Name: Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez comment déterminer les concentrations tolérables d'acides gras et de toxine du choléra sur des cellules épithéliales intestinales humaines et des macrophages de souris BALB/c. Cette méthode aide à évaluer la viabilité cellulaire.

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Nous remercions Paula Cobos et le Dr Evros Vassiliou à l&#39;aide de laboratoire et de fournir les macrophages de souris, respectivement. Nous remercions également notre laboratoire directeur Richard Criasia de conseils et d&#39;aide avec les matériaux. Enfin, les auteurs remercient Ramanpreet Kaur de l&#39;aide à la production vidéo.

1. Tissue Culture <ol><li> Utilisez Mus musculus macrophages (BALB / c) pour les déterminations de la toxine du choléra. Initialement culture tout de M. cellules musculus en suivant les instructions du fournisseur. </li><li> Propager BALB / c cellules de souris dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% 1640 de base antibiotique / antifongique ou RPMI complété avec 10% de sérum de veau foetal, 5% de L-glutamine et 1 % réactif antibiotique / antifongique. </li><li> Cultiver les cellules dans 75 cm 2 Corning flacons avec des bouchons ventilés à 37 ° C, 95% d&#39;air et 5% de CO 2. </li><li> Amener les cellules épithéliales intestinales humaines dans les 24 heures de la livraison que les instructions du fabricant pour la détermination des déterminations d&#39;acides gras. </li><li> Propager les cellules épithéliales intestinales humaines en 75 cm 2 Corning flacons avec des bouchons ventilés dans les médias HybriCare complété avec 10% de FBS et 30 ng / ml d&#39;EGF humain à 37 ° C. Ne pas utiliser des antibiotiquesRéactifs / antimycosiques selon les instructions du fabricant. </li><li> Fractionner les cellules (1:3) à la confluence d&#39;environ 70%. </li><li> Congeler et mettre en place toutes les cellules tout au long de l&#39;étude en utilisant des protocoles de congélation standard. </li><li> Note: Pour la détermination de la concentration plus grande échelle des acides gras, utilisez la croissance plus rapide, plus facile à entretenir, les macrophages de souris initialement. Pour la détermination de la concentration d&#39;acides gras à fine échelle, utiliser des cellules épithéliales humaines. Utilisez des macrophages de souris pour tous les traitements de la toxine cholérique (voir discussion). </li></ol> 2. Acides gras et des traitements de la toxine cholérique <ol><li> Transfert acides oléique, linoléique et linolénique de la compagnie fournis par des ampoules de verre dans des flacons en verre stérilisés. </li><li> Transférer chaque acide gras dans un tube Eppendorf stérile séparée et dissoudre d&#39;abord dans l&#39;éthanol à 100% à une dilution de 1:6, puis en milieu RPMI 1640 incomplètes pour une concentration finale de 10 pg / pl. </li><li> Vortex chaque solution et transfer à des flacons en verre pour le stockage dans le congélateur (-20 ° C). </li><li> Cellules de la plaque au niveau des cellules 2500 / puits dans 96 des plaques de culture de tissus ainsi. </li><li> Ajouter le média complètes appropriées pour porter le volume total du puits de 200 pi pour le traitement des cellules avec des acides gras dans la préparation pour les tests MTT. </li><li> Après une période de prolifération 24 heures, retirez le support et remplacez-le par du milieu frais. </li><li> Ajouter les concentrations appropriées de chaque acide gras à tester dans les puits (voir les résultats). Ajouter des milieux complets pour amener les volumes nombre total de puits de 200 pi. </li><li> Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT. </li><li> Dissoudre la toxine du choléra dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml et aliquote de la solution dans cryovials et stocker les flacons cryogéniques à 2-8 ° C. </li><li> Pour les traitements de cellules, diluer la toxine 1:100 dans du PBS stérile (pH 7,4) ou incomplet du DMEM pour une concentration de travail finale de 1 ng / ul. </li><li> Pour traiter les cellules avec la toxine du choléra danspréparation pour les tests MTT, les cellules de la plaque comme décrit ci-dessus. </li><li> Après une période de prolifération 24 h, ajouter les concentrations appropriées de la toxine cholérique (pour nos concentrations, voir les résultats) à tester dans les puits en suivant les procédures utilisés dans les applications d&#39;acides gras (ci-dessus). </li><li> Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT. </li><li> En (c positif tout le papier) positive et négative de contrôle (négatif c), à la fois d&#39;acides gras et les traitements de la toxine du choléra, les cellules incuber avec du milieu complet et l&#39;éthanol à 70%, respectivement. </li><li> Pour tous les échantillons et les traitements utilisent un minimum de trois répétitions (n ​​= 3), avec plus de répétitions pour les contrôles positifs (n = 6 dans cette étude). </li></ol> 3. MTT <ol><li> Faire une solution de MTT à une concentration de 2,5 mg / ml. </li><li> Retirez la solution dans chaque puits de la plaque de 96 puits à tester et remplacez-le par 200 pi de solution média complète fraîche. </li><li> Annonced 10 pl de la solution MTT à chaque puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3-4 heures. </li><li> Jeter la solution des médias et ajouter 100 ul de 0,04 M HCl dans l&#39;isopropanol à chaque puits. </li><li> Incuber la plaque à la température ambiante pendant cinq minutes. </li><li> Transvaser la solution à partir de chaque puits pour un nouveau tube de centrifugation. </li><li> Centrifuger à 20000 x g, à température ambiante, pendant 1 min, ou jusqu&#39;à ce qu&#39;un culot a été formé. </li><li> Transfert entre 20-40 pi de chaque échantillon à un lecteur de microplaques. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 570 nm à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs de cette étude n&#39;ont aucun intérêt financier à partir des résultats de cette étude. Le financement de cette étude a été fourni à FT par l&#39;Université de Kean, mais FT est actuellement employé à Kingsborough Community College.

Suggestion de concentration des acides gras et la toxine du choléra Bien que le mécanisme exact de la façon dont les acides gras améliorent l&#39;immunité muqueuse est inconnue, plusieurs études ont tenté d&#39;étudier leurs effets bénéfiques. Notre étude vise à fournir une méthodologie pour déterminer la concentration maximale d&#39;acides gras que les cellules peuvent tolérer ainsi que la concentration maximale de la toxine cholérique que les cellules peuvent tolérer sans une influence signif...

Les avantages pour la santé des acides gras comme l&#39;acide oléique, linoléique et linolénique ont été et continuent d&#39;être documentés. Par exemple, l&#39;acide oléique permet de faciliter la pénétration des médicaments lipophiles dans l&#39;1,2 corporel, réduit de maladie coronarienne de 24% lorsqu&#39;ils sont substitués pour les acides gras saturés 3, et est utilisé pour traiter les maladies métaboliques telles que l&#39;adrénoleucodystrophie 4 qui est un lié à l&#39;X trouble génétique du métabolisme des acides gras. . Même si un précurseur nécessaire pour l&#39;acide arachidonique chez les mammifères, l&#39;acide linoléique (contrairement à l&#39;acide oléique) n&#39;est pas synthétisée par l&#39;organisme et doit être obtenue par des sources extérieures telles que la consommation de graines de lin 5 études montrent plusieurs effets bénéfiques sur la santé de l&#39;acide linoléique telles que: propriétés anti-âge pour la peau; 6 propriétés anti-inflammatoires; 7 prolifération réduite des cellules carcinome colorectal et de la prostate; 8 et la capacité de lutter contre l&#39;obésité et la promotion o9 acide linolénique f de la santé cardiovasculaire. joue un rôle dans la réduction de l&#39;inflammation du parodonte, thromboxane 10 et la modulation et la biosynthèse de la prostacycline. 11 Arpita 12 a étudié l&#39;influence des acides gras biliaires et du cholestérol sur V. expression des facteurs de virulence et la motilité de l &#39;cholerae. Yamasaki 13 a indiqué que l&#39;extrait de méthanol à partir de piments rouges et d&#39;autres composés naturellement extraites, peut potentiellement diminuer la production de la toxine du choléra. Il est concevable d&#39;envisager l&#39;utilisation de produits alimentaires qui sont riches en acides gras ci-dessus (comme les graines de lin) dans la prévention et la lutte contre des maladies infectieuses telles que le choléra en offrant une immunité mucosale. Nous avons mené des enquêtes pour solubiliser les acides gras et de déterminer, en utilisant des tests de prolifération cellulaire, la concentration maximale d&#39;acides gras que les cellules épithéliales intestinales humaines peuvent tolérer sans effets néfastes sur la CEll viabilité. Nous avons supposé que les acides oléique, linoléique et linolénique ont un effet bénéfique sur la viabilité cellulaire à des concentrations plus faibles, mais que des concentrations plus élevées ils vont être toxiques pour les cellules. Nous avons également SOLUBILISE la toxine cholérique et déterminé la concentration maximale de la toxine cholérique qui BALB / C macrophages de souris peuvent tolérer sans une diminution significative de la viabilité cellulaire. Nous émettons l&#39;hypothèse d&#39;un effet toxique de la toxine cholérique sur la viabilité des cellules, même à très faible niveau. La méthode de solubiliser une toxine cholérique et l&#39;utiliser pour déterminer le montant maximum de la toxine que les cellules peuvent tolérer sans une diminution significative de la survie constitue un avantage pour les études futures. Par exemple, une combinaison des méthodes ci-dessus peut être utilisé pour déterminer si les acides gras fournissent des cellules de l&#39;immunité des muqueuses contre les infections de choléra. Au meilleur de notre connaissance, cette méthodologie rationnelle et n&#39;a pas été explorée. Nous discuss comment nos données préliminaires peuvent être utilisés dans de futures investigations afin de déterminer si les acides oléique, linoléique et linolénique fournir des cellules de l&#39;immunité muqueuse contre l&#39;infection par le choléra.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells/Reagent</td></tr><tr><td>Mus musculus macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC RAW 264.7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin </td><td>Bio-west</td><td>S0250</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique/ antimycosique </td><td>Hyclone</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Cellules épithéliales intestinales humaines </td><td>ATCC</td><td>ATTC CCL-241</td><td></td></tr><tr><td>Milieux HybriCare </td><td>ATCC</td><td>46-X</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Acide linoléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1376</td><td></td></tr><tr><td>Acide linolénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2376</td><td></td></tr><tr><td>Toxine cholérique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates</td><td>BD Biosciences</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre avec logiciel Dynex Revelations 4.22</td><td>Dynex</td><td>91000101</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et balb / c macrophages de souris

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Le rôle positif des acides gras dans la prévention et la lutte contre les maladies non humains et humains ont été et continuent d&#39;être largement documentés. Ces rôles incluent influences sur les maladies infectieuses et non infectieuses, y compris la prévention de l&#39;inflammation, ainsi que l&#39;immunité des muqueuses aux maladies infectieuses. Le choléra est une maladie intestinale aiguë causée par la bactérie Vibrio cholerae. Il se produit dans les pays en développement et si elle n&#39;est pas traitée, peut entraîner la mort. Bien qu&#39;il existe des vaccins contre le choléra, ils ne sont pas toujours efficaces et d&#39;autres méthodes de prévention sont nécessaires. Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra en utilisant respectivement souris BALB / C macrophages et les cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE les acides gras ci-dessus et des essais de prolifération des cellules utilisées pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques des acides gras qui ne sontt préjudiciables à la viabilité des cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE toxine cholérique et utilisé dans un essai pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques de la toxine cholérique qui ne sont pas statistiquement diminue la viabilité des cellules dans des souris BALB / C macrophages. Nous avons trouvé les concentrations d&#39;acides gras optimale à entre 1-5 ng / ul, et que pour la toxine cholérique être &lt;30 ng par traitement. Ces données peuvent aider les futures études visant à trouver un rôle muqueuse protectrice pour les acides gras dans la prévention ou l&#39;atténuation des infections de choléra.

Détermination de la concentration optimale en acides gras La concentration optimale d&#39;acides gras est définie comme étant la concentration maximale à laquelle la croissance des cellules est comparable ou supérieure à celle des cellules de contrôle, avec relativement faible variabilité des résultats. Pour déterminer la concentration optimale d&#39;acide oléique, les cellules des acides linoléique et linolénique ont d&#39;abord été traités avec des concentrations variables de chaque acide gra...

Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra qui n&#39;a pas incidence défavorable importante sur la survie des cellules de solubiliser les acides gras et les toxines et leur utilisation dans des essais de survie cellulaire.

Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer les concentrations tolérables d'acides gras et de toxine cholérique qui n'ont pas d'effet négatif sur la survie cellulaire. Cela est réalisé en cultivant tout d'abord le type approprié de cellules. La deuxième étape consiste à incuber les cellules avec des concentrations variables des trois acides gras à tester ou avec la toxine cholérique.Après 24 heures, la survie cellulaire est évaluée à l’aide d’un test MTT. En définitive, les données de spectrométrie issues du test MTT révèlent les concentrations optimales d’acides gras et de toxine cholérique permettant de traiter les cellules sans réduction significative de leur survie. Les implications de cette technique s’étendent à la prévention des infections au choléra, car les vaccins ne sont pas toujours efficaces.Des macrophages de souris Mus musculus provenant de souris Bowel C seront utilisés pour toutes les déterminations de co-toxine et pour la détermination à plus grande échelle de la concentration d'acides gras. Les cellules sont cultivées dans l'un des deux milieux suivants : DMEM avec L-glutamine complété avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % d'antibiotique-antimycotique, ou milieu de base RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal, 5 % de L-glutamine et 1 % d'antibiotique-antimycotique. Pour ce protocole, cultiver les cellules Bowel C dans des flacons Corning de 75 centimètres carrés munis de bouchons ventilés, à 37 °C, sous atmosphère de 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone. Pour la détermination de la concentration en acides gras à petite échelle, utiliser des cellules épithéliales intestinales humaines cultivées dans des flacons Corning de 75 centimètres carrés munis de bouchons ventilés, en milieu Hypercare complété avec 10 % de FPS et 30 nanogrammes par millilitre.L'EGF humain n'utilise pas de réactifs antibiotiques ou antimycosiques, conformément aux instructions du fabricant. Incuber à 37 degrés Celsius, avec 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone. Passager les cellules à un ratio de une à trois lorsque la confluence atteint environ 70 %, selon le type de cellules. En général, les cellules sont passagées tous les deux à cinq jours avant le traitement aux acides gras. Préparer d'abord les acides gras : transférer l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide linoléique à partir des ampoules en verre fournies par la société vers des flacons en verre stérilisés. Ensuite, transférer chaque acide gras dans un tube Eppendorf stérilisé séparé.Dissoudre chaque acide gras dans de l'éthanol à 100 % à une dilution de un pour six, puis ajouter du RPMI 1640. Compléter le milieu incomplet jusqu'à une concentration finale de 10 microgrammes par microlitre. Vortexer chaque solution et les transférer dans des flacons en verre pour stockage dans la plaque congélateur à moins 20 degrés Celsius.Des cellules épithéliales intestinales humaines, au nombre de 2 500 cellules par puits, sont placées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits, puis on ajoute le milieu complet approprié afin d'obtenir un volume total de 200 microlitres par puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, sous 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone, pendant 24 heures.Après la période de prolifération de 24 heures, retirez le milieu. Ajoutez aux puits les concentrations appropriées de chaque acide gras à tester en tant que contrôle positif. Incubez les cellules avec le milieu complet en tant que contrôle négatif, et incubez les cellules avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, ajoutez le milieu complet afin d'amener le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Incubez les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test au MTT, afin de préparer la toxine du choléra pour les traitements cellulaires. Dissolvez la toxine du choléra dans du PBS à une concentration de un milligramme par millilitre.Prélevez des aliquotes de la solution dans des cryotubes et conservez-les à une température de deux à huit degrés Celsius avant les traitements cellulaires. Diluez la toxine au centième dans du PBS stérilisé ou du DMEM incomplet pour obtenir une concentration de travail finale de un nanogramme par microlitre par puits. Mettez en culture les macrophages à raison de 2 500 cellules par puits dans des plaques de 96. Les plaques de culture tissulaire sont incubées à 37 degrés Celsius, avec 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone, pendant 24 heures. Après la période de prolifération de 24 heures, retirez le milieu et ajoutez aux puits les concentrations de test appropriées de choléra toine. De manière analogue aux traitements par acides gras, incubez les cellules avec le milieu complet comme témoin positif et avec 70 % d'éthanol comme témoin négatif pour tous les échantillons et traitements.Utilisez un minimum de trois réplicats, avec davantage de réplicats pour les témoins positifs. Ajoutez du milieu complet afin d'amener le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Incubez les plaques traitées avec la toxine cholérique pendant 24 heures avant de commencer le test au MTT.24 heures après que les cellules ont été traitées avec des acides gras ou une coloration, la viabilité cellulaire est déterminée par le test au MTT. Retirer la solution de chaque puits de la plaque 96 puits à tester et la remplacer par 200 microlitres d'une solution fraîche de milieu complet.Ajouter 10 µL d'une solution de MTT fraîchement préparée à 2,5 mg/mL à chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant trois à quatre heures. Après trois à quatre heures, éliminer la solution du milieu et ajouter 100 µL d'acide chlorhydrique 0,04 M dans l'isopropanol à chaque puits.Incubez correctement la plaque à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, transférez la solution de chaque puits dans un tube de centrifugation et centrifugez à 20 000 ×g pendant une minute ou jusqu'à formation d'un culot. Transférez entre 20 et 40 microlitres de chaque échantillon dans un lecteur de microplaques et mesurez l'absorbance à 570 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre.Cette figure montre la survie de la majorité des macrophages, représentée en fonction du témoin positif pour des traitements utilisant des concentrations croissantes d'acide oléique, d'acide linoléique et d'acides linoléiques. Il apparaît clairement que les cellules ne tolèrent aucune concentration supérieure à 100 nanogrammes par microlitre pour chacun des acides gras. L'expérience a été répétée sur des cellules épithéliales humaines, en faisant varier les concentrations inférieures à 100 nanogrammes par microlitre par incréments de 10 nanogrammes par microlitre, jusqu'à 70 nanogrammes par microlitre.Ce graphique montre la survie cellulaire pour chaque concentration d'acide oléique. Une analyse par Inova a indiqué que l'une ou plusieurs des moyennes étaient statistiquement différentes. Toutefois, ce sont uniquement les traitements aux concentrations plus élevées qui ont produit des moyennes statistiquement différentes de celle du témoin positif.Curieusement, les différences observées étaient dues à une augmentation de la viabilité cellulaire accompagnée d'une variabilité plus importante. Des résultats similaires ont été obtenus pour les acides linoléique et linoléique. Une voie. Inova a indiqué que aucune des moyennes de traitement n'était statistiquement différente de la moyenne du témoin positif, mais la variabilité semble augmenter pour certaines des concentrations les plus élevées, telles que 60 nanogrammes par microlitre d'acide linoléique ou d'acide linoléique à partir de ces résultats. Les concentrations optimales en acides gras lors de l'utilisation de cellules épithéliales intestinales humaines semblent se situer entre un et cinq nanogrammes par microlitre. Les effets de concentrations variables de toxine collar sur la survie de la majorité des macrophages ont également été testés à l'aide de traitements appliqués à des niveaux de toxine augmentés de manière relativement importante.Une tendance à la diminution de la viabilité cellulaire a été observée, comme prévu, la viabilité cellulaire variant considérablement selon chaque traitement. La grande variabilité de la viabilité a entraîné l'absence de différence significative entre la moyenne du témoin positif et celle de chacun des traitements, ce qui a conduit à effectuer des tests supplémentaires avec des concentrations de toxine inférieures ou égales à 100 nanogrammes. Ce graphique montre la viabilité cellulaire pour les traitements à faible concentration de toxine.La viabilité cellulaire est très variable pour presque toutes les concentrations de toxine, bien que de légères augmentations aient été observées en ce qui concerne la viabilité suite aux traitements. Ces augmentations ne sont pas statistiquement significatives pour aucun des traitements par rapport à la moyenne du témoin positif. Sur la base de ces résultats.La concentration recommandée de la toxine colorée est inférieure à 30 nanogrammes par traitement lorsqu'on utilise des macrophages de souris bowel C après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la couleur pour explorer si les acides gras peuvent renforcer l'immunité contre l'infection par Vibrio cholerae.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide des cellules dendritiques de souris intestinales (DCS) et les macrophages. Caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée en utilisant plusieurs couleurs d'écoulement analyse cytométrique tandis magnétique enrichissement bourrelet suivie par tri cellulaire est utilisé pour donner des populations de grande pureté pour des études fonctionnelles.

L&#39;isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l&#39;intestin de souris

Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.

À haut débit de dosage de phénotype Salmonella enterica Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Et la lipogenèse de novo d'acides β oxydation gras constituent des voies métaboliques clés dans des hépatocytes, des voies qui sont perturbées dans plusieurs troubles métaboliques, y compris la maladie du foie gras. Ici, nous démontrons l'isolement des hépatocytes primaires de souris et de décrire la quantification de l'oxydation et de la lipogenèse acide β-gras.

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

&lt; classe p = 'jove_content'&gt; cellules Caco-2 peuvent servir de modèle in vitro pour étudier le transport des lipides par les entérocytes et les médicaments/vitamines liposolubles. Le système membranaire perméable sépare le compartiment apical du compartiment basolatéral, tandis que le système d’expression du lentivirus offre une méthode efficace de surexpression génique. L’isolement des lipoprotéines est confirmé par TEM.

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l&#39;intestin

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.

Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

Escherichia coli provoque une septicémie chez les nouveau-nés qui ingèrent la bactérie au moment de la naissance. Le processus impliqué dans la capacité d’E. coli à se déplacer des voies entériques à la circulation sanguine est mal compris. Ce modèle in vitro évalue la capacité des souches d’E. coli à traverser les cellules épithéliales intestinales.

Évaluation de la transcytose intestinale d’isolats néonatals de bactériémie à Escherichia coli

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Découvrez comment déterminer les concentrations tolérables d'acides gras et de toxine du choléra sur des cellules épithéliales intestinales humaines et des macrophages de souris BALB/c. Cette méthode aide à évaluer la viabilité cellulaire.

Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

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