Mesurer la croissance et Gene Expression Dynamique de tumeur ciblée

L'objectif général de cette expérience est d'étudier la dynamique d'expression génique in vivo de bactéries S tyrian se développant à l'intérieur de tumeurs. Dans un premier temps, dans un modèle de cancer xénogreffe chez la souris, les bactéries sont injectées par voie intraveineuse dans la veine de la queue. Les bactéries colonisent la tumeur et se multiplient de façon exponentielle, tandis que l'expression génique est visualisée à l'aide de capteurs luminescents.

L'imagerie bioluminescente sur animal entier est réalisée à l'aide du système d'imagerie IVUS Spectrum. Une série temporelle d'images IVUS est acquise toutes les 24 à 48 heures. Cette série d'images est corrélée aux dénombrements de colonies obtenus par homogénéisation et ensemencement des tumeurs.

Ensemble, ces données nous permettent de mesurer quantitativement l'expression génique et la dynamique des populations de bactéries ciblant les tumeurs in vivo, en temps réel, lors de la préparation cellulaire, du passage et des lignées cellulaires, en utilisant des techniques standards de culture cellulaire. Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules OCaR8 jusqu'à une confluence cible de 80 à 100 %. Récolter et compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, resuspendre les cellules dans un DMEM sans phénol rouge à une concentration cible de cinq fois 10⁷ cellules par millilitre, soit environ 200 microlitres par flacon. Ajouter du Matrigel à 15 % à facteurs de croissance réduits et maintenir la suspension cellulaire sur glace jusqu'à l'implantation de la tumeur.

Anesthésiez des souris nues femelles de quatre semaines à l’aide de 3 % d’isoflurane. Chargez les cellules dans une seringue d’un millilitre à raison de 100 microlitres par tumeur, puis fixez une aiguille de calibre 27 et demi pour chacun des deux sites d’injection bilatéraux sur la hanche. Soulevez doucement la peau avec une pince pour former une tente et injectez les cellules à la base.

Veillez à ne pas pénétrer trop profondément afin d'éviter tout saignement. Utilisez une pince pour retirer doucement la seringue sans provoquer d'éclaboussures. Surveillez la croissance tumorale quotidiennement pendant 10 à 20 jours, jusqu'à ce qu'un diamètre tumoral de deux à quatre millimètres soit atteint.

Préparation des bactéries : amorcer une culture bactérienne en milieu LB liquide complété d'antibiotiques, en partant d'une souche congelée à −80 °C ou d'une boîte de Petri réfrigérée. Dans cette expérience, nous avons utilisé la souche *S. typhimurium* ELH430 du matin. Diluer la culture au 1/100 dans du milieu LB filtré et faire croître jusqu'à une DO600 comprise entre 0,4 et 0,6.

Centrifuger et laver trois fois dans du sérum physiologique tamponné au phosphate, puis resuspendre à une DO 600 finale de 0,1 ou environ 1 × 10⁷ cellules par mL. Injection de bactéries : anesthésier les animaux et les positionner de manière à ce que la queue soit orientée vers votre main dominante. Localiser la veine de la queue et la dilater à l’aide d’eau chaude ou d’une lampe chauffante.

Charger les bactéries, 100 microlitres par souris, dans une seringue de un millilitre et courber l'aiguille à un angle légèrement inférieur à 90 degrés. Aligner l'extrémité de la seringue avec la veine caudale, pénétrer en profondeur peu importante sans ressentir de résistance et injecter les bactéries. Observer le déplacement du flux sanguin pour confirmer une injection réussie.

Attendre environ 12 à 18 heures avant l'imagerie pour permettre la colonisation. Anesthésier les animaux dans la chambre d'induction pour l'imagerie chez la souris. Ensuite, placer chaque souris sur la plateforme d'imagerie.

Conserver un positionnement précis afin d'assurer des résultats quantitatifs entre les différents points temporels ; imager les animaux à l'aide du système d'imagerie Ibis Spectrum. Si plusieurs animaux sont imagés, placer des barrières lumineuses entre eux afin d'éviter l'illumination croisée lors de la dissection de l'animal, en tenant la tumeur avec une pince. Retirer la peau à l'aide d'un mouvement de ciseau inversé.

Mouvement Lorsque la majeure partie de la peau est complètement détachée, retirer la tumeur à l’aide de pinces. Placer les organes dans des tubes de microcentrifugation préalablement pesés. Étant donné que la masse de ces tubes peut varier considérablement, il est important de les peser au préalable pour obtenir des résultats quantitatifs.

Quantifier la distribution bactérienne par prélèvement des tumeurs et pesée pour chaque point temporel, ajouter 500 microlitres de PBS contenant 15 % de glycérol et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire, réaliser des dilutions sériées et ensemencer pour le comptage des colonies bactériennes, résultats représentatifs. À l’aide de ce protocole, nous sommes en mesure d’obtenir des données sur la croissance in vivo et les dynamiques d’expression génique de bactéries ciblant les tumeurs. Le flux opératoire global est résumé ici.

Dans la première étape, nous avons injecté des bactéries et observé l'animal à l'aide de l'ivis afin de mesurer l'expression génique par détection de la luminescence en tant que marqueur rapporteur. Ensuite, dans la deuxième étape, nous avons prélevé, homogénéisé et ensemencé les tumeurs pour effectuer un dénombrement des colonies, permettant ainsi de déterminer le nombre de bactéries en cours de multiplication au sein de la tumeur. La bioluminescence produite par les souches bactériennes est visualisée à l'aide du signal ivis, dont l'intensité augmente avec la dose injectée, avec une dose minimale de colonisation d'environ cinq fois 10 à la puissance cinq dans tous les cas, en raison d'atténuations.

Les bactéries colonisent soit spécifiquement les tumeurs, soit ne se développent pas de manière significative chez les souris ; le signal est quantifié à l'aide d'unités de luminance afin de normaliser le temps d'exposition. Des valeurs typiques supérieures à 10⁶ ou plus élevées indiquent une colonisation pour une infection donnée. Le signal augmente avec le temps, sur une période de 24 à 48 heures. L'apparition du pic se situe autour de 36 heures après l'injection ici, mais le moment peut varier selon la souche et le plasmide utilisés. Veillez à positionner la souris exactement de la même manière à chaque fois afin d'assurer des résultats quantitatifs dans la série suivante d'expériences.

La biodistribution bactérienne est quantifiée afin de mesurer la croissance des bactéries au fil du temps dans différents organes ; les bactéries viables et les tumeurs sont quantifiées par excision et homogénéisation de la tumeur, suivies de la mise en place de dilutions sérielles. D'autres organes peuvent également être quantifiés. De manière analogue, nous avons utilisé la rate ici, puisque le rapport tumeur-rate constitue une mesure typique de la spécificité bactérienne après recalcul à l'aide du facteur de dilution.

Ces dénombrements nous permettent de mesurer la population bactérienne spécifique au fil du temps. À gauche, on observe une augmentation régulière du nombre de bactéries tout au long de l'expérience. Avec un temps de doublement compris entre une et trois heures, nettement inférieur à celui observé dans les expériences en culture lot.

Cela est probablement dû aux conditions nutritionnelles précaires dans le microenvironnement tumoral. À droite, nous avons quantifié le rapport tumeur-rate et observé qu'il augmente tout au long de l'expérience. L'objectif de ces expériences est de surveiller quantitativement la dynamique de croissance et l'expression génique des bactéries et des microenvironnements tumoraux à l'aide de l'imagerie IVUS et de techniques de dénombrement de colonies.

Nous avons montré que les populations de bactéries peuvent être caractérisées in vivo dans des environnements tumoraux. À l'avenir, des programmes d'expression génique plus complexes pourront être conçus et ingénierés afin de créer des systèmes sophistiqués de délivrance thérapeutique chez les bactéries.I.