Mesurer la croissance et Gene Expression Dynamique de tumeur ciblée S. Typhimurium Bacteria

L’objectif global de cette expérience est d’étudier la dynamique d’expression génique in vivo des bactéries S tyriens qui se développent à l’intérieur des tumeurs. Tout d’abord, dans un modèle de cancer par xénogreffe de souris, des bactéries sont injectées par voie intraveineuse par la veine de la queue. Les bactéries colonisent la tumeur et se développent de manière exponentielle tandis que l’expression des gènes est visualisée à l’aide de rapporteurs luminescents.

L’imagerie de la bioluminescence de l’animal entier est réalisée à l’aide du système d’imagerie spectrale IVUS. Sur une période de 24 à 48 heures, des images IVUS sont prises. Cette série d’images est corrélée avec le nombre de colonies généré par l’homogénéisation et le placage des tumeurs.

Ensemble, ces données nous permettent de mesurer quantitativement l’expression génique et la dynamique de population de bactéries ciblées sur les tumeurs in vivo en temps réel, de préparation cellulaire, de lignées cellulaires en utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules macroscopiques de huit cellules ocar à une tolérance cible de 80 à 100 % Récoltez et comptez les cellules sur un hémomètre, un cytomètre, un résus, une suspension et du DMEM sans rouge de phénol à une concentration cible de cinq fois 10 à sept cellules par millilitre, soit environ 200 microlitres par flacon. Ajoutez 15 % de facteur de croissance réduit matrigel et maintenez la suspension cellulaire sur la glace jusqu’à l’implantation de la tumeur.

Anes anesthésiés de souris nues femelles âgées de quatre semaines à l’aide de 3 % de fluor. Chargez les cellules de 100 microlitres par tumeur dans une seringue d’un moulin et fixez une aiguille de calibre 27 et demi pour chacun des deux sites d’injection bilatéraux du flanc postérieur. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une pince pour faire une tente et injectez des cellules à la base.

Veillez à ne pas pénétrer trop profondément en produisant du sang. À l’aide d’une pince à épiler, retirez délicatement la seringue sans éclaboussures. Surveillez la croissance tumorale quotidiennement pendant 10 à 20 jours jusqu’à ce qu’un diamètre tumoral de deux à quatre millimètres soit atteint.

Préparation des bactéries, commencez une culture nocturne de bactéries dans un milieu de trois mils LB plus des antibiotiques à partir d’un stock de congélation de moins 80 ou d’une assiette réfrigérée. Dans cette expérience, nous avons utilisé la souche ELH 4 30 le matin. Diluez la culture de un à 100 dans une livre filtrée et augmentez jusqu’à une DO 600 de 0,4 à 0,6.

Essorez et lavez trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate et remettez en suspension à une DO finale de 600 de 0,1 ou environ une fois 10 à sept cellules par mil. Injection de bactéries, anesthésie les animaux et positionne avec la queue pointant vers votre main dominante. Localisez la veine de la queue et dilatez-la à l’aide d’eau tiède ou d’une lampe chauffante.

Chargez les bactéries de 100 microlitres par souris dans une seringue d’un mil et pliez la puce à un peu moins de 90 degrés. Alignez l’extrémité de la seringue avec la veine de la queue, pénétrez à une faible profondeur sans ressentir de résistance et injectez des bactéries. Observez le déplacement du flux sanguin pour une injection réussie.

Attendez environ 12 à 18 heures avant l’imagerie pour que la colonisation se produise. L’imagerie de souris anesthésie les animaux dans la chambre d’induction. Placez ensuite chaque souris sur la plate-forme d’imagerie.

Maintenez un positionnement précis pour garantir des résultats quantitatifs entre les points temporels, imagez les animaux à l’aide du système d’imagerie Ibis Spectrum. Si vous imagez plus d’un animal, placez des barrières lumineuses entre eux pour éviter la dissection d’animaux à éclairage croisé, en tenant la tumeur avec une pince à épiler. Retirez la peau à l’aide d’un mouvement de ciseaux inversé.

Mouvement Lorsque la majorité de la peau a été séparée, retirez complètement la tumeur à l’aide d’une pince à épiler. Placez les organes et les microtubes à centrifuger pré-pesés. Étant donné que la masse de ces tubes peut varier considérablement, il est important de les pré-peser pour obtenir des résultats quantitatifs.

La quantification de la biodistribution bactérienne pour chaque point temporel excise et pèse les tumeurs ajoute 500 microlitres de PBS plus 15 % de glycérol et homogénéise à l’aide d’une déchirure tissulaire, génère une dilution en série et une plaque pour le comptage des colonies bactériennes des résultats représentatifs. En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de générer des données sur la croissance in vivo et la dynamique de l’expression génique des bactéries ciblées sur les tumeurs. Le flux de travail global est résumé ici.

Dans un premier temps, nous avons injecté des bactéries et imagé l’animal à l’aide d’ivus pour mesurer l’expression génique avec luminescence en tant que rapporteur. Ensuite, dans la deuxième étape, nous avons excisé, homogénéisé et plaqué les tumeurs pour le comptage des colonies afin de déterminer le nombre de bactéries se développant dans la tumeur. La bioluminescence générée par les souches bactériennes est visualisée à l’aide du signal ivus augmente avec la dose injectée avec une dose minimale de colonisation d’environ cinq fois 10 à cinq dans tous les cas en raison des atténuations.

Les bactéries ont soit spécifiquement colonisé les tumeurs, soit ne parviennent pas à se développer de manière significative chez la souris Le signal est quantifié à l’aide d’unités de radiance pour normaliser le temps d’exposition ou des valeurs typiques supérieures à 10 à six ou plus sont indicatives de la colonisation d’une infection donnée Le signal augmente avec le temps sur 24 à 48 heures. Le pic d’apparition se produit environ 36 heures après l’injection, mais le moment peut varier en fonction de la souche et du plasmide utilisés. Assurez-vous de positionner la souris exactement de la même manière à chaque fois pour garantir des résultats quantitatifs lors de la prochaine série d’expériences.

La biodistribution bactérienne est quantifiée pour mesurer la croissance des bactéries au fil du temps dans différents organes, les bactéries viables et les tumeurs sont quantifiées en excisant et en homogénéisant la tumeur et en plaquant sa dilution en série. D’autres organes peuvent être quantifiés. De même, ici, nous avons utilisé la rate car le rapport tumeur-rate est une mesure typique de la spécificité bactérienne après calcul inverse à l’aide du facteur de dilution.

Ces comptages nous permettent de mesurer la population bactérienne spécifique au fil du temps. Sur la gauche, on peut voir le nombre de bactéries croître régulièrement pendant toute la durée de l’expérience. Avec un temps de doublement entre une et trois heures, nettement inférieur à celui des expériences de culture par lots.

Cela est probablement dû aux mauvaises conditions nutritionnelles dans le microenvironnement tumoral. À droite, nous avons quantifié le rapport tumeur-rate et observé qu’il augmente tout au long de l’expérience. L’objectif de ces expériences est de surveiller quantitativement la dynamique de croissance et l’expression génique des environnements bactériens et tumoraux à l’aide de techniques d’imagerie IVUS et de comptage des colonies.

Nous avons montré que des populations de bactéries peuvent être caractérisées in vivo dans des environnements tumoraux. À l’avenir, des programmes d’expression génique plus complexes pourront être conçus et modifiés pour construire des systèmes d’administration thérapeutique sophistiqués chez les bactéries.