Le En ovo CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

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L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un test de membrane toïcienne de poulet ou CAM pour étudier le comportement du sarcome, des cellules ou des greffons. Pour ce faire, il suffit de faire d’abord une fenêtre dans la coquille d’un œuf le troisième jour d’incubation. Dans la deuxième étape, le neuvième jour d’incubation, le matériel tumoral est préparé.

Ensuite, après avoir retiré la couche épithéliale, la tumeur est ajoutée à la caméra Au cours de l’étape finale du 16e jour d’incubation, la CAM est photographiée, récoltée et fixée dans du formol pour une évaluation histologique. En fin de compte, l’histologie classique h et d et l’immunohistochimie sont utilisées pour mettre en évidence le sarcome, la prolifération cellulaire et la vascularisation de l’invasion, ainsi que les réactions de l’hôte. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la xénogreffe la plupart des modèles, est qu’elle est simple à prendre en main et relativement bon marché.

Il vous permet également d’étudier une myriade d’activités associées aux métastases dans un laps de temps très court, et il ne nécessite pas de comité d’éthique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le sarcome, telles que l’effet des interactions entre l’hôte de la tumeur sur la survie de la tumeur, la reconstitution du microenvironnement tumoral et le recrutement des cellules du stroma. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie personnalisée du sarcome, car le matériel du patient peut être étudié.

Toute cette nouvelle technique peut nous fournir de nouvelles perspectives sur la neurogenèse du SAR. C’est aussi très applicable à d’autres systèmes tels que l’oncogenèse en général. Commencez par utiliser un scalpel stérile pour couper l’échantillon de tumeur en petits morceaux, ne dépassant pas un millimètre cube, en enlevant toutes les zones calcifiées.

Ensuite, pesez l’échantillon et transférez deux à quatre grammes de tissu dans un tube de dissociation. Digérez le tissu dans 2,5 millilitres de collagénase deux et 2,5 millilitres de solutions de DN a. Après le traitement du tissu, selon le protocole de dissociation tumorale H, filtrez la suspension résultante à travers une passoire cellulaire de 150 microns.

Maintenant, centrifugez la suspension à une force centrifuge appropriée, par exemple 100 à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir soigneusement retiré le surnageant à l’aide d’une pipette, incubez la pastille dans 10 millilitres de lyse érythrocytaire, tamponnez à température ambiante avec une tation occasionnelle. Après 10 minutes, ajoutez 25 millilitres de milieu de culture pour arrêter la réaction après avoir fait tourner à nouveau la suspension, la pastille doit être blanche, jetez le surnageant et ajoutez cinq millilitres de milieu aux cellules, puis filtrez la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 microns.

Utilisez un compteur automatique de cellules pour déterminer le nombre de cellules vivantes par millilitre au développement. Le troisième jour, insérez une aiguille de calibre 18 dans la pointe de l’œuf et retirez deux millilitres d’albumine pour abaisser le niveau de la membrane ou de la came du chorio OVO tout toïc. Appliquez maintenant un film adhésif semi-perméable sur la face supérieure marquée de la coque pour éviter le déversement de particules de coque sur la came lors de la découpe de la fenêtre.

Faites ensuite un trou d’introduction avec un petit tout à la surface de l’œuf. Ne pas endommager la came lors de l’ouverture de la coque est la partie la plus délicate de la procédure. Nous utilisons des ciseaux tranchants qui les tiennent horizontalement dans une main tout en gardant l’œuf dans l’autre main.

Maintenant, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux stériles et pointus pour couper une fenêtre d’un centimètre carré dans la coquille. Le cœur palpitant et les vaisseaux adjacents de l’embryon doivent maintenant être visibles à la surface du jaune d’œuf. Retirez tous les ovules non fécondés ou les embryons morts.

Scellez ensuite la fenêtre avec un film adhésif semi-perméable plus important. Après avoir à nouveau fait tourner la suspension tumorale, remettez la pastille en suspension dans du gel de matrice extracellulaire refroidi à une fois 10 à six cellules pour 100 microlitres de gel. Conservez cette solution sur de la glace fondante.

Ensuite, sous flux laminaire, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux stériles pour exciser une partie du film adhésif semi-perméable. Retirez la couche de cellules épithéliales en touchant légèrement la came avec une tige de verre stérile. Ajoutez ensuite 4 gouttes de 25 microlitres de la suspension de gel ECM à la came, permettant au gel ECM de polymériser entre les applications.

De cette façon, une plaque adhérente contenant les cellules cancéreuses est créée. Ensuite, scellez à nouveau la fenêtre de la coque avec un film adhésif semi-perméable. Après la période d’incubation expérimentale appropriée, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour agrandir la fenêtre de la coquille, en veillant à ne pas couper trop bas.

Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez 300 à 500 microlitres de PBS sur la section CAM contenant le matériau inoculé. Photographiez ensuite la caméra à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréoscopique. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux stériles, coupez la membrane à la bordure contre la coquille et placez la came récoltée dans une boîte de Pétri stérile remplie de PBS ou de formaldéhyde tamponné.

Photographiez ensuite les côtés supérieur et inférieur de la caméra, avec et sans filtre, comme on le voit. Dans cette première figure, les greffons tumoraux deviennent adhérents à la came. Ici, une suspension unicellulaire provenant de matériel patient présentant une plaque séchée et légèrement surélevée peut être observée sur ces deux images.

Le plissement marqué de la membrane qui se produit après l’excision de la came est montré. La ligne SAO deux forme une plaque d’étalement sur le CAM avec une nette augmentation de la surface à partir du septième jour. Après l’inoculation, le signal GFP reste fort, indiquant des cellules viables.

Ces plaques contenant des cellules SW 1 3 53 présentent une diminution de surface et ont tendance à avoir une came contractée, ce qui entraîne une membrane ridée. Après la récolte à partir du septième jour, des saignements sont fréquemment observés. Le signal DSR diminue à mesure que la sonde fluorescente se dilue après de nombreuses divisions cellulaires, ainsi qu’en cas de saignement.

Dans la plupart des cas, une réaction vasculaire de la CAM est observée lorsque de nouveaux vaisseaux tortueux pénètrent dans l’échantillon. Par exemple, une ramification comme indiqué par les pointes de flèches et une anastomosation comme indiqué par les astérisques dans ce saignement punctiforme comme indiqué par les flèches, peuvent également être observées sur toute la plaque. Notez la migration des deux cellules SAO parallèlement aux vaisseaux de la came.

Cette réaction vasculaire peut être visualisée après l’excision de la came en vue inférieure, montrant des vaisseaux tortueux entourant le greffon ou la plaque. La réaction vasculaire de la CAM est observée dans le groupe greffon tumoral et le groupe suspension unicellulaire. Les preuves histologiques montrent que les deux cellules de SAO conservent une apparence de cellule unique tout au long du volume du gel de matrice extracellulaire, ce qui augmente l’épaisseur et le diamètre de la plaque.

Les cellules tumorales envahissent la couche mésodermique de la came comme indiqué ici par la flèche, élargissant ainsi la distance entre les couches endodermique et dermique de la came comme une fermeture éclair qui s’ouvre. Comme l’indique la double flèche, le schéma de croissance des cellules SW 1 3 5 3 et d’une suspension cellulaire unique du sarcome conscient d’un patient est plus regroupé avec des îlots de cellules dans une étendue de gel de matrice extracellulaire. Comme indiqué par la flèche, en dépit de leur site de croissance ectopique, nous avons constaté que les caractéristiques essentielles et immunohistochimiques des tumeurs sarcomes d’origine étaient maintenues dans la caméra.

De plus, les greffons tumoraux se sont revascularisés, comme en témoigne l’apparition des érythrocytes de poulet nucléés bleu foncé comme indiqué par les pointes de flèches et trouvé dans les vaisseaux. Après ce jour, le nombre total de cellules reste stable sept jours après l’inoculation, le nombre de cellules positives au KI 67 et le nombre total de cellules commencent à diminuer. Une plus grande proportion de cellules positives au KI 67 est observée près de la came et une plus grande proportion de cellules négatives au KI 67 à la surface de la plaque est observée.

Une fois maîtrisé, la technique cam SA peut être utilisée pour analyser 50 x en 14 heures réparties sur trois jours si elle est effectuée correctement. Des colorations et une évaluation supplémentaires peuvent être effectuées et nécessitent trois heures par 10 conditions Suite à cette procédure. Des méthodes supplémentaires telles que l’imagerie du mode de vie peuvent être effectuées afin de résoudre des problèmes supplémentaires tels que l’extravasation ou l’identification de cellules cancéreuses marquées par la grippe.

Ainsi, par le développement de cette nouvelle technique, elle permet aux chercheurs dans le domaine des essais précliniques d’explorer de nouveaux facteurs pronostiques et thérapeutiques chez les patients atteints de sarcome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer du matériel tumoral dans le CMAA et comment traduire vos observations microscopiques et microscopiques vers une meilleure compréhension des interactions entre l’hôte de la tumeur.