Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets

L’objectif général de l’expérience suivante est de reconstruire la position 3D en géométrie d’une chaîne de cellules bactériennes nageantes. Pour ce faire, il faut d’abord faire croître les cellules bactériennes à la bonne concentration afin de fournir un échantillon approprié pour l’imagerie. Dans un deuxième temps, la source lumineuse LED est configurée et alignée, ce qui permet d’obtenir des images holographiques.

Ensuite, le logiciel de reconstruction est utilisé afin d’obtenir les coordonnées 3D d’une chaîne de cellules bactériennes. Les résultats montrent la capacité de reconstruire la position 3D et la configuration des cellules bactériennes sur la base de l’imagerie holographique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale est que l’imagerie volumétrique sans marquage est possible à des fréquences d’images élevées.

Pour commencer à inoculer, 10 millilitres de milieu KTY avec des cristaux de glace provenant d’un stock congelé de souche de streptocoque V 4 0 5 1 1 97 incuber la culture de démarrage dans un agitateur rotatif pendant la nuit à 35 degrés Celsius et 150 tr/min. Une fois qu’il a grandi, inoculez 10 millilitres de milieu KTY frais avec 500 microlitres de la culture de démarrage saturée. Incuber pendant 3,5 heures à 35 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres de 0,8 à 1,0.

Cela représente environ cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre. Diluez ensuite les cellules à une à 400 dans un milieu frais pour obtenir la concentration finale d’environ 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, remplissez une seringue de vaseline et faites un anneau de graisse d’un millimètre de hauteur sur une lame de microscope.

Placez ensuite une goutte de la solution d’échantillon au centre. Placez délicatement un verre de protection sur l’échantillon et appuyez légèrement sur le verre pour sceller les bords, en vous assurant que le liquide est en contact avec la lame et le verre de protection. La chambre d’échantillonnage résultante doit se trouver à une profondeur de 100 à 200 micromètres.

Faites pivoter une lentille d’immersion dans l’huile 60x en place et ajoutez une goutte d’huile. Placez ensuite la chambre d’échantillonnage sur la platine du microscope avec le verre de protection vers le bas. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme entre la lamelle en verre et la lentille.

Concentrez-vous sur la surface inférieure de la chambre d’échantillonnage, puis concentrez-vous sur le condenseur. Ensuite, éteignez l’éclairage standard et placez la tête LED derrière l’ouverture du condenseur du microscope. Assurez-vous que le condenseur est réglé sur le mode champ clair et réglez l’alimentation LED sur la puissance maximale.

Fermez ensuite l’ouverture du condenseur au maximum et poussez la LED dans sa monture jusqu’à ce que l’éclairage soit centré sur l’ouverture de l’objectif de l’objectif. Allumez l’ordinateur, puis redirigez le chemin de la lumière vers le port de la caméra du microscope. Réglez la fréquence d’images à 30 images par seconde et la taille de l’image à cinq 12 x cinq 12 pixels dans le logiciel d’acquisition d’images.

Vérifiez un histogramme d’intensité d’image pour vous assurer qu’aucune partie de l’image n’est saturée ou sous-exposée. Le temps d’exposition de l’image doit être aussi court que possible tout en conservant un bon contraste. Si les cellules s’accumulent près d’une interface, recentrez le microscope de manière à ce que les cellules bactériennes soient légèrement défocalisées.

Les cellules doivent se trouver à environ 10 à 30 microns du plan focal pour une reconstruction optimale. Après avoir refait la mise au point, acquérez une série d’images vidéo et enregistrez en tant que fichier VI décompressé. Lancez ensuite le logiciel DIHM disponible en téléchargement gratuit pour convertir une image vidéo en une pile d’images numériquement recentrée.

Des exemples de cadres sont fournis avec le logiciel pour commencer la reconstruction. Entrez le cadre qui vous intéresse et son arrière-plan sous forme de fichiers image séparés dans les boîtes. L’image d’arrière-plan représente fidèlement l’arrière-plan de la vidéo en l’absence de l’hologramme et sera utilisée pour supprimer tout bruit de motif fixe qui pourrait interférer avec la localisation et l’analyse holographiques.

Ensuite, entrez les paramètres de la pile de sortie dans les zones des paramètres globaux. Tout d’abord, entrez la position axiale de la première image dans la mise au point de départ. Entrez ensuite le nombre de tranches dans la pile reconstruite en nombre d’étapes, et enfin, entrez la distance réelle entre chaque tranche de la pile en taille de pas.

Définissez la taille du pas pour qu’elle soit la même que l’espacement latéral des pixels afin de reconstruire les objets avec les proportions correctes à l’aide des données de l’exemple. Cette valeur doit être de 0,233 micromètre. Ensuite, entrez l’éclairage, la longueur d’onde, l’indice de réfraction moyen de la caméra et la fréquence d’échantillonnage latérale.

Dans la boîte pixel par micron, la fréquence d’échantillonnage latéral de la caméra peut être trouvée en divisant le grossissement de l’objectif par la taille du capteur de la caméra. En utilisant les données de l’exemple, le nombre serait de 60 x divisé par 14 micromètres, ce qui équivaut à 4,29 pixels par micron. Ensuite, si le centre de l’objet est sombre dans l’hologramme, appuyez sur le bouton de dégradé Z retourné.

Cela appliquera un filtre qui extrait les objets sous le plan focal dans l’échantillon d’origine. Activez ensuite le filtre passe-bande, qui est responsable de la suppression de la contribution des pixels bruyants à l’image. Il est appliqué à chaque tranche d’image immédiatement après sa génération.

Ensuite, vérifiez l’état d’activation de l’interrupteur de sortie intermédiaire et assurez-vous qu’il est activé. Lorsque ces commutateurs sont activés, deux vidéos sont créées. La première sortie est la pile de refocus avec un nom de fichier se terminant par pile a V.La deuxième pile est l’opération de dégradé réelle avec un nom de fichier se terminant par dégradé a VI.Idéalement, cette deuxième pile contiendra l’objet d’intérêt mis en évidence comme un objet clair sur un fond sombre.

Après avoir défini tous les paramètres, appuyez sur exécuter dans la fenêtre principale pour exécuter les commandes. Le cadre sélectionné apparaîtra dans la boîte principale du logiciel. Utilisez ensuite l’outil loupe situé dans la barre d’outils à gauche de l’image pour effectuer un zoom avant ou arrière.

Utilisez l’outil rectangle pour sélectionner une région d’intérêt ou un retour d’intérêt et capturer autant de franges d’hologrammes que possible à l’intérieur du rectangle afin d’optimiser la reconstruction. Enfin, appuyez sur le bouton de processus pour générer les deux piles d’images distinctes. Inspectez les piles résultantes à l’aide de l’image J disponible sur ce site Web.

Si l’objet d’intérêt est clairement visible dans la pile d’images dégradées, passez à la section de rendu pour extraire les coordonnées de l’objet. Pour commencer le rendu, appuyez sur le bouton d’extraction de caractéristiques pour activer la fonction de localisation des coordonnées X, Y, Z. Entrez ensuite un chemin et une extension pour le fichier de coordonnées de sortie, sélectionnez le style de rayon POV dans la zone de style de coordonnées de sortie.

Cela amène le programme à écrire un fichier objet qui peut être visualisé à l’aide du progiciel gratuit de traçage de rayons POV, qui peut être obtenu sur ce site Web, à retraiter les images pour extraire les coordonnées des objets. Le programme fournira une série de coordonnées X, Y, Z dans le retour d’intérêt sélectionné écrit dans le nom de fichier dans la boîte des cordons de sortie. L’extraction des coordonnées d’objet prend beaucoup plus de temps que la génération des piles.

Assurez-vous que l’exemple de fichier de rayon POV fourni avec le code de reconstruction est présent dans le même dossier que le fichier de coordonnées de sortie. Modifiez l’exemple de fichier point pov et remplacez le nom du fichier entre guillemets sur la ligne. Inclure mon fichier NC avec le nom du fichier de données généré par le code de reconstruction.

Personnalisez ensuite la position de la caméra, l’éclairage, la texture et les options de rendu dans POV ray. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur le bouton Exécuter pour afficher une image bitmap. Il s’agit d’une image d’une chaîne de bactéries streptocoques qui a été momentanément orientée.

Terminez sur le plan focal. Les objets dans cette configuration sont difficiles à reconstruire et produisent généralement une goutte proche du plan focal. Voici une image correctement rendue représentative de la plupart des images de cette série dans lesquelles la chaîne n’est pas orientée directement le long de l’axe optique.

La forme et la position de l’objet sont fidèlement reproduites dans le rendu comme on le voit dans le panneau de droite. Une fois cette technique maîtrisée, cela peut être fait en quelques minutes.