Une méthode sensible pour quantifier les cellules sénescentes du cancer

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la sénescence cellulaire de manière rapide et sensible. Nous démontrons ici l’utilité de cette méthode dans le criblage de médicaments chimiothérapeutiques potentiels. D’abord pour induire la sénescence cellulaire.

Le médicament chimiothérapeutique doxorubicine est ajouté aux cellules cancéreuses. Ensuite, on applique un bain pour neutraliser le pH acide des lysosomes cellulaires. Ensuite, le substrat de perméat cellulaire bêta galacto C 12 FDG est ajouté lors de l’absorption cellulaire.

Le C 12 FDG est hydrolysé et fluorescent. Étant donné que les bêta-GCSE sont enrichis en lysosomes des cellules sénescentes, ils deviennent plus fluorescents que les cellules non sénescentes. Pour quantifier la différence de fluorescence, les cellules sont analysées sur un cytomètre en flux. L’analyse des données résultantes permet de quantifier le pourcentage de cellules cancéreuses sénescentes dans différentes conditions de traitement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le fait le bêta-galactose, par exemple, est qu’elle facilite la quantification rapide et sensible des cellules sénescentes. En fait, nous ajoutons d’abord l’idée de cette méthode lorsque nous rencontrons des difficultés à quantifier les cellules sénescentes à l’aide de l’asay bêta-galactose couramment utilisé. Bien que nous utilisions cette technique pour détecter la sénescence sur les cellules cancéreuses, elle peut également être utilisée sur des cellules normales.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions rapides dans le domaine du cancer, par exemple si un médicament chimiothérapeutique a induit les cellules cancéreuses à sse, ce qui pourrait favoriser la malignité. Ainsi, cette technique pourrait à terme aider à notifier de nouveaux traitements thérapeutiques contre le cancer. En travaillant dans une hotte chimique, la poudre de C 12 FDG a été dissoute dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 20 millimolaires aliquote dans des tubes de 0,5 millilitre et stockée à moins 80 degrés Celsius.

Le DMSO doit être utilisé dans des conditions de sécurité appropriées, ainsi que le dissoudre. CIN A : une poudre dans du DMSO à une concentration finale de 0,1. Millimolar Eloqua la solution dans des microtubes à centrifuger de 0,5 millilitre et stockez-les à moins 20 degrés Celsius.

Notez que le CIN doit être utilisé avec des précautions de sécurité appropriées. Cette procédure peut être effectuée à l’aide de cellules adhérentes ou non adhérentes. Ici, la procédure est démontrée à l’aide de la lignée cellulaire de myélome humain RPMI 8 2 2 6.

Ces cellules se développent en suspension, cultivent des cellules RPMI 8 2 2 6 cellules dans un milieu contenant 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone 24 heures avant de réaliser l’expérience, ensemencent les cellules dans des plaques à six puits afin qu’elles soient dans la phase logarithmique de la courbe de prolifération cellulaire. Au moment de l’expérience pour déterminer le pourcentage de cellules sénescentes, trois échantillons de cellules seront nécessaires. Cellules non traitées et non colorées ST, cellules non traitées colorées au C 12 FDG et cellules traitées colorées au C 12 FTG.

Pour chaque condition, un minimum de cinq fois 10 à la cinquième cellules est nécessaire pour la sénescence induite par la cytométrie en flux des cellules cancéreuses. En ajoutant le médicament chimiothérapeutique doxorubicine, la concentration du médicament et la durée du traitement doivent être adaptées au type de cellule. Testé pour rpmi 8 2 2 6 cellules.

La sénescence peut être induite en traitant 10e des six cellules par millilitre avec 15 nanomolaires de doxorubicine pendant 48 heures. N’oubliez pas d’inclure l’échantillon non traité en tant qu’incubation de contrôle négatif à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le traitement par des médicaments chimiothérapeutiques peut entraîner une apoptose cellulaire.

Par conséquent, après deux jours, vérifiez la viabilité cellulaire par exclusion du bleu trian à l’aide d’un hémomètre, d’un cytomètre et d’un microscope. Si le pourcentage de viabilité est inférieur à 70 %, retirez les cellules mortes à l’aide d’un kit approprié, tel que le kit d’élimination des cellules mortes de Milton E, pour vous assurer que les cellules mortes ne biaseront pas l’analyse ultérieure. Sinon, retirez le milieu de culture en faisant tourner les cellules à 300 GS pendant cinq minutes.

Ensuite, après avoir retiré le surnageant dans un milieu de culture frais préchauffé contenant 100 anom ou cin, un pour neutraliser le pH acide des lysosomes incube pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dissout le bêta galacto un substrat C 12 FDG dans la culture fraîche d’avant-guerre. Concentration moyenne à finale de deux millimolaires. Suite à l’incubation avec de la mycine beil.

Ajouter du C 12 FDG directement dans les cellules et le milieu jusqu’à une concentration finale de 33. Les micromolaires incubent pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après l’essorage, lavez les cellules deux fois avec le PBS en tournant vers le bas à chaque fois comme auparavant et en retirant le surnageant après le deuxième lavage. Resus suspend la pastille cellulaire dans 500 microlitres de PBS froid puis effectue un co-immunomarquage pour caractériser davantage la population de cellules sénescentes. Si vous n’avez pas d’expérience avec la cytométrie en flux, l’aspect le plus difficile de cette procédure sera d’effectuer l’analyse par cytométrie en flux.

Pour assurer le succès, assurez-vous d’inclure les contrôles appropriés et de demander l’aide d’une personne inexpérimentée au besoin. Avant d’exécuter le premier échantillon, préparez un graphique à deux paramètres affichant le canal de diffusion directe ou le FSC par rapport au canal de diffusion latérale SSC. Exécutez ensuite le premier échantillon contenant des cellules non étiquetées.

Réglez les tubes photomultiplicateurs ou PMT et définissez une région d’intérêt, à l’exclusion des cellules mortes et des débris cellulaires qui auraient pu apparaître lors de la porte de préparation de l’échantillon. Cette région d’intérêt dans un histogramme à un paramètre montrant la fluorescence du C 12 FDG comme FL un sur l’échelle logarithmique de l’axe des x et le nombre d’événements dans l’axe Y. Le nombre total d’événements représente le nombre de cellules analysées.

Définissez le PMT de sorte que les cellules non étiquetées apparaissent dans la première décennie sur l’échelle logarithmique de l’axe x. Déterminez l’autofluorescence des cellules si nécessaire en faisant fonctionner les cellules non marquées dans le flux. Le cytomètre exécute le deuxième échantillon contenant des cellules non traitées sur l’histogramme à un paramètre affichant FL, on place le curseur après la population faiblement marquée.

Ce seuil permettra de discriminer les cellules non sénescentes, qui sont faiblement marquées, et les cellules sénescentes, qui sont brillamment marquées. Analysez le troisième échantillon contenant des cellules traitées. Les cellules sénescentes marquées de manière brillante apparaissent au-dessus du seuil déterminé à l’étape précédente.

Évaluez le pourcentage de cellules sénescentes en divisant le nombre d’événements lumineux par le nombre total d’événements si nécessaire. L’activité de la bêta-galactotase peut également être estimée à l’aide de l’intensité moyenne de fluorescence pour évaluer la sénescence induite par une procédure chimiothérapeutique. La lignée cellulaire du myélome multiple R RRP I 8 2 2 6 disponible dans le commerce a été traitée pendant deux jours avec de la doxorubicine, un médicament chimiothérapeutique et un test de sénescence comme décrit dans cette vidéo, ces histogrammes montrent la fluorescence des cellules non traitées à gauche et des cellules traitées à droite.

Une population de cellules brillamment marquées représentant des cellules sénescentes apparaît dans la région V.In parallèle, le même échantillon de cellules a été coloré à l’aide du test bêta-galacto sase. Dans cette image représentative, des cellules entièrement bleues et des cellules partiellement bleues sont montrées pour illustrer la difficulté de distinguer les cellules sénescentes vraiment bleues. Pour illustrer la spécificité du C 12 FDG dans la détermination du pourcentage de cellules sénescentes, les cellules ont également été traitées avec diverses concentrations de doxorubicine.

Le pourcentage de cellules sénescentes a été déterminé en divisant le nombre d’événements brillants. Pour le nombre total d’événements, les pourcentages de cellules sénescentes étaient de 0,8 %, 15,78 % et 26,31 % pour une dose de 5, 25 et 50 nanomolaires de doxorubicine respectivement. Cela démontre que le marquage C 12 FTG est spécifique aux cellules sénescentes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier les cellules sénescentes peuvent être en série ou non par cytométrie en flux en suivant cette procédure de méthodes comme l’immuno-marquage être effectué afin de caractériser les cellules sénescentes. N’oubliez pas que travailler avec du DMSO ou des cellules cancéreuses peut être extrêmement dangereux. Des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.