Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de

L'objectif général de l'expérience suivante est de séparer différentes sous-compartiments membranaires et d'étudier leur composition protéique différentielle. Cela est réalisé par le marquage isotopique stable de cellules dans différentes conditions, permettant ainsi de distinguer les traitements. Lors de l'analyse en spectrométrie de masse, qui constitue la deuxième étape, les matériaux cellulaires provenant des deux traitements sont mélangés, ce qui assure un traitement conjoint et réduit la variabilité d'échantillon à échantillon.

Les sous-compartiments suivants de la membrane plasmique sont purifiés et séparés, par centrifugation sur gradient de saccharose, en sous-compartiments stériles riches et en sous-compartiments appauvris stériles. Les résultats de la centrifugation sur gradient montrent des abondances protéiques différentielles dans les sous-compartiments selon différents traitements, sur la base de données issues de spectrométrie de masse quantitative. L'avantage principal de ce protocole par rapport aux méthodes existantes, telles que le Western blot, réside dans la possibilité d'enregistrer quantitativement la distribution de milliers de protéines au sein des sous-compartiments, permettant ainsi de découvrir de nouveaux candidats impliqués dans les processus de signalisation.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la purification par extraction en deux phases est difficile à maîtriser. La raison en est qu'elle implique de nombreuses étapes, et un contrôle précis ainsi qu'une manipulation rigoureuse sont très importants. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation, en identifiant de nouveaux candidats protéiques régulateurs des processus membranaires. Commencez par faire croître des cultures en suspension de cellules d'arabidopsis marquées et non marquées, comme décrit dans le protocole écrit.

Homogénéisez les cellules provenant d'environ un litre de cultures en suspension âgées de sept jours dans de l'azote liquide ; mélangez des quantités égales de cultures cellulaires congelées marquées et non marquées, en fonction du poids frais, dans un bécher, puis ajoutez deux volumes de tampon H. Placez immédiatement le bécher sur un agitateur et agitez jusqu'à ce que le matériau soit complètement fondu et dépourvu de glace. Filtrez l'homogénéat à travers une couche de tissu mirroir dans des tubes de centrifugation de 250 millilitres. Après équilibrage des échantillons avec le tampon H, centrifugez à 10 000 g pendant huit minutes. Après la centrifugation, chargez le surnageant dans des tubes de centrifugation ultracentrifuge prérefroidis d'un volume d'environ 32 millilitres.

Après équilibrage des échantillons avec le tampon h, faire tomber en sédimentation les microsomes par centrifugation à 100 000 G et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant, qui contient les protéines solubles. Une petite quantité de cette fraction peut être conservée pour une précipitation ultérieure des protéines et une analyse subséquente des protéines solubles. Remettre en suspension le culot membranaire de chaque échantillon dans la quantité respective de tampon R, comme décrit dans le protocole écrit, puis charger sur le dessus du système biphasique U un deux.

Si l'on utilise le système biphasique de six grammes, charger exactement deux grammes de culot membranaire resuspendu et charger sur U2 le même volume de tampon R pur que celui utilisé pour la suspension d'échantillon. Mélanger lentement les tubes U1 et U2 en les retournant 30 fois à raison d'environ un retournement par seconde, puis centrifuger les échantillons à 1500 G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, prélever la phase supérieure de U2. Transférer la phase supérieure de U1 sur U2, puis répéter la centrifugation en utilisant les mêmes paramètres. Ensuite, transférer la phase supérieure de U2 dans des tubes d'ultracentrifugation, diluer avec cinq volumes de tampon R et mélanger soigneusement. Centrifuger les échantillons à 200 000 G et à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Enfin, réutilisation. Suspendre le culot de membrane dans une petite quantité de tampon T et E pour l'isolement des membranes résistantes aux détergents. Après avoir vérifié la concentration de la fraction de membrane plasmique par dosage de Bradford, ajouter du Triton X-100 à la fraction de membrane plasmique selon un rapport détergent sur protéine, poids sur poids, compris entre 13 et 15, et une concentration finale en détergent comprise entre 0,5 et 1 %. Agiter les échantillons à environ 100 tr/min et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, ajouter trois volumes de saccharose à 2,4 M à un volume de la membrane plasmique traitée pour obtenir une concentration finale de saccharose de 1,8 M. Préparer le gradient de saccharose dans des tubes d'ultracentrifugation en superposant les solutions de saccharose respectives sur la fraction à 1,8 M. Centrifuger les échantillons à 250 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 18 heures. Retirer soigneusement les tubes d'ultracentrifugation du rotor afin d'éviter toute perturbation de la bande de faible densité, qui peut être visible sous forme d'un anneau laiteux à l'interface entre le saccharose à 0,15 M et celui à 1,4 M.

Parfois, rien ne peut être vu, mais la fraction protéique résistante aux détergents est toujours présente. Prélevez une fraction de 0,75 millilitre de volume à partir du sommet du gradient, des fractions deux et trois, qui couvrent les volumes d'environ 1,5 millilitre au-dessus de l'anneau d'interphase, et de 0,5 millilitre en dessous de l'anneau d'interphase.

Représentez la fraction membranaire résistante au détergent. Recueillez ces fractions dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Les fractions neuf et dix contiennent la fraction membranaire soluble dans le détergent et peuvent également être recueillies à des fins de comparaison.

Pour commencer l'extraction des protéines à partir de la fraction résistante aux détergents, ajoutez quatre volumes de méthanol aux fractions recueillies et mélangez soigneusement par vortex. Ajoutez ensuite un volume de chloroforme avant de mélanger à nouveau soigneusement par vortex. Enfin, ajoutez trois volumes d'eau, mélangez soigneusement par vortex, puis centrifugez les échantillons à 2000 Gs pendant cinq minutes.

À l’aide d’une centrifugeuse de banc, éliminer la phase aqueuse située au-dessus de la couche protéique dans l’interphase. Ensuite, ajouter trois volumes de méthanol et vortexer. Retirer complètement le surnageant S avant de prélever le culot afin de préparer la digestion en solution.

Commencez la digestion en solution en dissolvant l'échantillon dans un petit volume d'urée six molaire, thioglycolate deux molaire, pH huit, abrégé UTU. Utilisez le volume le plus faible possible, compatible avec l'échantillon. Après avoir centrifugé les échantillons et effectué la digestion comme décrit dans le protocole, diluez l'échantillon avec quatre volumes de Tris HCl 10 millimolaire, pH huit.

Ensuite, ajoutez un microlitre de trypsine par 50 microgrammes de protéine d'échantillon et incubez toute la nuit à température ambiante avec agitation constante à 700 tr/min ; centrifugez les échantillons à 4 000 ×g pendant 10 minutes. Enfin, acidifiez les échantillons jusqu'à une concentration finale de 0,2 % d'acide trifluoroacétique (TFA) pour atteindre un pH de deux, en ajoutant environ un dixième du volume d'acide trifluoroacétique à 2 %. Pour fabriquer des embouts C18 à étage, placez un disque C18 Empore™ sur une surface plane et propre, telle qu'une boîte de Pétri plastique jetable.

Prélève un petit disque à l’aide d’une aiguille hypodermique à extrémité émoussée d’un diamètre de 1,5 millimètre. Le disque adhère à l’aiguille et peut être transféré dans une pointe de pipette. Expulse le disque de l’aiguille et fixe-le dans le rétrécissement de la pointe de pipette à l’aide d’un morceau de silice fondue ou d’un tube s’adaptant à l’intérieur de l’aiguille. Conditionne une pointe de colonne C 18 en appliquant 50 microlitres de solution B sur la pointe de colonne préparée.

Faites tourner la pointe dans la centrifugeuse à 2000 tr/min pendant deux minutes. Dans une centrifugeuse de table, équilibrez la pointe de la colonne en utilisant 100 microlitres de solution a. Faites tourner la pointe à 5 000 g dans une centrifugeuse de table. Répétez l'équilibration et la centrifugation.

Chargez l'échantillon sur le disque en pipetant soigneusement l'échantillon dans la pointe de pipette contenant le disque. Faites tourner les pointes dans la centrifugeuse jusqu'à ce que tout le volume d'échantillon traverse le disque C 18. Lavez les pointes en deux étapes avec 100 microlitres de solution A. Après centrifugation des pointes, récupérez l'EIT dans un tube réaction de 1,5 millilitre propre contenant 40 microlitres de solution B, puis centrifugez.

Concentrez à nouveau l'échantillon dans le vide accéléré dans des conditions idéales. Arrêtez le processus de déshydratation lorsqu'il reste environ un ou deux microlitres de liquide. Enfin, ajoutez un volume final de neuf microlitres de solution de resuspension Resus à l'échantillon, puis transférez-le dans la plaque de microtitration pour l'analyse en spectrométrie de masse.

On peut démontrer l'enrichissement des protéines de la membrane plasmique par analyse protéomique de faibles volumes d'éluats de membrane plasmique, de fractions et de protéines présents dans la phase inférieure du système biphasique. La phase inférieure contient les membranes internes de la cellule. Par exemple, des protéines de membrane plasmique généralement connues, telles que les protéines kinases réceptrices, montrent une forte abondance dans la fraction de membrane plasmique et une faible abondance dans la fraction de la phase inférieure contenant les membranes internes.

À leur tour, les protéines connues du réticulum endoplasmique présentent une forte abondance dans la fraction de membrane interne et n'ont pas été observées dans la fraction de membrane plasmique. L'enrichissement ultérieur des fractions membranaires résistantes aux détergents conduira, dans les cas idéaux, à la formation d'un anneau laiteux de vésicules membranaires de faible densité. À environ un cinquième de la hauteur du tube, la plus forte abondance de la protéine remn a été trouvée dans les fractions membranaires résistantes aux détergents ou fractions DRM, comme prévu.

En revanche, les protéines qui ne sont pas présentes dans la membrane, comme les microdomaines contenant un transporteur ABC, ne présentent pas une abondance accrue dans la fraction DRM. De même, les contaminants typiques tels qu'une protéine mitochondriale du complexe ATPase F₀ et une protéine ribosomale du ribosome 60S n'affichent pas d'abondance enrichie dans la fraction DRM. Bien que des quantités minimales puissent encore être identifiées après analyse par spectrométrie de masse, les rapports d'abondance protéique permettent de distinguer quantitativement l'état de phosphorylation des protéines de la membrane plasmique, ainsi que les fractions issues de cultures cellulaires marquées et non marquées.

Les résultats typiques de la fenêtre de quantification MS quant doivent afficher un rapport d'intensité ionique un-à-un pour la plupart des peptides identifiés. Les peptides dont le rapport d'intensité ionique s'écarte significativement de un-à-un sont considérés comme étant régulés de façon différentielle entre les cultures cellulaires marquées et non marquées, et constituent des candidats pour être associés aux protéines affectées par le traitement appliqué. Un bon contrôle qualité d'un marquage métabolique réussi réside dans la coalescence des versions marquée et non marquée du peptide en un seul pic lors de la séparation par nano-HPLC, comme illustré ici.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, du début de l'extraction jusqu'au chargement de l'échantillon sur le spectromètre de masse. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme le Western blot, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la suppléance de protéines cibles spécifiques. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la manière de mélanger des cultures cellulaires végétales marquées par des isotopes stables, de réaliser une purification de membranes plasmiques par un système à deux phases, et de séparer les compartiments membranaires enrichis en stérols des compartiments appauvris en stérols.