Optogenetic Perturbation de l'activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes

Dans ce protocole, nous commençons par nourrir la larve de génotype approprié avec un aliment à base d'E contenant tout le TR en forme trans. Chaque larve est fixée et disséquée dans une solution saline normale, puis la solution saline normale est remplacée par une solution Ringer au calcium à deux millimoles, et la préparation LABA est placée sur la platine du microscope. Le mouvement de la préparation LABA disséquée est enregistré en vidéo à l’aide d’une caméra CCD. En illuminant localement le système nerveux, nous pouvons perturber l’activité neuronale d’un sous-ensemble de neurones à un moment précis tout en surveillant le mouvement de la même préparation inerte.

Bonjour, je suis Tega dans le laboratoire du Dr. A. Bonjour, je suis Hi Kosaka, également dans le laboratoire du Dr. A, niveau Oph.

La locomotion constitue un modèle utile pour l'étude des circuits moteurs. En raison des techniques génétiques très avancées décrites dans ce protocole, nous allons utiliser une manipulation optogénétique des neurones moteurs tout en surveillant le mouvement. En utilisant des lasers dans le microscope confocal, un sous-ensemble de neurones peut être stimulé et les réponses motrices aux perturbations spatiotemporelles de ces neurones peuvent être analysées.

Commençons donc. Maintenez des lignées de drosophiles de type K six G quatre US CHR deux, ou K six G quatre US NPHR, dans des flacons en plastique contenant de la nourriture vivante standard. Ajoutez une solution TL au levain à des concentrations appropriées et mélangez soigneusement. Étalez le levain sur un milieu à base de jus de pomme.

Prélevez la deuxième ou la troisième souche SLA à partir des flacons. Placez la souche sur la boîte de Petri contenant l'espace avec la levure et un TR. Recouvrez la boîte de Petri avec du papier d'aluminium afin de maintenir le TR à l'obscurité. Incubez la souche à 25 degrés C pendant une période appropriée.

Il s'agit d'une caméra CCD destinée à la visualisation du même laboratoire intact. Fixez la caméra CCD à un microscope confocal conventionnel muni d'un détachement SEMA. Prenez le hall A TRA et rincez-le à l'eau.

Pour éliminer les résidus alimentaires du corps, placez la lave sur le côté dorsal du plat froid du garde C. Fixez la tête et la queue à l’aide d’épingles à insectes. Ajoutez du sérum physiologique sans calcium.

Réalisez une petite incision près de la queue avec des ciseaux microchirurgicaux à partir de l'incision. Effectuez une incision longitudinale le long de la ligne médiane dorsale. Veillez à ne pas endommager le cordon nerveux ventral et les nerfs périphériques.

Pratiquer une petite incision latérale du pincement de la tête à chaque coin de la paroi corporelle disséquée. Enlever les organes internes, à l'exception du cerveau et du cordon nerveux ventral. Remplacer la solution saline normale par une solution ringer au calcium à 2 millions d'unités modèles.

Fixez un objectif sec à puissance maximale sur le microscope confocal et placez la préparation expérimentale sur la platine du microscope. Obtenez une image en transmission de la préparation disséquée à l’aide d’un laser rouge afin de localiser le cordon nerveux ventral au microscope confocal. Définissez la région d’intérêt sur l’image en transmission ; un zoom s’avère utile pour déterminer la région d’intérêt spécifique.

Changez le jeu de filtres du microscope pour éclairer avec une lumière de 488 nanomètres ou de 559 nanomètres. Visualisez la paroi corporelle en éclairant la préparation avec la lampe halogène. Surveillez la préparation à l’aide d’une caméra CCD fixée au microscope confocal.

Se souvenir du mouvement de la paroi corporelle et commuter le faisceau laser uniquement pour manipuler temporairement les activités neuronales, tout en surveillant le mouvement péristaltique ; ce dernier est observé et enregistré dans la même préparation intacte à l’aide d’une caméra CCD. Ce laboratoire exprime CHL deux dans les neurones modernes. L’illumination d’un ou deux segments du cordon nerveux ventral active les neurones modernes situés dans ces segments, ce qui induit à son tour une contraction musculaire dans les segments correspondants de la paroi corporelle, stimulant ainsi d’autres segments du cordon nerveux ventral.

Le froid induit la contraction d'autres segments du corps. La LHPN était exprimée dans les neurones moteurs lorsque quelques segments du cordon nerveux ventral étaient stimulés avec un laser jaune. L'onde propagée était arrêtée au niveau du segment correspondant de la paroi corporelle.

L'onde redémarrait ensuite à partir du segment arrêté lorsque l'élimination par laser était désactivée. Ce protocole décrit la procédure permettant d'effectuer une perturbation optogénétique de l'activité neuronale à l'aide de lasers au même niveau circulaire inactif en mouvement. Le cordon nerveux ventral et les nerfs périphériques ne doivent pas être endommagés lors de cette dissection afin d'obtenir une stimulation suffisante.

La puissance d'éclairage doit être ajustée en modifiant la puissance du laser, la vitesse de balayage ou le nombre de répétitions sur le microscope confocal. Ceci est l'intégralité du protocole. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.