Name: Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de Arabidopsis thaliana Cultures Suspension cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez le fractionnement membranaire et le marquage métabolique pour l'analyse protéomique comparative d'Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet d'étudier les processus de signalisation cellulaire chez les plantes.

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<ol><li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport%2C+signal+transduction+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li>
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<li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li>
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<li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondetergent+isolation+of+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li>
<li>Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li>
<li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li>
<li>Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).</li>
<li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li>
<li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li>
<li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li>
<li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. L&#39;auteur, Witold Szymanski, est un employé de l&#39;Institut Max Planck de physiologie moléculaire des plantes. L&#39;auteur, Waltraud Schulze est un employé de l&#39;Université de Hohenheim, en Allemagne.

Le protocole présenté dans ce document comporte de nombreuses étapes et chacun d&#39;eux est crucial pour obtenir un fractionnement pur et représentatif de la membrane plasmique de la plante dans les membranes résistantes des détergents et des fractions solubles dans des détergents. Par conséquent, il est important de suivre chaque étape les instructions. Le traitement de la fraction de membrane plasmatique avec un détergent non-ionique (étape 3.2) a la plus forte influence sur la qualité de...

En 1972, Jonathan Singer et Garth Nicolson proposé le modèle de la mosaïque fluide un modèle de la structure des membranes cellulaires, en remplaçant le modèle sandwich protéine-lipide-protéine qui a été généralement acceptée dans les années 1960. Singer et Nicolson ont postulé que la membrane biologique peut être considérée comme un liquide à deux dimensions où toutes les molécules de lipides et de protéines diffusent librement et facilement 5. Depuis ce temps, le modèle de la structure de la membrane plasmique et la connaissance de la composition de la membrane devient encore plus complexe. En particulier, au sein de la membrane plasmique, tels que des structures complexes de protéines et de troubles à base structurellement microdomaines lipidiques / stérol peuvent être observées. Dans les membranes des modèles artificiels 6,7, stérols et sphingolipides peuvent latéralement séparer des autres espèces lipidiques pour former des régions avec des caractéristiques physiques altérées. Cette ségrégation au sein de la membrane cellulaire est principalement causée par les propriétés d&#39;auto-associer entre stérols et hautement sachaînes hydrocarbonées turés de phopsho-et sphingolipides 8. En particulier, les anneaux de stérol rigides favorisent les interactions avec les espèces plus rigide et rectiligne de lipides saturés et forcent ces interactions des chaînes hydrocarbonées voisins dans plusieurs conformations étendues, ce qui augmente l&#39;épaisseur de la membrane et de la dureté. L&#39;une des fonctions les plus couramment observées de stérol enrichi microdomaines membranaires est leur insolubilité lors d&#39;un traitement avec des détergents non ioniques tels un Triton X-100 ou le Brij 35. Ces fractions ont été pensés pour être identique à microdomaines membranaires et ont été appelés membranes résistantes aux détergents (DRM) en fonction de leur méthode de préparation biochimique 2. L&#39;utilisation de détergents non ioniques lors de l&#39;extraction de DRM a reçu quelques critiques comme la préparation de DRM biochimique peut ne pas correspondre directement à un compartiment membranaire spécifique au sein de la cellule vivante 9. En particulier, le détergent à taux de protéine semble crucial dans ces préparations, unes des détergents différents, ainsi que différentes quantités de détergents peuvent produire une composition différente du détergent résistant fraction de membrane 10. Cependant, il est évident que certaines espèces de protéines s&#39;associent spécifiquement avec ces domaines membranaires riches en stérols cellulaires, et que ces protéines sont bien enrichies en préparations biochimiques des fractions de membrane résistant aux détergents 11. Le noyau de protéines qui ont été trouvés dans la fraction de DRM de l&#39;usine, et pour qui la présence dans les DRM était stérol charge, étaient en particulier des protéines GPI, telles que les protéines de fascicline comme arabinogalactanes (SADF) et des membres de la famille des protéines SKU. En outre, certaines protéines de signalisation, telles que les kinases ou phospholipases récepteurs ont été récupérées 11. Ces résultats sont compatibles avec de nombreuses études protéomiques sur microdomaines membranaires de mammifères 12,13. Également dans les plantes il est de plus en évidence le rôle des microdomaines membranaires dans le contexte de la réponse au stress 14 -16. Le protocole décrit ici fournit une méthode robuste pour le fractionnement de plasma microdomaines membranaires et en particulier utilise une protéine de concentration de détergent qui nous permet de représenter le stress induit des altérations de la riche en stérols compartiment membranaire 4,11,14.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </td></tr><tr><td>Les produits chimiques ont été commandés à Sigma-Aldrich, sauf indication contraire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniac (solution mère à 25 %)</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 10 &mu ; m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>Empore Disk C18</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol(PEG 3350)</td><td>Sigma</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Roth</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC)</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K15NO3</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Optima L-80 XP Ultracentrifugeuse </td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II nano-chromatographe</td><td>liquide Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse LTQ-Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5417R</td><td>Thermomixeur Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative analyse protéomique de<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; cultures suspension cellulaires

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma microdomaines membranaires sont des caractéristiques basées sur les propriétés physiques de l&#39;environnement des lipides et des stérols et ont des rôles particuliers dans les processus de signalisation. Extraction microdomaines enrichis en stérols à partir de cellules végétales pour l&#39;analyse protéomique est une tâche difficile principalement en raison de multiples étapes de préparation et sources de contaminations d&#39;autres compartiments cellulaires. La membrane plasmique constitue seulement environ 5 à 20% de l&#39;ensemble des membranes dans une cellule végétale, et par conséquent, l&#39;isolement de la fraction de membrane plasmatique hautement purifié est difficile. Une méthode fréquemment utilisée consiste partitionnement aqueuse à deux phases dans le polyéthylène glycol et le dextrane, qui produit des vésicules de membrane de plasma avec une pureté de 95% 1. Microdomaines membranaires riches en stérols au sein de la membrane plasmique sont insolubles lors d&#39;un traitement avec des détergents non ioniques à froid à un pH alcalin. Cette fraction de membrane résistant aux détergents peut être séparée de la membrane plasmique en vrac par ultracentrifugation en tant quegradient ucrose 2. Par la suite, les protéines peuvent être extraites de la bande de basse densité du gradient de saccharose par un mélange méthanol / chloroforme précipitation. Protéine extraite est ensuite digéré la trypsine, dessalée et enfin analysé par LC-MS/MS. Notre protocole d&#39;extraction de microdomaines riches en stérols est optimisée pour la préparation de fractions membranaires de nettoyage détergentes résistant à partir de cultures de cellules d&#39;Arabidopsis thaliana. Nous utilisons marquage métabolique complète des cultures de cellules en suspension d&#39;Arabidopsis thaliana avec K 15 NO 3 en tant que seule source d&#39;azote pour les études protéomiques comparatives quantitatives suivantes de traitement biologique d&#39;intérêt 3. Par les rapports de mélange égaux de cultures de cellules marquées et non marquées pour l&#39;extraction des protéines de l&#39;influence conjointe d&#39;étapes de préparation de résultat quantitatif finale est maintenue à un minimum. De plus la perte de matière lors de l&#39;extraction affecte à la fois le contrôle et le traitement des échantillons de la même manière, und donc le rapport de la lumière et le pilonnement peptide restera constante. Dans la méthode proposée soit marqué ou non marqué culture de cellules est soumis à un traitement biologique, tandis que l&#39;autre sert de contrôle 4.

Avec le protocole présenté à l&#39;aide de cultures de cellules d&#39;Arabidopsis métaboliquement marquées, il est possible d&#39;isoler des membranes plasmatiques à partir de tissus végétaux (étape 2, les figures 2 et 4), et un enrichissement en résistant aux détergents des fractions de membrane à l&#39;intérieur de la membrane plasmique (étape 3, les figures 3 et 5). Par la suite, le protocole permet l&#39;extraction de protéines à partir de ces détergents résistant fractions...

Ici, nous décrivons une méthode robuste pour le fractionnement des membranes plasmiques de plantes en détergents solubles dans les membranes résistantes et de détergent à base d&#39;un mélange de non marqué et in vivo entièrement 15 N étiquetés cultures de cellules d&#39;Arabidopsis thaliana. La procédure est appliquée pour des études comparatives de la protéomique pour comprendre les processus de signalisation.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de séparer différentes sous-compartiments membranaires et d'étudier leur composition protéique différentielle. Cela est réalisé par le marquage isotopique stable de cellules dans différentes conditions, permettant ainsi de distinguer les traitements. Lors de l'analyse en spectrométrie de masse, qui constitue la deuxième étape, les matériaux cellulaires provenant des deux traitements sont mélangés, ce qui assure un traitement conjoint et réduit la variabilité d'échantillon à échantillon.Les sous-compartiments suivants de la membrane plasmique sont purifiés et séparés, par centrifugation sur gradient de saccharose, en sous-compartiments stériles riches et en sous-compartiments appauvris stériles. Les résultats de la centrifugation sur gradient montrent des abondances protéiques différentielles dans les sous-compartiments selon différents traitements, sur la base de données issues de spectrométrie de masse quantitative. L'avantage principal de ce protocole par rapport aux méthodes existantes, telles que le Western blot, réside dans la possibilité d'enregistrer quantitativement la distribution de milliers de protéines au sein des sous-compartiments, permettant ainsi de découvrir de nouveaux candidats impliqués dans les processus de signalisation.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la purification par extraction en deux phases est difficile à maîtriser. La raison en est qu'elle implique de nombreuses étapes, et un contrôle précis ainsi qu'une manipulation rigoureuse sont très importants. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation, en identifiant de nouveaux candidats protéiques régulateurs des processus membranaires. Commencez par faire croître des cultures en suspension de cellules d'arabidopsis marquées et non marquées, comme décrit dans le protocole écrit.Homogénéisez les cellules provenant d'environ un litre de cultures en suspension âgées de sept jours dans de l'azote liquide ; mélangez des quantités égales de cultures cellulaires congelées marquées et non marquées, en fonction du poids frais, dans un bécher, puis ajoutez deux volumes de tampon H. Placez immédiatement le bécher sur un agitateur et agitez jusqu'à ce que le matériau soit complètement fondu et dépourvu de glace. Filtrez l'homogénéat à travers une couche de tissu mirroir dans des tubes de centrifugation de 250 millilitres. Après équilibrage des échantillons avec le tampon H, centrifugez à 10 000 g pendant huit minutes. Après la centrifugation, chargez le surnageant dans des tubes de centrifugation ultracentrifuge prérefroidis d'un volume d'environ 32 millilitres.Après équilibrage des échantillons avec le tampon h, faire tomber en sédimentation les microsomes par centrifugation à 100 000 G et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant, qui contient les protéines solubles. Une petite quantité de cette fraction peut être conservée pour une précipitation ultérieure des protéines et une analyse subséquente des protéines solubles. Remettre en suspension le culot membranaire de chaque échantillon dans la quantité respective de tampon R, comme décrit dans le protocole écrit, puis charger sur le dessus du système biphasique U un deux.Si l'on utilise le système biphasique de six grammes, charger exactement deux grammes de culot membranaire resuspendu et charger sur U2 le même volume de tampon R pur que celui utilisé pour la suspension d'échantillon. Mélanger lentement les tubes U1 et U2 en les retournant 30 fois à raison d'environ un retournement par seconde, puis centrifuger les échantillons à 1500 G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, prélever la phase supérieure de U2. Transférer la phase supérieure de U1 sur U2, puis répéter la centrifugation en utilisant les mêmes paramètres. Ensuite, transférer la phase supérieure de U2 dans des tubes d'ultracentrifugation, diluer avec cinq volumes de tampon R et mélanger soigneusement. Centrifuger les échantillons à 200 000 G et à quatre degrés Celsius pendant une heure.Enfin, réutilisation. Suspendre le culot de membrane dans une petite quantité de tampon T et E pour l'isolement des membranes résistantes aux détergents. Après avoir vérifié la concentration de la fraction de membrane plasmique par dosage de Bradford, ajouter du Triton X-100 à la fraction de membrane plasmique selon un rapport détergent sur protéine, poids sur poids, compris entre 13 et 15, et une concentration finale en détergent comprise entre 0,5 et 1 %. Agiter les échantillons à environ 100 tr/min et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, ajouter trois volumes de saccharose à 2,4 M à un volume de la membrane plasmique traitée pour obtenir une concentration finale de saccharose de 1,8 M. Préparer le gradient de saccharose dans des tubes d'ultracentrifugation en superposant les solutions de saccharose respectives sur la fraction à 1,8 M. Centrifuger les échantillons à 250 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 18 heures. Retirer soigneusement les tubes d'ultracentrifugation du rotor afin d'éviter toute perturbation de la bande de faible densité, qui peut être visible sous forme d'un anneau laiteux à l'interface entre le saccharose à 0,15 M et celui à 1,4 M.Parfois, rien ne peut être vu, mais la fraction protéique résistante aux détergents est toujours présente. Prélevez une fraction de 0,75 millilitre de volume à partir du sommet du gradient, des fractions deux et trois, qui couvrent les volumes d'environ 1,5 millilitre au-dessus de l'anneau d'interphase, et de 0,5 millilitre en dessous de l'anneau d'interphase.Représentez la fraction membranaire résistante au détergent. Recueillez ces fractions dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Les fractions neuf et dix contiennent la fraction membranaire soluble dans le détergent et peuvent également être recueillies à des fins de comparaison.Pour commencer l'extraction des protéines à partir de la fraction résistante aux détergents, ajoutez quatre volumes de méthanol aux fractions recueillies et mélangez soigneusement par vortex. Ajoutez ensuite un volume de chloroforme avant de mélanger à nouveau soigneusement par vortex. Enfin, ajoutez trois volumes d'eau, mélangez soigneusement par vortex, puis centrifugez les échantillons à 2000 Gs pendant cinq minutes.À l’aide d’une centrifugeuse de banc, éliminer la phase aqueuse située au-dessus de la couche protéique dans l’interphase. Ensuite, ajouter trois volumes de méthanol et vortexer. Retirer complètement le surnageant S avant de prélever le culot afin de préparer la digestion en solution.Commencez la digestion en solution en dissolvant l'échantillon dans un petit volume d'urée six molaire, thioglycolate deux molaire, pH huit, abrégé UTU. Utilisez le volume le plus faible possible, compatible avec l'échantillon. Après avoir centrifugé les échantillons et effectué la digestion comme décrit dans le protocole, diluez l'échantillon avec quatre volumes de Tris HCl 10 millimolaire, pH huit.Ensuite, ajoutez un microlitre de trypsine par 50 microgrammes de protéine d'échantillon et incubez toute la nuit à température ambiante avec agitation constante à 700 tr/min ; centrifugez les échantillons à 4 000 ×g pendant 10 minutes. Enfin, acidifiez les échantillons jusqu'à une concentration finale de 0,2 % d'acide trifluoroacétique (TFA) pour atteindre un pH de deux, en ajoutant environ un dixième du volume d'acide trifluoroacétique à 2 %. Pour fabriquer des embouts C18 à étage, placez un disque C18 Empore™ sur une surface plane et propre, telle qu'une boîte de Pétri plastique jetable.Prélève un petit disque à l’aide d’une aiguille hypodermique à extrémité émoussée d’un diamètre de 1,5 millimètre. Le disque adhère à l’aiguille et peut être transféré dans une pointe de pipette. Expulse le disque de l’aiguille et fixe-le dans le rétrécissement de la pointe de pipette à l’aide d’un morceau de silice fondue ou d’un tube s’adaptant à l’intérieur de l’aiguille. Conditionne une pointe de colonne C 18 en appliquant 50 microlitres de solution B sur la pointe de colonne préparée.Faites tourner la pointe dans la centrifugeuse à 2000 tr/min pendant deux minutes. Dans une centrifugeuse de table, équilibrez la pointe de la colonne en utilisant 100 microlitres de solution a. Faites tourner la pointe à 5 000 g dans une centrifugeuse de table. Répétez l'équilibration et la centrifugation.Chargez l'échantillon sur le disque en pipetant soigneusement l'échantillon dans la pointe de pipette contenant le disque. Faites tourner les pointes dans la centrifugeuse jusqu'à ce que tout le volume d'échantillon traverse le disque C 18. Lavez les pointes en deux étapes avec 100 microlitres de solution A. Après centrifugation des pointes, récupérez l'EIT dans un tube réaction de 1,5 millilitre propre contenant 40 microlitres de solution B, puis centrifugez.Concentrez à nouveau l'échantillon dans le vide accéléré dans des conditions idéales. Arrêtez le processus de déshydratation lorsqu'il reste environ un ou deux microlitres de liquide. Enfin, ajoutez un volume final de neuf microlitres de solution de resuspension Resus à l'échantillon, puis transférez-le dans la plaque de microtitration pour l'analyse en spectrométrie de masse.On peut démontrer l'enrichissement des protéines de la membrane plasmique par analyse protéomique de faibles volumes d'éluats de membrane plasmique, de fractions et de protéines présents dans la phase inférieure du système biphasique. La phase inférieure contient les membranes internes de la cellule. Par exemple, des protéines de membrane plasmique généralement connues, telles que les protéines kinases réceptrices, montrent une forte abondance dans la fraction de membrane plasmique et une faible abondance dans la fraction de la phase inférieure contenant les membranes internes.À leur tour, les protéines connues du réticulum endoplasmique présentent une forte abondance dans la fraction de membrane interne et n'ont pas été observées dans la fraction de membrane plasmique. L'enrichissement ultérieur des fractions membranaires résistantes aux détergents conduira, dans les cas idéaux, à la formation d'un anneau laiteux de vésicules membranaires de faible densité. À environ un cinquième de la hauteur du tube, la plus forte abondance de la protéine remn a été trouvée dans les fractions membranaires résistantes aux détergents ou fractions DRM, comme prévu.En revanche, les protéines qui ne sont pas présentes dans la membrane, comme les microdomaines contenant un transporteur ABC, ne présentent pas une abondance accrue dans la fraction DRM. De même, les contaminants typiques tels qu'une protéine mitochondriale du complexe ATPase F₀ et une protéine ribosomale du ribosome 60S n'affichent pas d'abondance enrichie dans la fraction DRM. Bien que des quantités minimales puissent encore être identifiées après analyse par spectrométrie de masse, les rapports d'abondance protéique permettent de distinguer quantitativement l'état de phosphorylation des protéines de la membrane plasmique, ainsi que les fractions issues de cultures cellulaires marquées et non marquées.Les résultats typiques de la fenêtre de quantification MS quant doivent afficher un rapport d'intensité ionique un-à-un pour la plupart des peptides identifiés. Les peptides dont le rapport d'intensité ionique s'écarte significativement de un-à-un sont considérés comme étant régulés de façon différentielle entre les cultures cellulaires marquées et non marquées, et constituent des candidats pour être associés aux protéines affectées par le traitement appliqué. Un bon contrôle qualité d'un marquage métabolique réussi réside dans la coalescence des versions marquée et non marquée du peptide en un seul pic lors de la séparation par nano-HPLC, comme illustré ici.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, du début de l'extraction jusqu'au chargement de l'échantillon sur le spectromètre de masse. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme le Western blot, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la suppléance de protéines cibles spécifiques. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la manière de mélanger des cultures cellulaires végétales marquées par des isotopes stables, de réaliser une purification de membranes plasmiques par un système à deux phases, et de séparer les compartiments membranaires enrichis en stérols des compartiments appauvris en stérols.

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