglé sur le mode champ clair et réglez l’alimentation LED sur la puissance maximale.
Fermez ensuite l’ouverture du condenseur au maximum et poussez la LED dans sa monture jusqu’à ce que l’éclairage soit centré sur l’ouverture de l’objectif de l’objectif. Allumez l’ordinateur, puis redirigez le chemin de la lumière vers le port de la caméra du microscope. Réglez la fréquence d’images à 30 images par seconde et la taille de l’image à cinq 12 x cinq 12 pixels dans le logiciel d’acquisition d’images.
Vérifiez un histogramme d’intensité d’image pour vous assurer qu’aucune partie de l’image n’est saturée ou sous-exposée. Le temps d’exposition de l’image doit être aussi court que possible tout en conservant un bon contraste. Si les cellules s’accumulent près d’une interface, recentrez le microscope de manière à ce que les cellules bactériennes soient légèrement défocalisées.
Les cellules doivent se trouver à environ 10 à 30 microns du plan focal pour une reconstruction optimale. Après avoir refait la mise au point, acquérez une série d’images vidéo et enregistrez en tant que fichier VI décompressé. Lancez ensuite le logiciel DIHM disponible en téléchargement gratuit pour convertir une image vidéo en une pile d’images numériquement recentrée.
Des exemples de cadres sont fournis avec le logiciel pour commencer la reconstruction. Entrez le cadre qui vous intéresse et son arrière-plan sous forme de fichiers image séparés dans les boîtes. L’image d’arrière-plan représente fidèlement l’arrière-plan de la vidéo en l’absence de l’hologramme et sera utilisée pour supprimer tout bruit de motif fixe qui pourrait interférer avec la localisation et l’analyse holographiques.
Ensuite, entrez les paramètres de la pile de sortie dans les zones des paramètres globaux. Tout d’abord, entrez la position axiale de la première image dans la mise au point de départ. Entrez ensuite le nombre de tranches dans la pile reconstruite en nombre d’étapes, et enfin, entrez la distance réelle entre chaque tranche de la pile en taille de pas.
Définissez la taille du pas pour qu’elle soit la même que l’espacement latéral des pixels afin de reconstruire les objets avec les proportions correctes à l’aide des données de l’exemple. Cette valeur doit être de 0,233 micromètre. Ensuite, entrez l’éclairage, la longueur d’onde, l’indice de réfraction moyen de la caméra et la fréquence d’échantillonnage latérale.
Dans la boîte pixel par micron, la fréquence d’échantillonnage latéral de la caméra peut être trouvée en divisant le grossissement de l’objectif par la taille du capteur de la caméra. En utilisant les données de l’exemple, le nombre serait de 60 x divisé par 14 micromètres, ce qui équivaut à 4,29 pixels par micron. Ensuite, si le centre de l’objet est sombre dans l’hologramme, appuyez sur le bouton de dégradé Z retourné.
Cela appliquera un filtre qui extrait les objets sous le plan focal dans l’échantillon d’origine. Activez ensuite le filtre passe-bande, qui est responsable de la suppression de la contribution des pixels bruyants à l’image. Il est appliqué à chaque tranche d’image immédiatement après sa génération.
Ensuite, vérifiez l’état d’activation de l’interrupteur de sortie intermédiaire et assurez-vous qu’il est activé. Lorsque ces commutateurs sont activés, deux vidéos sont créées. La première sortie est la pile de refocus avec un nom de fichier se terminant par pile a V.La deuxième pile est l’opération de dégradé réelle avec un nom de fichier se terminant par dégradé a VI.Idéalement, cette deuxième pile contiendra l’objet d’intérêt mis en évidence comme un objet clair sur un fond sombre.
Après avoir défini tous les paramètres, appuyez sur exécuter dans la fenêtre principale pour exécuter les commandes. Le cadre sélectionné apparaîtra dans la boîte principale du logiciel. Utilisez ensuite l’outil loupe situé dans la barre d’outils à gauche de l’image pour effectuer un zoom avant ou arrière.
Utilisez l’outil rectangle pour sélectionner une région d’intérêt ou un retour d’intérêt et capturer autant de franges d’hologrammes que possible à l’intérieur du rectangle afin d’optimiser la reconstruction. Enfin, appuyez sur le bouton de processus pour générer les deux piles d’images distinctes. Inspectez les piles résultantes à l’aide de l’image J disponible sur ce site Web.
Si l’objet d’intérêt est clairement visible dans la pile d’images dégradées, passez à la section de rendu pour extraire les coordonnées de l’objet. Pour commencer le rendu, appuyez sur le bouton d’extraction de caractéristiques pour activer la fonction de localisation des coordonnées X, Y, Z. Entrez ensuite un chemin et une extension pour le fichier de coordonnées de sortie, sélectionnez le style de rayon POV dans la zone de style de coordonnées de sortie.
Cela amène le programme à écrire un fichier objet qui peut être visualisé à l’aide du progiciel gratuit de traçage de rayons POV, qui peut être obtenu sur ce site Web, à retraiter les images pour extraire les coordonnées des objets. Le programme fournira une série de coordonnées X, Y, Z dans le retour d’intérêt sélectionné écrit dans le nom de fichier dans la boîte des cordons de sortie. L’extraction des coordonnées d’objet prend beaucoup plus de temps que la génération des piles.
Assurez-vous que l’exemple de fichier de rayon POV fourni avec le code de reconstruction est présent dans le même dossier que le fichier de coordonnées de sortie. Modifiez l’exemple de fichier point pov et remplacez le nom du fichier entre guillemets sur la ligne. Inclure mon fichier NC avec le nom du fichier de données généré par le code de reconstruction.
Personnalisez ensuite la position de la caméra, l’éclairage, la texture et les options de rendu dans POV ray. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur le bouton Exécuter pour afficher une image bitmap. Il s’agit d’une image d’une chaîne de bactéries streptocoques qui a été momentanément orientée.
Terminez sur le plan focal. Les objets dans cette configuration sont difficiles à reconstruire et produisent généralement une goutte proche du plan focal. Voici une image correctement rendue représentative de la plupart des images de cette série dans lesquelles la chaîne n’est pas orientée directement le long de l’axe optique.
La forme et la position de l’objet sont fidèlement reproduites dans le rendu comme on le voit dans le panneau de droite. Une fois cette technique maîtrisée, cela peut être fait en quelques minutes.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude démontre l'utilisation de la microscopie holographique en ligne numérique (DIHM) pour reconstruire les positions tridimensionnelles et les géométries de cellules bactériennes en nage. La technique permet une imagerie volumétrique sans marquage à des fréquences élevées, offrant ainsi un avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Techniques d'imagerie
Contexte
- La microscopie holographique numérique en ligne (DIHM) est une technique de microscopie modifiée.
- Elle permet l'identification unique d'objets faiblement diffusants en trois dimensions.
- L'imagerie holographique peut capturer des processus dynamiques en temps réel.
- Les méthodes existantes, comme la microscopie confocale, nécessitent souvent un marquage, qui peut modifier le comportement des échantillons biologiques.
Objectif de l'étude
- Reconstruire la position 3D et la géométrie de cellules bactériennes en mouvement.
- Démontrer l'efficacité de la MDHI pour capturer la dynamique des cellules vivantes.
- Comparer les avantages de la MDHI par rapport aux méthodes d'imagerie traditionnelles.
Méthodes utilisées
- Préparation de cultures cellulaires bactériennes à des concentrations appropriées.
- Alignement d'une source lumineuse LED pour une imagerie holographique optimale.
- Utilisation d'un logiciel de reconstruction pour obtenir les coordonnées 3D.
- Analyse des images holographiques obtenues afin d'évaluer la configuration des cellules.
Résultats principaux
- Les positions 3D des cellules bactériennes ont été reconstruites avec succès.
- La technique a démontré une imagerie à haut taux de cadres sans besoin d'étiquetage.
- Les résultats ont indiqué un avantage net par rapport à la microscopie confocale en termes de vitesse d'imagerie et d'intégrité de l'échantillon.
- L'imagerie holographique s'est révélée efficace pour l'étude des processus biologiques dynamiques.
Conclusions
- La MDIH est un outil puissant pour l'étude de la dynamique des cellules bactériennes vivantes.
- La méthode permet une imagerie tridimensionnelle détaillée sans altérer l'échantillon.
- Cette technique pourrait être appliquée à divers domaines de la recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La microscopie holographique en ligne numérique (DIHM) permet l'imagerie volumétrique sans marquage d'échantillons biologiques faiblement diffusants à des fréquences d'images élevées, palliant ainsi une limitation majeure de l'imagerie de cellules vivantes où les méthodes traditionnelles nécessitent un marquage ou manquent de résolution spatiale 3D. Cette capacité soutient les flux de travail de découverte précoce en fournissant des mesures quantitatives et indépendantes de tout modèle concernant la position et la géométrie cellulaires dans des conditions natives, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique lors de la validation de cibles et des criblages phénotypiques. La compatibilité de cette technique avec le matériel d'imagerie standard et des volumes d'échantillons évolutifs en fait une plateforme réutilisable pour réduire les risques associés aux hypothèses thérapeutiques en biologie de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une mesure sans ambiguïté et indépendante de tout modèle de la position et de la forme d'objets dans des échantillons microscopiques, soutenant l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques sans recourir à des marqueurs exogènes.
- Valeur opérationnelle : Utilise des caméras CMOS/CCD standards et une illumination par LED ou laser, permettant une intégration dans les flux de travail de microscopie existants sans réactifs spécialisés.
- Valeur prédictive : Fournit des coordonnées quantitatives en 3D des structures cellulaires, facilitant la validation de cibles fonctionnelles et la réduction des risques biologiques par l'observation directe des dynamiques natives.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Capture des motifs d'interférence contenant des informations de profondeur pour la reconstruction 3D, permettant une évaluation sans marquage des réponses cellulaires dans des microenvironnements complexes.
- Valeur opérationnelle : Définit un volume d'échantillon accessible en fonction de la taille du capteur de la caméra et de la cohérence de l'illumination, permettant une standardisation entre plateformes avec des volumes allant jusqu'à 5 mm³ en utilisant une illumination laser.
- Valeur prédictive : Utilise la rétropropagation de Rayleigh-Sommerfeld et des heuristiques basées sur l'anomalie de phase de Gouy pour générer des sorties reproductibles et quantitatives évaluant la prêts-à-l'emploi et l'extensibilité des tests.
Recherche Translationnelle et Préclinique
- Valeur scientifique : Permet la continuité entre la découverte et la validation préclinique en autorisant l'observation en temps réel de processus biologiques dynamiques dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Autorise l'acquisition d'images à haut taux de rafraîchissement sans altération de l'échantillon, préservant ainsi le comportement natif pour un suivi longitudinal dans les modèles précliniques.
- Valeur prédictive : Réduit les risques d'ordre mécanistique en diminuant les ambiguïtés liées à la géométrie et à la position cellulaires, fournissant ainsi des éléments d'information pour des décisions d'avancement ajustées au risque.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La MDIH s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses en biologie fondamentale à l'identification de candidats médicaments et à la validation préclinique, notamment lorsque des imageries sans marquage, volumétriques et dynamiques sont nécessaires pour comparer des conditions expérimentales.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques en assurant une localisation 3D indépendante de tout modèle pour des objets faiblement diffusants, tels que des cellules bactériennes ou des structures intracellulaires.
- Criblage : Assure la préparation des tests grâce à des piles d'images quantitatives et remises au point, permettant la comparaison des configurations cellulaires selon différentes conditions.
- Analyse : Génère des coordonnées en X, Y et Z par extraction de caractéristiques, permettant l'analyse statistique des distributions spatiales et des motifs de déplacement.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une démarche préclinique continue en préservant l'intégrité des échantillons lors d'observations longitudinales de processus dynamiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Fonctionne comme une capacité d'imagerie réutilisable plutôt que comme une méthode à usage unique, en exploitant un logiciel de reconstruction gratuit et du matériel standard.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à une reconstruction 3D, sans étiquetage ni modèle, de la géométrie et de la position de l'objet.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité par refocalisation numérique et suppression du bruit fixe par soustraction du fond.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt en réduisant les risques biologiques tardifs grâce à une observation précoce et fidèle des dynamiques cellulaires natives.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque grâce à des données spatiales quantitatives qui éclairent la confiance dans la cible et la sélection des candidats leaders.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en acquisition d'images holographiques et en reconstruction numérique à l'aide de la rétropropagation de Rayleigh-Sommerfeld.
- Requiert un instrument capable d'assurer une illumination par onde plane et une capture d'images CMOS/CCD à des cadences et résolutions définies.
- Exige une standardisation inter-équipes de la cohérence de l'illumination, de l'incrément de déplacement et de la fréquence d'échantillonnage latérale pour une reconstruction 3D reproductible.
- Nécessite l'adaptation des paramètres de la pile de sortie (position initiale de mise au point, nombre de pas, taille des pas) afin de les ajuster à l'échelle expérimentale et au grandissement.
- Limite pratique : une reconstruction optimale exige que les objets se situent entre 10 et 30 micromètres du plan focal, ce qui impose une préparation et une mise au point de l'échantillon très précises.
