Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le potentiel myogénique des progéniteurs musculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire aiguë et chronique. Pour ce faire, il faut d’abord évaluer le potentiel myogénique des cellules in vitro. La deuxième étape consiste à transplanter les cellules par injection intramusculaire.

Alternativement, des cellules sont injectées dans l’artère fémorale par une procédure microchirurgicale. La dernière étape consiste à évaluer l’amélioration fonctionnelle du phénotype dystrophique des animaux traités. En fin de compte, des tests d’immunofluorescence et d’histologie sont utilisés pour montrer la greffe et la contribution fonctionnelle des cellules donneuses aux muscles de l’hôte.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération des muscles squelettiques, telles que l’étude des approches de thérapie cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des dystrophies musculaires, car elle pourrait ouvrir la voie à des stratégies de thérapie cellulaire autologue utilisant des cellules IPS, progéniteurs DER. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des thérapies à base de cellules souches, elle peut être appliquée à d’autres systèmes tels que l’administration de molécules, par voie intramusculaire ou intra-artificielle, et l’analyse ultérieure de l’effet sur la fonction et la morphologie musculaires.

Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que la culture IPSL pouvait fournir une méthode pour surmonter certaines des limites des cellules souches adultes, telles que la disponibilité des biopsies tissulaires et leur potentiel d’expansion. Commencez par générer une lignée cellulaire stable d’éléments qui sont transduits avec un vecteur inductible au tamoxifène qui surexprime le régulateur de myogenèse myo D. Après enrobage avec 1 % de gel matri et lavage avec des graines moyennes, une plaque avec les cellules transduites et incuber à 37 degrés Celsius dans un milieu de croissance. Les cellules devraient atteindre la confluence dans un ou deux jours.

Lorsqu’ils sont prêts, ajoutez une micromolaire pour l’hydroxy tamoxifène dans le milieu de croissance. Après 24 heures, remplacez le milieu de croissance par différenciation. Milieu complété par une micromolaire pour l’hydroxy tamoxifène.

Examinez quotidiennement les cultures pour détecter la formation de myotubes et remplacez la moitié du milieu par une différenciation fraîche. Medium tous les deux jours lorsque les cultures sont prêtes. Ils sont utilisés dans les tests de transplantation.

Ici, des souris dystrophiques et immunodéficientes sont utilisées pour déterminer l’étendue de la greffe pour la transplantation intramusculaire. Prétraiter les animaux avec une injection de tamoxifène 24 heures avant la transplantation. Les cellules doivent également être prétraitées avec du tamoxifène ajouté au milieu de croissance la veille.

Le jour de la transplantation, détachées par la trypsine, le comptage et la centrifugation, les cellules lavent les cellules une fois dans le PBS avant Resus, en les suspendant dans du PBS exempt de calcium et de magnésium à une concentration de six cellules par 30 microlitres. Après avoir anesthésié l’animal et assaini la peau, localisez le muscle tibial antérieur. Identifiez le point d’insertion du tendon proximal et insérez l’aiguille.

Inclinez deux millimètres en dessous de ce point. Insérez cinq millimètres de l’aiguille à une inclinaison de 15 degrés par rapport au tibia et injectez lentement la suspension cellulaire tout en rétractant l’aiguille. Videz la seringue avec deux millimètres de l’aiguille toujours à l’intérieur du muscle.

Faites attention lorsque vous retirez l’aiguille du muscle afin d’éviter de renverser la suspension cellulaire à travers la piste de l’aiguille. À la suite de ces mêmes procédures, des injections de gastro-anémie sont effectuées à deux millimètres au-dessus de la jonction myo-tendine du tendon d’Achille et du quadriceps. Les injections féminines sont effectuées à deux millimètres au-dessus du tendon distal pour la transplantation intra artérielle.

Prétraiter les animaux et les cellules avec du tamoxifène comme démontré précédemment. Lorsqu’elles sont prêtes pour la transplantation, les cellules sont préparées comme démontré précédemment, sauf qu’elles sont filtrées avant la centrifugation. Suspendez à nouveau la pastille dans du PBS sans calcium ni magnésium et ajoutez 10 % de colorant bleu breveté pour permettre la visualisation de la distribution de la suspension cellulaire.

Remettez soigneusement les cellules en suspension dans la seringue et retirez toutes les bulles d’air avant l’injection, après anesthésie, rasez et désinfectez la zone comme indiqué, faites une incision de cinq à sept millimètres et localisez le faisceau fémoral. Retirez délicatement le fascia conjonctif qui recouvre le faisceau à l’aide d’une pince. Ensuite, séparez soigneusement la veine et le nerf fémoral de l’artère en introduisant doucement la pointe d’une pince entre eux et en élargissant progressivement le trou.

La veine fémorale est fragile. Veillez à ne pas le pincer lors de son détachement de l’artère fémorale. Une fois séparés, soulevez l’artère avec l’une des pointes de la pince et clampez l’artère avec l’autre extrémité.

À l’aide d’une aiguille de 30 G, perforez l’artère et injectez 50 microlitres de suspension cellulaire en aval de la zone clampée à une vitesse d’infusion d’environ cinq microlitres par seconde. Retirez lentement l’aiguille et la pince de l’artère pour rétablir le flux sanguin vers le membre. Appliquez une pression avec de la gaze stérile pour éviter les saignements et/ou cautérisez au besoin.

Le colorant bleu breveté permet la reconnaissance immédiate d’une injection correctement placée, s’il est correctement injecté, l’ensemble du membre deviendra rapidement bleu clair, suturera la plaie et surveillera les animaux jusqu’à ce qu’ils se rétablissent. Administrez l’analgésie pendant trois jours et inspectez la plaie Les changements quotidiens de la capacité motrice des souris traitées sont évalués par le test sur tapis roulant. Les mesures de base commencent environ un mois avant le traitement et sont utilisées pour évaluer l’amélioration de chaque animal testé.

La première étape consiste à acclimater les animaux à l’exercice avant de tester. Pour ce faire, réglez le tapis de course à une vitesse de six mètres par minute pendant 10 minutes. Répétez cette procédure tous les deux jours pendant une semaine.

Une fois qu’ils se sont familiarisés avec l’appareil, réglez l’inclinaison à 10 degrés et placez les animaux dans les allées du tapis roulant. Allumez le tapis de course à une vitesse de démarrage de six mètres par minute. Poussez doucement tout animal qui ne veut pas commencer l’exercice.

Ensuite, démarrez le chronomètre et augmentez la vitesse de deux mètres par minute toutes les deux minutes dès qu’un animal se couche dans la zone de repos pendant plus de cinq secondes. Sans tenter de réengager le tapis de course, touchez-le doucement avec un bâton pour stimuler le redémarrage de l’exercice. Une souris est considérée comme fatiguée lorsqu’elle reste allongée dans la zone de repos pendant plus de cinq secondes sans tenter de réengager le tapis roulant.

Après une série de trois stimuli mécaniques consécutifs, un toutes les cinq secondes, enregistrez les performances de chaque animal et répétez les mesures chaque semaine ou tous les 10 jours pendant au moins trois fois. À partir de deux semaines après la greffe de cellules. Répétez la même procédure chez les souris traitées après le test.

Utilisez des comparaisons avec la ligne de base pour évaluer les changements de performance. 48 heures après l’administration de quatre hydroxytamoxifènes, des noyaux myo de positifs sont identifiables dans les éléments transdits par myo DER en culture. Comme on le voit ici.

Au bout d’une semaine, les cellules fusionnent et se différencient en myotubes multinucléés. Lorsqu’ils sont transplantés par voie intramusculaire dans un modèle miroir de lésion musculaire aiguë, les éléments contribuent aux résultats de régénération tissulaire du tapis roulant. Le test de tolérance à l’effort montre une amélioration de la capacité motrice des souris traitées après la transplantation.

Des analyses ex vivo de muscles transplantés montrent que les zones positives à la GFP représentent l’étendue de la colonisation de l’IMS dans le tissu hôte, démontrant ainsi que les cellules donneuses se greffent dans le muscle dystrophique. Il est important de noter que les cellules transplantées sont capables de se différencier in vivo, formant de nouvelles myofibres squelettiques. Cet exemple montre l’expression des alphas Sarco glycanes à partir d’ims génétiquement corrigés dans des souris alphas Sarco glycane zéro skid beige.

La coloration au trichrome de Massen a révélé une diminution de la quantité de tissu fibreux dans le muscle traité. Suite à cette procédure avec des méthodes telles que le test FreeWheel, le dosage Evan Blue Diop et la mécanique des fibres uniques ou du muscle entier peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires sur l’amélioration de la capacité motrice volontaire, de la fragilité des fibres et de la force spécifique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la capacité de différenciation musculaire et le potentiel de greffeur et l’efficacité fonctionnelle des progéniteurs myogéniques dérivés de cellules IPS à l’aide d’essais in vitro, in vivo et ex vivo.