Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

L'objectif général de cette procédure est de déterminer les concentrations tolérables d'acides gras et de toxine cholérique qui n'ont pas d'effet négatif sur la survie cellulaire. Cela est réalisé en cultivant tout d'abord le type approprié de cellules. La deuxième étape consiste à incuber les cellules avec des concentrations variables des trois acides gras à tester ou avec la toxine cholérique.

Après 24 heures, la survie cellulaire est évaluée à l’aide d’un test MTT. En définitive, les données de spectrométrie issues du test MTT révèlent les concentrations optimales d’acides gras et de toxine cholérique permettant de traiter les cellules sans réduction significative de leur survie. Les implications de cette technique s’étendent à la prévention des infections au choléra, car les vaccins ne sont pas toujours efficaces.

Des macrophages de souris Mus musculus provenant de souris Bowel C seront utilisés pour toutes les déterminations de co-toxine et pour la détermination à plus grande échelle de la concentration d'acides gras. Les cellules sont cultivées dans l'un des deux milieux suivants : DMEM avec L-glutamine complété avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % d'antibiotique-antimycotique, ou milieu de base RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal, 5 % de L-glutamine et 1 % d'antibiotique-antimycotique. Pour ce protocole, cultiver les cellules Bowel C dans des flacons Corning de 75 centimètres carrés munis de bouchons ventilés, à 37 °C, sous atmosphère de 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone. Pour la détermination de la concentration en acides gras à petite échelle, utiliser des cellules épithéliales intestinales humaines cultivées dans des flacons Corning de 75 centimètres carrés munis de bouchons ventilés, en milieu Hypercare complété avec 10 % de FPS et 30 nanogrammes par millilitre.

L'EGF humain n'utilise pas de réactifs antibiotiques ou antimycosiques, conformément aux instructions du fabricant. Incuber à 37 degrés Celsius, avec 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone. Passager les cellules à un ratio de une à trois lorsque la confluence atteint environ 70 %, selon le type de cellules. En général, les cellules sont passagées tous les deux à cinq jours avant le traitement aux acides gras. Préparer d'abord les acides gras : transférer l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide linoléique à partir des ampoules en verre fournies par la société vers des flacons en verre stérilisés. Ensuite, transférer chaque acide gras dans un tube Eppendorf stérilisé séparé.

Dissoudre chaque acide gras dans de l'éthanol à 100 % à une dilution de un pour six, puis ajouter du RPMI 1640. Compléter le milieu incomplet jusqu'à une concentration finale de 10 microgrammes par microlitre. Vortexer chaque solution et les transférer dans des flacons en verre pour stockage dans la plaque congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Des cellules épithéliales intestinales humaines, au nombre de 2 500 cellules par puits, sont placées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits, puis on ajoute le milieu complet approprié afin d'obtenir un volume total de 200 microlitres par puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, sous 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone, pendant 24 heures.

Après la période de prolifération de 24 heures, retirez le milieu. Ajoutez aux puits les concentrations appropriées de chaque acide gras à tester en tant que contrôle positif. Incubez les cellules avec le milieu complet en tant que contrôle négatif, et incubez les cellules avec de l'éthanol à 70 %.

Ensuite, ajoutez le milieu complet afin d'amener le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Incubez les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test au MTT, afin de préparer la toxine du choléra pour les traitements cellulaires. Dissolvez la toxine du choléra dans du PBS à une concentration de un milligramme par millilitre.

Prélevez des aliquotes de la solution dans des cryotubes et conservez-les à une température de deux à huit degrés Celsius avant les traitements cellulaires. Diluez la toxine au centième dans du PBS stérilisé ou du DMEM incomplet pour obtenir une concentration de travail finale de un nanogramme par microlitre par puits. Mettez en culture les macrophages à raison de 2 500 cellules par puits dans des plaques de 96.

Les plaques de culture tissulaire sont incubées à 37 degrés Celsius, avec 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone, pendant 24 heures. Après la période de prolifération de 24 heures, retirez le milieu et ajoutez aux puits les concentrations de test appropriées de choléra toine. De manière analogue aux traitements par acides gras, incubez les cellules avec le milieu complet comme témoin positif et avec 70 % d'éthanol comme témoin négatif pour tous les échantillons et traitements.

Utilisez un minimum de trois réplicats, avec davantage de réplicats pour les témoins positifs. Ajoutez du milieu complet afin d'amener le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Incubez les plaques traitées avec la toxine cholérique pendant 24 heures avant de commencer le test au MTT.

24 heures après que les cellules ont été traitées avec des acides gras ou une coloration, la viabilité cellulaire est déterminée par le test au MTT. Retirer la solution de chaque puits de la plaque 96 puits à tester et la remplacer par 200 microlitres d'une solution fraîche de milieu complet.

Ajouter 10 µL d'une solution de MTT fraîchement préparée à 2,5 mg/mL à chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant trois à quatre heures. Après trois à quatre heures, éliminer la solution du milieu et ajouter 100 µL d'acide chlorhydrique 0,04 M dans l'isopropanol à chaque puits.

Incubez correctement la plaque à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, transférez la solution de chaque puits dans un tube de centrifugation et centrifugez à 20 000 ×g pendant une minute ou jusqu'à formation d'un culot. Transférez entre 20 et 40 microlitres de chaque échantillon dans un lecteur de microplaques et mesurez l'absorbance à 570 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre.

Cette figure montre la survie de la majorité des macrophages, représentée en fonction du témoin positif pour des traitements utilisant des concentrations croissantes d'acide oléique, d'acide linoléique et d'acides linoléiques. Il apparaît clairement que les cellules ne tolèrent aucune concentration supérieure à 100 nanogrammes par microlitre pour chacun des acides gras. L'expérience a été répétée sur des cellules épithéliales humaines, en faisant varier les concentrations inférieures à 100 nanogrammes par microlitre par incréments de 10 nanogrammes par microlitre, jusqu'à 70 nanogrammes par microlitre.

Ce graphique montre la survie cellulaire pour chaque concentration d'acide oléique. Une analyse par Inova a indiqué que l'une ou plusieurs des moyennes étaient statistiquement différentes. Toutefois, ce sont uniquement les traitements aux concentrations plus élevées qui ont produit des moyennes statistiquement différentes de celle du témoin positif.

Curieusement, les différences observées étaient dues à une augmentation de la viabilité cellulaire accompagnée d'une variabilité plus importante. Des résultats similaires ont été obtenus pour les acides linoléique et linoléique. Une voie.

Inova a indiqué que aucune des moyennes de traitement n'était statistiquement différente de la moyenne du témoin positif, mais la variabilité semble augmenter pour certaines des concentrations les plus élevées, telles que 60 nanogrammes par microlitre d'acide linoléique ou d'acide linoléique à partir de ces résultats. Les concentrations optimales en acides gras lors de l'utilisation de cellules épithéliales intestinales humaines semblent se situer entre un et cinq nanogrammes par microlitre. Les effets de concentrations variables de toxine collar sur la survie de la majorité des macrophages ont également été testés à l'aide de traitements appliqués à des niveaux de toxine augmentés de manière relativement importante.

Une tendance à la diminution de la viabilité cellulaire a été observée, comme prévu, la viabilité cellulaire variant considérablement selon chaque traitement. La grande variabilité de la viabilité a entraîné l'absence de différence significative entre la moyenne du témoin positif et celle de chacun des traitements, ce qui a conduit à effectuer des tests supplémentaires avec des concentrations de toxine inférieures ou égales à 100 nanogrammes. Ce graphique montre la viabilité cellulaire pour les traitements à faible concentration de toxine.

La viabilité cellulaire est très variable pour presque toutes les concentrations de toxine, bien que de légères augmentations aient été observées en ce qui concerne la viabilité suite aux traitements. Ces augmentations ne sont pas statistiquement significatives pour aucun des traitements par rapport à la moyenne du témoin positif. Sur la base de ces résultats.

La concentration recommandée de la toxine colorée est inférieure à 30 nanogrammes par traitement lorsqu'on utilise des macrophages de souris bowel C après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la couleur pour explorer si les acides gras peuvent renforcer l'immunité contre l'infection par Vibrio cholerae.