Name: Lutilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin Drosophila Folliculo Isolation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-02T20:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Apprenez à isoler des follicules de Drosophila aux stades moyens et tardifs pour des analyses moléculaires, de l'imagerie en direct et des tests de développement in vitro. Cette méthode permet d'étudier l'oogenèse et la biologie cellulaire.

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Nous tenons à remercier Thomas Lecuit (la ligne de GFP de SQH-utrophine), Bloomington Stock Center, et le développement des études Hybridoma Banque des réactifs. Nous remercions en outre tous les membres de la Tootle Lab pour des discussions utiles et des critiques du manuscrit. Le financement de la National Science Foundation MCB-1158527, et des fonds de démarrage de l&#39;anatomie et de département de biologie cellulaire de l&#39;Université de l&#39;Iowa ont soutenu ce travail. National Institutes of Health des subventions de formation pré-doctorale en sciences pharmacologiques T32GM067795 soutenu SJA. support de stockage de données ont été fournies par l&#39;ICTS, qui est financé par le CSTC soutenue par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1RR024979.

Une. Préparation Drosophila avant l&#39;étape d&#39;isolement <ol><li> Faire de la pâte de levure humide en combinant 50 g de levure sèche active avec 90 ml d&#39;eau distillée. Mélanger avec une spatule pour mélanger. Laissez reposer le mélange pendant 30 min ~ avant d&#39;évaluer la cohérence. La consistance doit être juste assez épaisse pour adhérer au côté d&#39;un flacon de volée mais ne fonctionne pas sur le côté. Pour obtenir la consistance désirée, il peut être nécessaire d&#39;ajouter à 10 ml d&#39;eau supplémentaire ou d&#39;une petite quantité de levure sèche. Conserver dans un récipient couvert à 4 ° C. La levure stockée peut être utilisée pour ~ 1-2 semaines. </li><li> Recueillir &lt;24 h vieilles mouches adultes (deux mâles et femelles) des génotypes souhaités et de les mettre dans un flacon avec de la nourriture à la mouche ainsi que la pâte de levure humide étalé sur le côté du flacon. La température à laquelle les mouches sont maintenues variera en fonction de l&#39;expérience. Pour les expériences de routine, les mouches sont maintenus à la température ambiante. Attendu que des expériences dans lesquelles un gène estest surexprimé en utilisant le système UAS/GAL4 15 mai exiger le maintien de vol à 25 ° C ou plus, le cas échéant. </li><li> Fournir les mouches avec un nouveau frottis de pâte de levure par jour pendant 2 jours. NOTE: Comme le développement des follicules est étroitement régulée par l&#39;état nutritionnel de la mouche femelle, il est essentiel de fournir à la volée avec la pâte riche en éléments nutritifs de la levure pendant au moins 36 heures avant la dissection. </li></ol> 2. Isoler la mi et la fin de la drosophile par étapes follicules <ol><li> Autoriser les médias à venir à la température ambiante (~ 30 minutes). Si les follicules organisées vont être utilisés pour essais in vitro de développement, fraîchement préparer IVEM médias (insectes médias de Grace, 10% de sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur, et 1x pénicilline / streptomycine). Si les follicules organisées vont être utilisés pour l&#39;ARNm ou l&#39;isolement de protéines utilisent soit des insectes de Grace ou IVEM médias. IMPORTANT: la température des médias est essentiel. Si le support est froid, il va modifierà la fois de l&#39;actine et le cytosquelette de microtubules et de développement de bloc. </li><li> Anesthésier les mouches dans le flacon à la levure par injection de CO 2 gaz et placez 3-5 mouches femelles sur un bloc de mouche sous CO 2. IMPORTANT: Ne laissez pas plus de femmes que peuvent être disséqués dans une période de temps de 10 min sur le pavé de la mouche que l&#39;exposition prolongée au CO 2 peut provoquer la stérilité et la mort. </li><li> Remplir un puits d&#39;une plaque 9 place avec les médias et le placer sur une surface sombre (un morceau de plexiglas noir fonctionne bien). Focaliser le microscope à dissection sur le fond du puits. </li><li> Utilisation # 5 pince Dumont ramasser une seule femelle avec une seule main (ce qui est le mieux fait en utilisant la main dominante). Il est souvent plus facile de ramasser la femelle par les ailes, les jambes ou le thorax de l&#39;abdomen transition. Immerger la femelle dans les médias bien remplis. Ajuster le foyer du microscope selon les besoins. </li><li> En utilisant une deuxième paire de pince dans la main non dominante, saisir la femelle à l&#39;extrémité antérieure de l&#39;abdomende sorte que l&#39;extrémité postérieure est positionné vers la main dominante (Figure 2A). Assurez-vous de garder la volée immergée dans les médias. </li><li> Avec la main dominante, utilisez la pince pour saisir la cuticule à la 2e secteur pigmentée la plus postérieure et déchirer l&#39;écart du reste de l&#39;abdomen (figures 2B-C). </li><li> Utilisation de la pince dans la main dominante, presser doucement l&#39;extrémité antérieure de l&#39;abdomen jusqu&#39;à ce que les ovaires émergent (figures 2D-E). Si nécessaire, placez la pince entre les deux ovaires et les sortir de la carcasse. </li><li> Soit déplacer les ovaires à un nouveau puits avec du milieu frais (figure 2F) ou retirer la carcasse à une serviette Kimwipe ou papier. Ceci est particulièrement important si les follicules sont isolés pour le développement in vitro. </li><li> Répétez l&#39;opération jusqu&#39;à 3-5 paires d&#39;ovaires ont été isolés. REMARQUE: Chaque ovaire est composé de ~ 16 ovarioles ou des chaînes de manière séquentielle maturation des follicules. Chaque ovarioleest contenu dans une gaine de muscle. </li><li> Utilisation étaux de broches et les aiguilles fournies avec eux, tirer doucement à l&#39;ovaire en exécutant les aiguilles entre les ovarioles (figure 2G). Ce sera parfois libérer les follicules individuels. </li><li> Ovarioles individuels et les étapes morphologiques faciles à distinguer de développement des follicules doivent maintenant être visible (figure 2G, taquiné dehors de l&#39;ovaire). Se reporter aux figures 1 et 2H des différences morphologiques qui peuvent être utilisés pour distinguer les différentes étapes. Pour isoler les follicules qui sont dans ovarioles intactes et encore contenus à l&#39;intérieur d&#39;une gaine du muscle, en utilisant une aiguille de couper à travers la ovariole à la partie antérieure du follicule précédente et à la partie postérieure du follicule qui suit immédiatement le follicule d&#39;intérêt. Ceci brisera la gaine du muscle et le follicule d&#39;intérêt distance peut maintenant être coupé à partir des follicules voisins sans l&#39;endommager. </li&gt; <li> Comme les stades individuels sont séparés, déplacer les follicules présentant un intérêt, en utilisant une pipette en verre, d&#39;un nouveau puits avec du milieu frais. Ceci est particulièrement important lors de l&#39;isolation pour le développement des follicules in vitro. NOTE: Il est important de presser la poire de la pipette avant d&#39;entrer dans les médias pour empêcher les bulles d&#39;air de la redistribution des follicules d&#39;intérêt à travers le puits. En outre, si les follicules sont collés à la pipette en verre, la pipette peut être pré-revêtue avec 3% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) par pipetage de la solution de BSA de haut en bas plusieurs fois avec des milieux de rinçage et de dissection. </li><li> Une fois que suffisamment de follicules ont été isolés, procéder à des expériences ultérieures. </li></ol> 3. Développement in vitro de follicules S10B <ol><li> Isoler les follicules S10B en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) dans des milieux IVEM. Assurez-vous que les follicules sont rapidement éloignés de débris. Comme ces follicules vont continuer à mûrir, il est important que S10Bs sont collectées pendant 30-60 min, puis placé dans le milieu de maturation de choix. REMARQUE: S10B convient de distinguer soigneusement de follicules S10A (figure 1C par rapport à 1B), que les follicules S10A ne mûriront pas dans le milieu de culture IVEM. Dans les deux S10A et S10B follicules, la moitié de la longueur est composée de cellules nourricières et que l&#39;autre moitié est l&#39;ovocyte, mais dans S10B la longueur du follicule est égale à celle des follicules S14. </li><li> En utilisant une pipette en verre, déplacer ~ 30 follicules S10B dans un puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits. REMARQUE: Assurez-vous de vérifier que tous les follicules en cours de transfert sont S10B et n&#39;ont pas évolué au S11. </li><li> Préparer une pi de milieu de maturation par puits, à savoir les médias IVEM ainsi que réactifs pharmacologiques. </li><li> En utilisant une pipette en verre tiré *, supprimer autant les médias du bien (étape 3.2) que possible, et rapidement ajouter médias de maturation des choix. NOTE: Il est essentiel d&#39;utiliser un pépin de verre tiréette que les follicules mise en scène peut être facilement repris soit avec des pipettes en verre ou des embouts de pipette avec un Pipetman. * Pour pipettes tirés: 1) chauffer la partie mince de long, des pipettes en verre dans la flamme d&#39;un brûleur Bunsen jusqu&#39;à ce que le verre commence à se ramollir; 2) passer immédiatement la pipette de la flamme et tirez horizontalement pour tirer la pipette dans un tube plus fin; 3) casser pour générer une pointe fine. ATTENTION: Utilisez des lunettes de protection comme des fragments de verre peuvent s&#39;envoler. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.4 pour autant de puits de l&#39;expérience nécessite. </li><li> Permettent de développer les follicules pour&gt; 10 h et marquer la progression du développement sous un microscope à dissection. REMARQUE: Les expériences sont généralement marqué le lendemain pour laisser suffisamment de temps pour les follicules se développent. S10B est ~ 5 h, S11 est ~ 30 min, S12 est ~ 2 heures, et S13 est ~ 1 h dans la durée à 25 ° C 1 et du développement à la température ambiante prendra légèrement plus. Des expériences similaires à celle décrite pour les follicules peuvent être S10Beffectuée à l&#39;aide follicules S11-S13. </li></ol> 4. Etape isolement pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Isoler les follicules en phase avancée (S10B-14) exprimant le marqueur fluorescent de choix en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) dans des milieux IVEM, se déplaçant rapidement à une distance de follicules de débris. </li><li> Déplacez follicules d&#39;intérêt dans les nouveaux médias et les transférer à la pipette de verre à un fond de couvre-boîte de Pétri. Prenez soin d&#39;ajouter les médias de sorte qu&#39;il bouillonne dans la zone de fond de la lamelle, mais ne pas faire déborder. </li><li> Pour plus de films time-lapse, il est parfois nécessaire pour maintenir l&#39;humidité dans la boîte de Pétri en ajoutant un roulé Kimwipe, humidifié avec de l&#39;eau, au bord intérieur de la boîte de Pétri. Placer le couvercle sur le dessus. </li><li> L&#39;image sur un microscope inversé. Résolution détaillée, il faudra la microscopie confocale. Il est nécessaire pour équilibrer la fréquence de formation d&#39;image, la force d&#39;éclairement, et la longueur de formation d&#39;image, ce qui devra être mis au point de manière indépendante pour chaque loutil de Abeling et processus de développement. </li></ol> 5. Etape isolement pour l&#39;ARNm Préparation <ol><li> Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM. </li><li> En utilisant une pipette en verre, déplacer les étages individuels d&#39;intérêt dans de nouveaux puits avec des supports, il est possible de collecter à la fois des étages multiples. </li><li> Gardez les temps de collecte sous 1 heure. Déplacer les follicules, en utilisant une pipette en verre, à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation. </li><li> Spin brièvement le tube dans un mini-centrifuger pour sédimenter tous les follicules. En utilisant une pipette en verre tiré (voir l&#39;étape 3.4) retirez soigneusement tous les médias. NOTE: Si vous utilisez une micro en taille, centrifuger les follicules à basse vitesse. </li><li> Ajouter 100 pi de Trizol et broyer la main pour ~ 20 secondes en utilisant un pilon en plastique. Isoler à pleine vitesse dans une micro et déplacer Trizol dans un nouveau tube de 1,5 ml en faisant attention à ne pas gêner d granulésebris. Conserver à -80 ° C. </li><li> Répétez les étapes 5.1 à 5.5 jusqu&#39;à ce que suffisamment de follicules ont été obtenus pour l&#39;expérience. En routine, S10B ~ 75, ~ 75 S12, et S14 ~ 100 follicules donner ~ 10 pg d&#39;ARN. </li><li> Décongeler les échantillons sur la glace. Combiner les échantillons, le cas échéant, dans un tube de centrifugeuse et porter le volume Trizol jusqu&#39;à 800 pi. Procéder à l&#39;isolement de l&#39;ARN comme indiqué par le fabricant. IMPORTANT: N&#39;oubliez pas de DNase traiter l&#39;ARN isolé avec de la RNase DNase. </li></ol> 6. Etape isolation pour Western Blot <ol><li> Préchauffer un bloc chauffant à 100 ° C. </li><li> Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM. NOTE: Il est nécessaire de déterminer de façon empirique le nombre d&#39;un follicule étape particulière sont nécessaires pour observer chaque protéine spécifique. Pour les protéines fortement exprimés 1-3 S10B follicules / puits est suffisant pour voir un signal fort sur un western blot. Cependant, il est important de faire uneéchantillon représentatif, en follicules de plusieurs femelles. Ainsi, 15-20 follicules d&#39;un stade particulier sont généralement collectées. </li><li> Déplacer follicules, en utilisant une pipette en verre, d&#39;un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger brièvement dans une mini-centrifuger pour sédimenter les follicules (voir l&#39;étape 5.4). Retirez soigneusement tous les médias à l&#39;aide d&#39;une pipette de verre tiré (voir l&#39;étape 3.4) et ajouter 50 ul de PBS 1x et 50 pi de tampon Laemmli 2x. </li><li> Broyer à la main pour ~ 20 secondes avec un pilon en plastique. REMARQUE: pilons en plastique peuvent être réutilisés pour le broyage des échantillons de l&#39;Ouest par lavage et les autoclavage. </li><li> Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes dans le bloc chauffant. </li><li> Réfrigérer brièvement sur la glace et de spin à pleine vitesse pendant 15 secondes dans une microcentrifugeuse. Soit immédiatement chargé sur un gel SDS-PAGE ou conserver à -20 ° C. NOTE: Si les échantillons sont conservés, n&#39;oubliez pas de rebouillir les échantillons avant de les charger sur le gel. </li><li> Effectuer une analyse Western blot selon des protocoles standards. </li></ol>

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</ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

Le follicule drosophile est composé de seulement un petit nombre de types de cellules, le rendant idéal pour les analyses moléculaires et morphologiques. En outre, en raison de la structure de l&#39;ovaire, il est relativement facile d&#39;obtenir un grand nombre d&#39;étapes spécifiques du développement des follicules avec un microscope à dissection commune et une formation minimale. Comme chaque étape représente une fenêtre temporelle courte, l&#39;isolement de la scène peut fournir des indications moléculair...

Chaque ovaire chez la drosophile est composé de ~ 16 ovarioles, ou des chaînes de maturation séquentielle chambres d&#39;oeuf ou de follicules. Chaque follicule est composé d&#39;un seul ovocyte, cellules nourricières ou soutien dérivés 15 lignée germinale, et ~ 650 cellules somatiques appelées cellules folliculaires (figure 1A). Ovogenèse chez la drosophile est divisé en 14 étapes morphologiquement définies de développement 1. Chaque étape du développement folliculaire est observée plusieurs fois dans une seule volée, ce qui rend relativement facile d&#39;isoler un grand nombre de follicules spécifiques de stade. Les étapes de l&#39;ovogenèse (Etapes 10B-14) à mi-et la fin sont particulièrement bien adaptés pour l&#39;isolement de l&#39;étape (Figure 1). Au stade 10B (S10B), le follicule est complètement allongée (sa longueur est égale à celle d&#39;une étape 14 (S14) follicule, voir la figure 1 et la figure 2H), et la moitié de la longueur du follicule est composé de cellules nourricièrestandis que l&#39;autre moitié est l&#39;ovocyte (Figure 1C). A ce stade, les cellules nourricières sont soumis dramatique remodelage de l&#39;actine, le renforcement de l&#39;actine corticale et générant des faisceaux parallèles de filaments d&#39;actine 2. Dans le même temps, une population de cellules de follicules, dite cellules centripètes, de migrer entre les cellules nourricières et l&#39;ovocyte, et deux groupes dorsales des cellules du follicule devient spécifiée à subir une migration pour former les appendices dorsaux, des appareils respiratoires tubulaires pour l&#39;embryon 3 . Les cellules nourricières puis contrat (S11), en serrant leur contenu cytoplasmique dans l&#39;ovocyte dans un processus appelé infirmière cellule dumping, qui fournit l&#39;ovule avec les facteurs nécessaires pour qu&#39;il puisse compléter l&#39;embryogenèse (figure 1D). Les cellules nourricières sont alors soumis à la mort cellulaire (S12-S13) 4, et les cellules folliculaires sécrètent et modèle la coquille 5 (figures 1E-G). Ainsi, la fin de l&#39;ovogenèse est riche avec un développement important ded processus morphogénétiques. Follicules isolés mi-à fin-scène (S10B-S14) peuvent être utilisés pour une variété de raisons, y compris des analyses moléculaires. Par exemple, l&#39;ARNm à partir de follicules étagés peut être isolée pour la RT-PCR, puces à ADN, l&#39;ARN ou des analyses-seq. Cela permet de regarder l&#39;expression des gènes au sein d&#39;une fenêtre de développement à court, avec seulement quelques types cellulaires présents, et de déterminer comment l&#39;expression des gènes est modifiée par des perturbations soit pharmacologiques ou génétiques. l&#39;isolement de l&#39;étape peut également être utilisé pour étudier des protéines par transfert de Western. Cette analyse est importante car elle permet de quantifier le niveau d&#39;expression de la protéine dans le type sauvage contre des mutants à des stades spécifiques. Alors que l&#39;on pourrait utiliser immunofluorescence analyse pour obtenir des résultats similaires, la quantification de la fluorescence est moins robuste en raison des exigences strictes que tous les pixels se situer dans la plage linéaire de détection 6. En outre, l&#39;analyse western blot peut fournir d&#39;autres informations, par exemple uns si la protéine est modifiée ou post-traductionnelle est exprimé à partir d&#39;une épissure isoforme spécifique. Étapes isolées peuvent également être utilisées pour une purification supplémentaire de la protéine, y compris fractionnement subcellulaire ou co-immunoprécipitation. L&#39;isolement du follicule spécifique du stade peut également être utilisé pour des essais in vitro de développement 7 et 8 d&#39;imagerie en temps réel. Isolés follicules S10B-S13 continueront à se développer à S14 dans les milieux de culture simples (voir ci-dessous). Il est important de noter que les follicules S10A ne seront pas progresser à travers infirmière cellule dumping en utilisant les conditions de culture abordées dans ce manuscrit. Nous avons utilisé S10B dans des essais in vitro de développement de définir le rôle des prostaglandines, à la fois sur le plan pharmacologique et génétique, dans la régulation de l&#39;actine remodelage en utilisant infirmière cellule le dumping et le développement-outs lire 7,9. De la même façon, les stades ultérieurs de développement peuvent également être isolées pour déterminer les effets des traitements pharmacologiques ou homme génétiqueipulations sur des procédés particuliers tels que la migration centripète de la cellule, la migration dorsale de l&#39;appendice / formation 10, et l&#39;infirmière la mort cellulaire. Ces tests peuvent être utilisés pour effectuer des écrans d&#39;interaction dominants ou les dosages, par exemple, alors que l&#39;hétérozygotie des mutations dans pxt ou fascine seuls n&#39;ont aucun effet sur ​​S10B développement in vitro, les follicules de doubles hétérozygotes exposition infirmière cellule de dumping défauts et un bloc dans le développement 9. En outre, parce S10B-13 peut se développer dans la culture, l&#39;ensemble des processus qui se produisent pendant cette période peut être observé par live-imagerie. Cette image peut être effectuée simplement en utilisant la lumière transmise (si l&#39;on est seulement intéressé par les variations brutes de la morphologie) ou la microscopie confocale en utilisant des mouches transgéniques exprimant des sondes ou des follicules colorées avec des teintures fluorescentes imagerie en direct. Imagerie en temps réel est utilisé pour faire avancer considérablement notre compréhension des processus de développement. En effet, vivre Imaging de follicules à un stade avancé a élargi la connaissance de la migration dorsale de l&#39;appendice, un exemple de tubulogenèse 10. Nous nous attendons à ce que l&#39;imagerie en direct de processus à un stade avancé supplémentaires, y compris la dynamique de l&#39;actine pendant infirmière cellule de dumping, fournira des informations nouvelles sur ces événements de développement. Il est important de noter que tandis que S10A et les premiers stades du développement du follicule ne va pas continuer à se développer en une S14 dans la culture, en direct-imagerie d&#39;événements survenus au cours de ces stades de développement est possible en utilisant des conditions de culture alternatifs 11-14 (voir discussion plus d&#39;informations). Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler follicules à un stade avancé de développement, soit in vitro et vivons-imagerie, ou des analyses moléculaires (ARNm et isolement des protéines).

<table><tbody><tr><td>Levure sèche active</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Toute source de levure sèche active est bonne</td></tr><tr><td>Grace' s Insect Media</td><td>Lonza</td><td>04-457F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal inactivé</td><td>par la chaleur Atlanta Biologicals</td><td>S11050H</td><td>Tout FBS inactivé par la chaleur devrait fonctionner</td></tr><tr><td>10x Pen/Strep</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pin Vises and Needles</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’implantation, neuf puits</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pince Dumont</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>24 plaques multipuits</td><td>Becton Dickinson</td><td>35 3226</td><td>Toute boîte de culture tissulaire à 24 puits doit fonctionner</td></tr><tr><td>Couverture Boîtes inférieures (35 mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>L’épaisseur de la lamelle dépend du microscope/ objectif en cours d’utilisation</td></tr><tr><td>Pipettes en verre</td><td>Corning</td><td>7095B-5x (pour le transfert des follicules)</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre longues</td><td>Corning</td><td>7095B-9 (pour la production de pipettes tirées)</td><td></td></tr><tr><td>Pilon d’échantillon (1.5 &mu ; l; Sans RNase/DNase)</td><td>Research Products International</td><td>199228</td><td>Tout pilon en plastique qui convient à 1,5 &mu ; l les tubes microfuge peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; drosophila</em&gt; folliculo isolation

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Ovogenèse chez la drosophile ou le développement des follicules a été largement utilisé pour faire avancer la compréhension des processus biologiques de développement et cellulaires complexes. Ce document décrit comment des méthodes pour isoler les follicules de la scène mi-to-fin (étape 10B-14) et de les utiliser pour apporter de nouveaux éclairages sur les événements moléculaires et morphologiques survenant pendant fenêtres étanches de temps de développement. Follicules isolés peuvent être utilisés pour une variété de techniques expérimentales, y compris les essais in vitro de développement, l&#39;imagerie en temps réel, l&#39;analyse de l&#39;expression d&#39;ARNm et l&#39;analyse western blot des protéines. Follicules au stade 10B (S10B) ou plus tard viendront compléter le développement de la culture, ce qui permet de combiner des perturbations génétiques ou pharmacologiques avec le développement in vitro de définir les effets de ces manipulations sur les processus qui se produisent pendant des périodes spécifiques de développement. En outre, parce que ces follicules se développent en culture, elles sont idéales pour les études d&#39;imagerie en direct, Qui révèlent souvent de nouveaux mécanismes qui interviennent dans les événements morphologiques. Follicules isolées peuvent également être utilisées pour les analyses moléculaires. Par exemple, des changements dans l&#39;expression des gènes qui résultent de perturbations génétiques peuvent être définis pour des fenêtres spécifiques du développement. De plus, les taux de protéine, la stabilité et / ou l&#39;état de modification post-traductionnelle de pendant une étape particulière du développement des follicules peuvent être examinées par l&#39;intermédiaire des analyses western blot. Ainsi, l&#39;isolement spécifique au stade de follicules drosophile fournit une riche source d&#39;information dans les processus largement conservées du développement et de la morphogenèse.

Lorsque l&#39;isolement des stades spécifiques du développement folliculaire chez la drosophile, il est essentiel d&#39;être capable de distinguer avec précision les différentes étapes morphologiques. Ceci est quelque peu difficile pour les S10A et S10B, comme les cellules nourricières et l&#39;ovocyte prennent chacun la moitié de la longueur du follicule à ces stades (Figure 1B par rapport à 1C). Cependant, les follicules S10A sont plus courts en longueur que les follicules S1...

L&#39;isolement spécifique du stade de-mi-à la fin de follicules de Drosophila est utile pour une variété de fins. Ces follicules se développent dans la culture, ce qui permet des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour être couplés avec des essais in vitro de développement et de l&#39;imagerie en temps réel. En outre, les follicules peuvent être utilisées pour des études moléculaires, telles que l&#39;isolement de l&#39;ARNm et des protéines.

L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des follicules ovariens spécifiques aux stades intermédiaires à tardifs pour divers types d'expériences, notamment des analyses moléculaires, l'imagerie en temps réel et des tests de développement in vitro. Cette isolation est réalisée en disséquant d'abord les ovaires, puis en séparant ces derniers en ols. Une fois les follicules de stade spécifique isolés, ils peuvent être utilisés pour des analyses moléculaires, de l'imagerie en temps réel ou des études de développement in vitro.En fin de compte, les résultats peuvent révéler quels aspects de l'ovogenèse tardive chez Drosophila sont régulés par des facteurs spécifiques grâce à des manipulations pharmacologiques et génétiques combinées à ces tests. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du développement et de la biologie cellulaire, telles que l'actine, la dynamique du cytosquelette, les processus morphologiques, la genèse tubulaire, ainsi que la sécrétion et le modelage de la matrice extracellulaire. Pour ce protocole, recueillir des mouches adultes jeunes bien nourries des deux sexes deux jours avant l'isolement des follicules.Si les follicul

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Drosophila melanogaster testicules peuvent être rapidement et efficacement isolées des mâles adultes utilisant des aiguilles à dissection. Avec la pratique, on peut facilement isoler dans un ou deux jours d'un montant de testicules suffisant pour l'analyse d'ADN ou d'ARN par séquençage à haut débit ou plus des méthodes traditionnelles de biologie moléculaire ou de protéines pour des dosages d'anticorps ou à base d'enzymes.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

Cette vidéo décrit une méthode pour enlever mécaniquement le chorion et les membranes vitellines d’ovocytes de drosophile matures préalablement fixés. Le protocole présenté présente une démonstration détaillée de la procédure permettant d’obtenir des ovocytes compatibles avec les tests d’hybridation in situ fluorescents.

Extraction mécanique du chorion et de la membrane vitelline : une méthode pour préparer les ovocytes de drosophile à l’observation directe

Tissus de Drosophila contiennent souvent un mélange hétérogène de types de cellules. Afin d'examiner l'expression des gènes dans des types de cellules spécifiques d'un tissu particulier, les noyaux peuvent être génétiquement marqués et ensuite isolés en utilisant une approche basée sur l'affinité. Des noyaux isolés peuvent être utilisés pour des applications en aval tels que l'analyse de l'expression génique et immunoprécipitation de la chromatine.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Ce protocole décrit la dissection et la culture de testicules intacts et de kystes germinaux à partir de pupes de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet l’observation microscopique de la spermatogenèse ex vivo. De plus, nous décrivons un test pharmacologique de l’effet des inhibiteurs sur des étapes spécifiques du développement des cellules germinales dans les testicules nymphaux.

Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l&#39;imagerie et le traitement pharmacologique

La méthode d’imagerie verticale décrite dans ce protocole permet de visualiser en détail les pôles d’un œuf de Drosophila melanogaster en développement.  Cette vue d’ensemble offre une nouvelle perspective sur les arrangements et les morphologies de plusieurs types de cellules dans l’épithélium folliculaire.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Nous présentons des protocoles pour la collecte, la préparation et l’imagerie d’ovocytes de drosophile matures. Ces méthodes permettent de visualiser le comportement des chromosomes ainsi que l’assemblage et la fonction du fuseau pendant la méiose.

Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe<em&gt; Drosophila</em&gt; ovocytes

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques

Ici, nous présentons un protocole pour dissocier et trier une population cellulaire spécifique des glandes accessoires mâles de Drosophila (cellules secondaires) pour le séquençage d'ARN et RT-qPCR. L'isolement cellulaire est accompli par la purification FACS des cellules secondaires GFP-exprimant après un processus multiétape-dissociation exigeant la dissection, la digestion de protéases et la dispersion mécanique.

Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Apprenez à isoler des follicules de Drosophila aux stades moyens et tardifs pour des analyses moléculaires, de l'imagerie en direct et des tests de développement in vitro. Cette méthode permet d'étudier l'oogenèse et la biologie cellulaire.

L'utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin

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