Optogenetic Perturbation de l'activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes Drosophila Les larves in Motion

Dans ce protocole, nous commençons par nourrir la larve du génotype approprié avec de la nourriture à base de E contenant tous les TR trans A. Chaque laboratoire est épinglé et disséqué dans une solution saline normale pour remplacer la solution saline normale par une solution de sonnerie de calcium de deux milli et régler la préparation du BAAP sur la platine du microscope. Le mouvement du BAAP disséqué est enregistré sur vidéo avec une caméra CCD. En éclairant le système nerveux localement, nous pouvons perturber l’activité neurologique d’un sous-ensemble de neurones dans un timing spécifique tout en surveillant le mouvement de la même préparation d’action.

Bonjour, je suis Tega dans le laboratoire Dr.A. Salut, je suis Salut Kosaka, également en dr. Un niveau Oph de laboratoire.

La locomotion est un système modèle utile pour l’étude des circuits moteurs. En raison des techniques génétiques hautement développées dans ce protocole, nous allons manipuler optogénétiquement les motoneurones tout en surveillant le mouvement du niveau. En utilisant des lasers dans le microscope confocal, un sous-ensemble de neurones peut être stimulé et les réponses motrices à la perturbation spatio-temporelle des neurones peuvent être analysées.

Alors commençons. Maintenir des lignes de mouches de K six G quatre US CHR deux, ou K six G quatre US NPHR dans des bios en plastique contenant des aliments vivants standard. Ajouter une solution TL à la levure à base des concentrations appropriées et bien mélanger Étaler la levure à base d’un jus de pomme.

Prélevez le deuxième ou le troisième en SLA dans les flacons. Placez le hall sur l’aate avec un espace de levure contenant un TR. Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour garder un TR dans l’obscurité. Augmentez la température du hall d’entrée à 25 °C pendant une période appropriée.

Il s’agit d’une caméra CCD pour visualiser le même laboratoire intact. Fixez la caméra CCD à un microscope confocal conventionnel avec un détachement SEMA. Prenez le hall A TRA et rincez-les à l’eau.

Pour éliminer la nourriture résiduelle du corps, placez la lave sur le plat froid de garde C côté dorsal vers l’extérieur. Épinglez avec des épingles à insectes de la tête et de la queue. Ajouter une solution saline normale sans calcium.

Faites une petite incision près de la queue avec des micro-ciseaux de l’incision. Faites une coupe longitudinale le long de la ligne médiane dorsale. Veillez à ne pas endommager le noyau nerveux ventral et les nerfs périphériques.

Faites une petite incision latérale de la tête en épinglant chaque coin de la paroi corporelle disséquée. Enlever les organes internes à l’exception du cerveau et du cordon nerveux ventral. Remplacez la solution saline normale par une solution de sonnerie de calcium de modèle 2 millions.

Fixez une lentille d’objectif sec à pleine puissance dans le microscope confocal et réglez la préparation du laboratoire sur la platine du microscope. Obtenir une image de transmission de la préparation disséquée avec un laser rouge pour localiser le code du nerf ventral par microscope confocal. Définir la région d’intérêt sur le moule de zoom de l’image de transmission est utile pour déterminer la région d’intérêt spécifique.

Changez le jeu de filtres du microscope pour éclairer avec une lumière de 488 nanomètres ou 559 nanomètres. Visualisez la paroi du corps en éclairant la préparation avec la lampe halogène. Surveillez la préparation à l’aide d’une caméra CCD fixée au microscope confocal.

Rappelez-vous le mouvement de la paroi du corps et commutez le faisceau laser uniquement pour manipuler temporairement les activités neuronales tout en surveillant le mouvement péristaltique dans la même préparation intacte est observé et enregistré par la caméra CCD. Ce laboratoire exprime CHL deux dans les neurones modernes. L’éclairage d’un ou deux segments du noyau nerveux ventral active les neurones modernes dans les segments, ce qui induit à son tour une contraction musculaire dans les segments correspondants de la paroi corporelle, stimulant d’autres segments du nerf ventral.

Le froid induit la contraction d’autres segments du corps. Le NPHL a été exprimé dans les motoneurones lorsque quelques segments de l’appel du nerf ventral ont été stimulés par un laser jaune. L’onde propagatrice a été arrêtée au niveau du segment correspondant de la paroi corporelle.

L’onde a ensuite redémarré à partir du segment arrêté lorsque l’élimination laser a été désactivée. Ce protocole élucide la procédure de perturbation optogénétique de l’activité neuronale avec des lasers au même niveau circulaire en mouvement. Le code du nerf ventral et le nerf périphérique ne doivent pas être endommagés lors de cette dissection pour obtenir une stimulation suffisante.

La puissance d’éclairage doit être ajustée en modifiant la puissance du laser, la vitesse de balayage ou le nombre de répétitions au microscope confocal. Il s’agit de l’intégralité du protocole. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.