Trypsine protocole Digest pour analyser la vascularisation rétinienne d'un modèle de souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler le réseau vasculaire rétinien. Cela est réalisé en effectuant d'abord une série de rinçages à l'eau sur la rétine isolée. Dans la deuxième étape, la rétine est digérée par la trypsine à 37 degrés Celsius pendant environ une à une heure et demie, selon la taille de la rétine.

Ensuite, la vascularisation est isolée par des lavages à l'eau supplémentaires et par dissection au microscope. En fin de compte, des modifications vasculaires pathologiques telles que des microanévrismes, une dégénérescence capillaire et un rapport anormal entre cellules endothéliales et parasites peuvent être visualisées. Ainsi, le principal avantage de la méthode try and digest par rapport aux méthodes existantes, comme la préparation de montages plats de rétine, réside dans la possibilité de mettre en évidence tout le réseau vasculaire avec une grande clarté.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elle est techniquement exigeante et difficile à réaliser de manière reproductible. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'isolement vasculaire sont difficiles à apprendre par la seule description verbale. Cet outil très précieux dans tout laboratoire effectuant des études de biologie vasculaire rétinienne, comme dans certaines maladies telles que la rétinopathie diabétique, sera démontré par Jonathan Chow, un étudiant en médecine talentueux de mon laboratoire.

Après avoir fixé l'œil énucléé de souris dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 heures, placez l'œil dans une boîte de Pétri et recouvrez-le d'une petite quantité d'eau. Commencez la dissection en utilisant une paire de ciseaux de dissection pour effectuer soigneusement une incision initiale dans la cornée. Ensuite, tout en maintenant la zone incisée avec des pinces droites, utilisez une paire de ciseaux pour couper le long de la limite entre la cornée et la sclère afin d'ablationner la cornée.

Ensuite, utilisez des pinces fines, courbes et droites pour détacher lentement et soigneusement la sclérotique et la choroïde de la rétine en direction du nerf optique. Puis retirez le cristallin ainsi que tout excès d'iris et de débris présents sur la rétine afin de faciliter la séparation des couches rétiniennes neuronales des vaisseaux sanguins.

Ajouter environ 500 microlitres d'eau filtrée à 45 micromètres dans une plaque de 24 puits et placer la rétine dans un puits, puis agiter doucement pendant quatre à cinq heures à température ambiante, en changeant l'eau toutes les 30 à 60 minutes. Poursuivre le lavage de la rétine dans l'eau toute la nuit avec un agitation douce. Le jour suivant, à température ambiante, retirer l'eau et ajouter 3 % de trypsine, puis vérifier au microscope qu'aucun débris n'est présent dans le puits. Pour éviter que la vascularisation n'adhère à celle-ci, incuber le tissu à 37 degrés Celsius avec une agitation douce ou sans agitation pendant une à une heure et demie.

Lorsque le tissu commence à montrer des signes de désintégration, placez la plaque sur la platine du microscope, puis évitez la rétine. Retirez soigneusement la trypsine pour séparer le réseau vasculaire. Ajoutez d'abord de l'eau filtrée sur la rétine à l'aide de pinces.

Détacher la membrane limitante interne, qui apparaît comme une couche fine et transparente. Agiter doucement la plaque avec une agitation modérée. Après cinq minutes, replacer la plaque sur la platine du microscope et remplacer soigneusement l'eau, en évitant d'endommager la rétine afin d'aider à libérer le réseau vasculaire des tissus rétiniens adhérents.

Lavez la rétine comme vient de l'être démontré jusqu'à ce qu'il reste peu ou pas de débris dans l'eau après le dernier lavage. En général, l'élimination de tous les tissus non vasculaires constitue la partie la plus délicate de la procédure. Les techniques suivantes peuvent être utilisées de manière séquentielle ou individuelle afin de faciliter l'isolement du réseau vasculaire ; un conseil important consiste à tremper tous les outils ainsi que la trypsine avant de manipuler la rétine.

Cela peut aider à éviter qu'un tissu n'adhère à l'équipement. Enduisez la pointe d'une micropipette de 200 microlitres de trypsine réservée, puis pipetez délicatement de l'eau vers le haut et vers le bas, à proximité des vaisseaux rétiniens et en soufflant vers eux, provoquant ainsi une agitation douce. Si le tissu non vasculaire résiste encore au centre, utilisez une pointe de micropipette enduite de trypsine au niveau du nerf optique et pipetez soigneusement vers le haut et vers le bas tout le réseau vasculaire afin de contribuer à la dégradation du tissu non vasculaire.

Enfin, des pinces fines peuvent être utilisées pour soulever délicatement le réseau vasculaire hors de l'eau afin de détacher d'éventuels composants non vasculaires adhérents. Le résultat final doit être un réseau vasculaire rétinien intact et exempt de débris.

Pour visualiser le système vasculaire, déposez d'abord une goutte d'eau sur une lame propre. Ensuite, transférez les vaisseaux digérés dans l'eau en vérifiant au microscope. Si le montage du vaisseau est plié ou déplié, les vaisseaux pliés entraînent une mauvaise visibilité.

Lorsqu'il est coloré, si le tissu est plié, ajoutez de l'eau supplémentaire et agitez doucement la lame pour faciliter le dépliage. Utilisez ensuite une micropipette pour retirer lentement l'excès d'eau. Le produit final d'une procédure réussie est une préparation à plat du réseau complet de la vascularisation rétinienne de la souris, avec l'architecture préservée et colorée à l'hémat, à la toïne et à l'éosine.

Comme illustré ici et visible sur cette image, une nette différenciation entre les cellules endothéliales et les péricytes peut être observée dans la rétine. Les noyaux des cellules endothéliales, indiqués par la flèche blanche, sont ovales ou allongés et se situent entièrement à l'intérieur de la paroi du vaisseau. Les noyaux des parasites, indiqués par la flèche noire, sont petits, sphériques, fortement colorés et présentent généralement une position saillante le long de la paroi capillaire.

La trypsine et la digestion constituent une procédure courante utilisée pour analyser la pathologie vasculaire dans les modèles animaux de diabète. Cette image montre un exemple de dégénérescence capillaire, indiquée par la flèche blanche, telle qu'observée chez une souris DB DB, un modèle de diabète de type deux. Bien que cette procédure ait été optimisée pour les rétines de souris, des résultats similaires peuvent également être obtenus avec les rétines de rat.

Il est important de noter que les rétines de rat, telles qu'illustrées dans ces images, sont plus grandes que les rétines de souris et nécessitent des plaques à 12 puits plutôt qu'à 24 puits. Le réseau vasculaire de la rétine de rat est également moins fragile que celui de la souris. Il est extrêmement crucial d'éliminer autant que possible les tissus non vasculaires.

Toute trace résiduelle entraînera une coloration non spécifique et une mauvaise visualisation de la vascularisation. Sur cette image, par exemple, on observe un retrait infructueux de l'ensemble du tissu non vasculaire. De même, il est également important de bien déplier la rétine lors du montage afin d'améliorer la visualisation de la vascularisation.

Cette image montre un dépliage infructueux du montage plat vasculaire. Après maîtrise de cette procédure techniquement difficile, les tripsines et digestions peuvent constituer une méthode extrêmement précieuse permettant une visualisation détaillée de l'ensemble du réseau vasculaire.

En améliorant cette technique dans l'œil de la souris, les chercheurs peuvent tirer parti des souris génétiquement modifiées pour étudier diverses voies capables de contrôler la vascularisation rétinienne, ce qui nous permet de mieux comprendre la physiopathologie de diverses maladies rétiniennes. Cela nous permet d'approfondir notre compréhension des pathologies de maladies telles que la rétinopathie diabétique. En étudiant des modèles murins comme la souris DVDB, il devient ainsi possible d'identifier de nouvelles interventions thérapeutiques potentielles ciblant la vascularisation rétinienne.