Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Cette procédure implique la colonisation du nasopharynx par une pneumonie à streptocoques et l’extraction ultérieure des bactéries colonisatrices ainsi que des cellules adhérentes ou recrutées. Ceci est accompli en préparant d’abord un inoculum bactérien de la pneumonie S. Souche d’intérêt.

Après la durée souhaitée de la colonisation, les souris sont ensuite euthanasiées et des lavages nasaux sont effectués en canulant leurs trachées exposées et en évacuant le contenu par le nas. Le nombre de bactéries présentes dans les lavages nasaux peut être quantifié à l’aide de techniques microbiologiques. Alternativement, les réponses immunitaires peuvent être testées à l’aide de techniques de cytométrie en flux pour phénotyper les cellules recrutées ou de techniques de PCR quantitative.

Pour mesurer les niveaux d’ARNm exprimés d’intérêt avant de commencer, vous devrez préparer des dispositifs de contention de souris pour la partie de colonisation intranasale de la procédure et des aiguilles canulées pour les lavages nasaux. Une contention pour souris peut être préparée simplement en coupant l’extrémité effilée d’un tube de faucon de 50 millilitres. Une fois que vous avez créé l’ouverture, assurez-vous d’utiliser des ciseaux pour polir les extrémités pointues.

Pour la préparation des aiguilles canulées, vous aurez besoin du tube en polyéthylène PE 20 suivant d’un diamètre intérieur de 0,38 millimètre. Une seringue d’un mil est recouverte de 26 aiguilles biseautées de calibre 8, d’une paire d’iris pointus et fins, de ciseaux et d’une paire de pinces. Coupez le tube PE 20 avec les ciseaux fins en morceaux d’environ 2,5 centimètres ou un pouce de longueur, en vous assurant que chaque extrémité a une pointe biseautée.

À l’aide de la pince, glissez délicatement l’un de ces morceaux sur la pointe de votre aiguille. En évitant de percer le côté du tube, les aiguilles canulées peuvent être conservées dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce que nécessaire et rincées avec du PBS directement avant utilisation. Pour la colonisation intranasale des souris avec S pmo, nous recommandons d’utiliser une concentration de 10 à neuf unités formant colonie par mil délivrées dans 10 microlitres.

Pour une dose finale de 10 à sept UFC, conservez l’inoculum sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser et assurez-vous de l’agiter entre chaque colonisation. En plus de l’inoculum, vous aurez également besoin d’une pipette P 10 ou P 20 embouts de pipette stérilisés et de votre dispositif de contention pour souris. Isolez une souris par sa queue et retenez-la en la plaçant dans votre appareil de contention de souris préalablement préparé.

Si vous avez du mal à diriger la souris dans la retenue, il peut être utile de la positionner devant et au-dessus de la souris, permettant à l’animal de ramper vers le haut. Une fois que la souris est à l’intérieur de la contention, fixez-la par la base de son corps en la poussant doucement vers le haut afin que son nez sorte de l’extrémité effilée de la contention. À l’aide d’une pipette P 10 ou P 20, inoculez chaque souris en déposant 10 microlitres de la culture préparée, en la répartissant uniformément entre les deux. Nares.

Laissez l’inoculum s’égoutter dans le nez en pulsant l’inoculation progressivement en prenant le temps nécessaire à la souris pour inhaler l’inoculum. La souris peut éternuer une partie de l’inoculum par son nez, ce qui est attendu. Notez que les souris doivent être anesthésiées pour cette procédure afin de s’assurer que la bactérie reste localisée au nasopharynx et ne se propage pas aux voies respiratoires inférieures.

Pour les besoins de cette démonstration, nous inoculons du PBS, mais chaque fois que nous travaillons avec des bactéries vivantes, assurez-vous de mener la procédure conformément aux directives approuvées par l’institut. Par exemple, la plupart des institutions exigeront que la colonisation soit menée dans une hotte de niveau de biosécurité deux. Si vous utilisez des indicateurs de poids dans le cadre de votre méthode de surveillance des points finaux, surveillez les souris toutes les 12 à 24 heures pour détecter les symptômes cliniques, notamment la léthargie, la fourrure ébouriffée et la perte de poids.

Une fois les souris colonisées, gardez-les pendant la durée souhaitée. À la fin de cette période, les souris seront euthanasiées et un lavage nasal est effectué car la luxation cervicale peut potentiellement endommager la trachée. Cette méthode d’euthanasie doit être évitée.

Avant d’effectuer des lavages nasaux, assurez-vous d’avoir les éléments suivants à portée de main. Des aiguilles canulées préalablement préparées, de l’éthanol aqueux à 70 %, une paire de pinces, une paire de ciseaux à iris fins et tranchants, du phosphate, du sérum physiologique tamponné, un tampon de lyse de l’ARN et des tubes d’un millier d’einor. Une fois que vous êtes prêt à commencer, allongez l’animal à plat sur le dos et, à l’aide d’éthanol aqueux à 70 %, stérilisez l’avant de sa fourrure, en particulier la zone du cou.

Prendre soin d’empêcher l’éthanol d’accéder aux narines. Faites une seule coupe longitudinale le long de la ligne médiane du cou de l’animal, en vous permettant de créer une ouverture pour visualiser la trachée. Pelez soigneusement la peau de chaque côté, révélant le tissu du cou en dessous.

À ce stade, la trachée doit être visible entourée de muscles longitudinaux de chaque côté. Coupez-les soigneusement pour fournir une vue claire de la trachée elle-même, en prenant soin de ne pas sectionner le système vasculaire environnant. Dans le cas où vous coupez accidentellement le système vasculaire et que du sang est présent dans la région avant de continuer.

Laissez le saignement s’arrêter, puis nettoyez la zone plusieurs fois en distribuant du PBS stérile et en utilisant de la gaze stérile pour absorber doucement l’excès d’humidité. Une fois que la trachée est correctement exposée, faites une coupe semi-lunaire transversale dans la trachée à mi-hauteur. Déposez le PBS stérile dans une seringue canulée.

Insérez la canule dans la trachée vers le nez, en gardant le bord biseauté pointé vers le bas pour faciliter l’insertion. Une fois la canule en place, tournez à 180 degrés et sondez doucement vers le haut jusqu’à ce que vous sentiez une légère résistance. Placez le tube EEND DPH désigné pour le prélèvement d’échantillons juste sous le nez de la souris.

Testez le placement correct de la canule en distribuant une quantité minimale de liquide de lavage PBS. Suite à cela, une goutte de liquide devrait se former autour du NAS de la souris si la canule est correctement placée. Si le PBS de test émerge directement de la bouche de l’animal, tirez la canule vers l’arrière et repositionnez-la à nouveau en sondant doucement vers l’avant jusqu’à ce qu’une très légère résistance se fasse sentir.

Veillez à ne pas pousser la canule trop loin au-delà de cette résistance, car vous la déplacerez au-delà du palais nasal et à travers la cavité buccale. Une fois que vous avez confirmé que la canule est correctement positionnée, procédez à la distribution rapide de 200 microlitres de PBS pour aider à déplacer et à collecter le maximum de cellules. Le contenu doit s’écouler à travers les narines de la souris et dans le tube de collecte.

Placez immédiatement l’échantillon sur de la glace. Ces échantillons peuvent ensuite être analysés pour la charge bactérienne ainsi que pour le recrutement cellulaire. Pour prélever des échantillons pour l’analyse de l’ARN, utilisez une aiguille canulée séparée contenant 500 microlitres de tampon de lyse de l’ARN pour effectuer un lavage nasal secondaire.

Notez que le tampon de lyse de l’ARN va dénuder l’épithélium et détruire les tissus environnants. Il faut donc veiller à éviter tout contact avec des organes tels que les poumons. Si la rétention de ces tissus est souhaitée pour quantifier la charge bactérienne nasopharyngée, vous aurez besoin des éléments suivants.

Les tubes Epicor, les plaques microbiologiques contenant des œufs de soja triptyques sont complétés avec 5 % de sang de mouton. Un mélangeur vortex, des pointes de pipette stériles PBS et des pipettes P 20 et P 200. En travaillant d’abord dans une double capuchonne BSL, préparez une série de dilutions en série pour chaque échantillon de lavage nasal au mirin.

En général, on peut s’attendre à ce que les concentrations de S pneumoniae dans le nasopharynx se situent entre zéro et 10 pour quatre UFC. Par conséquent, effectuez trois dilutions en série de dix fois, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon de lavage nasal pur dans le premier tube à une concentration de 10 puissance moins un UFC par mil, et continuez vers le bas jusqu’à ce que vous ayez dilué trois échantillons excessivement tourbillonnaire entre chaque dilution. Veuillez noter que cette vidéo n’est fournie qu’à titre de démonstration.

La technique de laboratoire appropriée, y compris le changement des pointes de pipette entre les dilu, doit toujours être respectée À l’aide d’un sharpie, divisez-le en quadrants dans votre plaque logique et étiquetez les quadrants avec la dilution correspondante à plaquer dessus. Disposez trois gouttes d’échantillons de 10 microlitres de chacune de vos dilutions sur la plaque de gélose. Laissez-les sécher pendant 15 à 30 minutes à découvert, puis couvrez les assiettes et placez-les à l’envers dans un incubateur bactérien avec des conditions optimales pour la croissance du pneumocoque, généralement 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Incuber ces plaques pendant 24 à 48 heures. Après cette période, retirez les plaques et déterminez le nombre de bactéries colonisatrices en faisant la moyenne des colonies formées sur la plaque. Pour chaque dilution, les colonies d’animo peuvent être identifiées par leur couleur beige distinctive, leurs zones d’hémolyse alpha, qui sont de petits halos autour de chaque colonie, créés par la digestion bactérienne du supplément sanguin dans l’agar.

Et enfin, par de petites dépressions au centre de chaque colonie qui lui donnent l’apparence d’un érythrocyte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une solide compréhension de la façon d’établir une es-pmo nasopharyngée, la colonisation chez une souris, comment isoler les bactéries et les cellules du nasopharynx d’une souris après la colonisation, à l’aide d’un lavage nasal et comment quantifier la charge bactérienne correspondante à l’aide de techniques microbiologiques. Nous espérons que les méthodes décrites dans cette vidéo vous encourageront à utiliser un modèle intranasal de colonisation pour étudier les réponses de l’hôte aux agents pathogènes dans le contexte de cette région peu étudiée.