Name: Un humain Ex Vivo Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Découvrez un modèle ex vivo de plaques athéroscléreuses humaines pour étudier les processus inflammatoires cardiovasculaires. Cette méthode permet d'analyser les réponses aux cytokines et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Nous remercions Nadine Wambsganss pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) ER 682/2-1 et une allocation de recherche de la Société allemande de cardiologie à C. Erbel ainsi que d&#39;une allocation de recherche de l&#39;allemand académique service Heidelberg à L. Zhao.

1. Préparer moyen comme suit <ol><li> Milieu de culture: milieu RPMI. </li><li> Ajouter 10% de sérum de veau foetal (SVF). </li><li> Ajouter 100 U / ml de pénicilline G, et 100 g / ml de streptomycine. </li></ol> 2. Stockage du cylindre de plaque frais jusqu&#39;à utilisation <ol><li> L&#39;opération de la carotide endartériectomie des patients avec ou sans symptômes ischémiques (AVC, accident ischémique transitoire) avec une sténose de l&#39;artère carotide importante sera faite par les chirurgiens vasculaires et l&#39;endartériectomie de l&#39;artère coronaire au cours de pontage aortocoronarien par les chirurgiens cardiaques. Carotides / plaques coronaires doivent être retirés en bloc de préserver la structure de la plaque comme décrit précédemment 5. </li><li> Après plaque lieu de la disparition de l&#39;échantillon dans un tube de milieu rempli et le stocker sur la glace (plaque doit être entièrement recouverte de milieu) jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Traitement de la plaque <ol><li> Utiliser une boîte de culture cellulaire appropriée (par exemple 60 mm)et ajoutez 5 ml de milieu RPMI. </li><li> Placer le tissu de la plaque dans la boîte de culture (plaque doit être complètement recouverte par du milieu). </li><li> Maintenir le tissu de la plaque d&#39;attention au niveau des bords du tissu à l&#39;aide de pinces stériles. </li><li> Couper les bords de l&#39;échantillon de plaque en utilisant un scalpel stérile. </li><li> Diviser le tissu de la plaque en deux. </li><li> Évaluer la morphologie de la lésion macroscopique (calcifiée, riche en lipides, rompu, thrombus, fibrose). </li><li> Analyser la morphologie de la plaque exact après l&#39;expérience ex vivo par immunohistochimie. Utilisez la classification AHA 10. </li><li> Jeter plaques avec calcification grave ou de fibrose. </li><li> Couper le tissu de la plaque en petits morceaux homologues (3 x 3 x 3 mm). </li><li> Choc geler deux morceaux de plaque et de les stocker dans de l&#39;azote liquide pour les valeurs de base de la lésion jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer une plaque de 48 puits. </li><li> Ajouter 500 pi de milieu RPMI à chaque puits utilisé pour l&#39;expérience. </li><li> S&#39;il vous plaît utiliser unt moins deux morceaux de plaque pour chaque groupe. </li><li> Ajouter la substance d&#39;intérêt (par exemple, les cytokines et les chimiokines spécifiques). </li><li> Utiliser des éléments de plaque en tant que témoins non stimulées. </li><li> Hasard planter le nombre approprié de pièces de plaque dans les puits. </li><li> Culture des morceaux de plaque pour des points temporels indiqués. </li><li> Pour l&#39;expérience de stimulation tissulaire de la plaque avec le lipopolysaccharide (LPS) <ol><li> Utilisez les points de temps suivants: 3 h, 8 h et 24 h. </li><li> Utiliser deux morceaux de plaque pour les LPS et deux pour le groupe non stimulé pour chaque point de temps, respectivement. </li><li> Ajouter 1 pg / ml de lipopolysaccharide. </li></ol></li><li> Au cours de l&#39;incubation, de maintenir la plaque à 48 puits à 37 ° C dans de l&#39;air humidifié contenant 5% de CO 2. </li></ol> 4. Morceaux de tissu de la plaque de récolte de temps après indiquées <ol><li> Choc geler les morceaux de la plaque d&#39;isolement de l&#39;ARNm et la synthèse de l&#39;ADNc (pour des informations détaillées voir proto-section de col 5). </li><li> Recueillir le surnageant et stocké à -20 ° C pour analyse ELISA. </li><li> Pour un transfert de Western, smash et lyser les tissus de la plaque. Filtrer le lysat par une um 0,65 et 0,1 um dispositif de filtre centrifuge. </li><li> Incluez le tissu de la plaque dans les tissus-tec ou de la paraffine pour les colorations d&#39;immunohistochimie. </li></ol> 5. L&#39;extraction d&#39;ARN à partir de morceaux de plaque de culture <ol><li> Utilisez une TissueLyser pour l&#39;homogénéisation. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant le kit (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. </li><li> Déterminer la quantité et la qualité de l&#39;ARN des échantillons avec un spectrophotomètre. </li><li> Utilisez le kit Boehringer ADNc pour la transcription inverse selon les instructions du fabricant. </li><li> Pour la PCR quantitative, utiliser par exemple le kit de PCR en temps réel Roche avec SYBR Green. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas de conflits de divulguer.

Nous présentons ici un modèle ex vivo de la culture de la plaque d&#39;étudier l&#39;influence de substances potentiellement pertinentes sur l&#39;athérosclérose lésion biologie. Le principal avantage de cette méthode ex vivo est la capacité d&#39;évaluer l&#39;influence de substances indiquées sur les cellules inflammatoires et leur interaction cellulaire ainsi que les voies inflammatoires et des cascades dans les lésions athérosclérotiques humaines. Plusieurs méthodes utilisables (par exemple</em...

L&#39;athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique est l&#39;une des principales causes de décès dans les pays industrialisés 1-2. Les complications de l&#39;athérosclérose, le syndrome coronarien aigu en particulier, ont été liés à la rupture de lésions vulnérables, ce qui provoque l&#39;athérothrombose et l&#39;occlusion du vaisseau 3. L&#39;immunité innée et adaptative semblent être impliqués à toutes les étapes de l&#39;athérogenèse 2,4-5. Bien que des progrès importants ont été réalisés dans le traitement de l&#39;infarctus du myocarde, une prévention efficace de l&#39;athérosclérose et les événements cardiovasculaires indésirables sont encore en suspens. Ainsi, l&#39;étude de la biologie lésionnel est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de l&#39;athérosclérose et à permettre l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies. Dans de nombreux cas, des modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, l&#39;étude athérogenèse en utilisant des modèles de souris est accompanied par plusieurs limites: (1) Habituellement, les souris athérosclérotiques reçoivent une alimentation riche en cholestérol. Les niveaux de cholestérol dans ces modèles ne peuvent pas être comparés à ceux des patients ayant des taux sériques de cholestérol élevé 6. (2) Il existe des différences substantielles entre la souris et le système immunitaire humain; ainsi Foxp3 est un marqueur spécifique des cellules T régulatrices murins, alors que l&#39;expression de Foxp3 humain dans des cellules T humaines ne confère pas nécessairement un phénotype de régulation 7. En outre, le paradigme Th1/Th2 tel que défini dans l&#39;homme n&#39;est pas entièrement transférable à cellules T murines. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages murins tels que F4/80 et les marqueurs de classique (M1) vs alternatif (M2) modèles d&#39;activation n&#39;existe pas dans les cellules myéloïdes humaines 8. (4) L&#39;expression des gènes de monocytes de sang périphérique humains et murins a été trouvée pour être sensiblement différente 9. Ainsi, afin d&#39;accroître notre compréhension desprocessus inflammatoires chroniques de l&#39;athérosclérose humaine, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les tissus humains, de sang ou de cellules. Ici, nous décrivons un modèle de culture de tissus de la plaque humaine, qui permet d&#39;étudier de nouvelles substances potentiels dans le concept de biologie lésionnelle inflammatoire humaine.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture (60 mm)</td><td>Orange Scientific</td><td>5550200</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>Cellule plaques de culture 48 puits</td><td>Greiner</td><td>677102</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel - à usage unique</td><td>Feather</td><td>FEA200130011</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser</td><td>Precellys 24 Dual</td><td>Cat. Non. EQ03119.200.RD010.0</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy (Mini)&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>Cat. N° 74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’ADNc de Boehringer&nbsp ;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Cat. N° 11483188001</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop’nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un humain<em&gt; ex vivo</em&gt; plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

L&#39;athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique du système vasculaire. Il existe différentes méthodes pour étudier le composé inflammatoire dans les lésions d&#39;athérosclérose. Modèles de souris sont un outil important pour étudier les processus inflammatoires dans l&#39;athérogenèse, mais ces modèles souffrent des différences phénotypiques et fonctionnelles entre la souris et le système immunitaire humain. Expériences in vitro de cellules sont utilisées pour évaluer spécifiquement les changements de type dépendant cellulaires causés par une substance de intérêt, mais des variations dépendant de la culture et de l&#39;impossibilité d&#39;analyser l&#39;influence de molécules spécifiques dans le contexte du composé inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques de limiter l&#39;impact des résultats. En outre, la mesure des taux d&#39;une molécule d&#39;intérêt dans le sang humain permet d&#39;approfondir sa pertinence clinique, mais il s&#39;agit d&#39;une inflammation systémique et non local. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de culture de la plaque d&#39;athérome à étudier lésion biologie humaineex vivo. En bref, des plaques fraîches sont obtenus à partir de patients subissant une endartériectomie ou pontage coronarien greffage et stockés dans du milieu RPMI sur de la glace jusqu&#39;à utilisation. Les échantillons sont découpés en petits morceaux puis par distribution aléatoire dans une plaque à 48 puits, contenant du milieu RPMI en plus d&#39;une substance d&#39;intérêt tels que des cytokines ou des chimiokines, seuls ou en combinaison pour des périodes de temps définies. Après incubation, les morceaux de plaque peuvent être congelés pour un choc isolement d&#39;ARNm, inclus dans la paraffine ou des PTOM pour les colorations d&#39;immunohistochimie ou brisées et lysées pour western blot. En outre, les cellules peuvent être isolées à partir de la plaque pour l&#39;analyse de cytométrie en flux. En outre, les surnageants peuvent être collectées pour la mesure de la protéine par la technique ELISA. En conclusion, le modèle in vivo présentée ex ouvre la possibilité d&#39;étudier plus avant la biologie lésionnelle inflammatoire, qui peut conduire à l&#39;identification de mécanismes roman de la maladie et des cibles thérapeutiques.

Ici, nous présentons un certain nombre de chiffres qui démontrent les résultats de l&#39;ex vivo plaque culture. Pour évaluer les changements dans le milieu inflammatoire en réponse à l&#39;agent de l&#39;intérêt pour l&#39;ex vivo expérience de modèle, nous mesurons différentes molécules qui sont connus pour être principalement impliqués dans l&#39;athérogenèse. Comme cytokines pro-athérogènes représentatives nous choisissons TNFa, IL6 et IFNg 2,11. En outre, on utilise le facteur von Wille...

L&#39;athérosclérose est un processus inflammatoire chronique. Ce manuscrit illustre un outil facile à utiliser modèle ex vivo pour étudier carotide frais ou des plaques coronariennes. Le modèle in vivo ex permet à l&#39;enquête de substances potentiels sur le milieu inflammatoire dans les lésions athérosclérotiques humaines et les résultats peuvent être analysés par diverses méthodes.

Un humain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

L'objectif général de cette procédure est d'illustrer un modèle ex vivo facile à utiliser pour étudier des plaques artérielles fraîches, carotidiennes ou coronariennes. Cela est réalisé en obtenant des plaques fraîches provenant de patients subissant une endartériectomie ou un pontage coronarien. La deuxième étape consiste à découper l'échantillon en petits morceaux.Ensuite, les fragments de plaques sont distribués aléatoirement dans une plaque de 48 puits contenant du milieu RPMI. La dernière étape consiste à ajouter une substance d'intérêt, telle que des cytokines ou des chimiotactines, seules ou en combinaison, pendant des durées définies. Enfin, l'isolement de l'ARN, la QPCR, l'immunohistochimie et le EISA peuvent être utilisés pour analyser l'expérience de culture de plaques.La méthode présentée ici peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'inflammation vasculaire, telles que l'approfondissement de nos connaissances sur la physiopathologie de l'athérosclérose humaine. Les implications de cette technique s'étendent vers le diagnostic et le traitement des causes de l'athérosclérose. Il s'agit de la seule méthode permettant d'étudier le rôle de molécules d'i

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In vivo par fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) intravasculaire d&#39;imagerie moléculaire de la plaque inflammatoire, une approche multimodale d&#39;imagerie de l&#39;athérosclérose

Nous décrivons des procédures pour quantifier et caractériser les lésions athéroscléreuses dans des modèles murins en utilisant une section de précision du sinus aortique et de l’aorte ascendante combinée à une analyse histochimique et immunohistochimique.

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d&#39;athérosclérose dans le murin aortique Sinus

Les auteurs décrivent un protocole visant à induire l’athérosclérose à la racine aortique de l’ApoE- / - souris nourries avec un régime athérogène, grâce à un rejet constant de l’aldostérone. Méthodes pour caractériser la composition de la plaque sont également décrites.

Induction de Plaques d’athérome grâce à l’Activation des récepteurs minéralocorticoïdes chez les souris déficientes en apolipoprotéine E

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Les modèles murines de l'athérosclérose sont des outils utiles pour étudier les voies pathogènes au niveau moléculaire, mais exigent une quantification normalisée du développement des lésions. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour déterminer la taille de lésion dans les vaisseaux artériels principaux comprenant la racine aortique, l'arc aortique, et l'artère brachiocéphalique.

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour analyser la charge athéroscléreuse chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comparer l’abondance, l’emplacement et la taille des lésions athérosclérotiques chez différents animaux.

Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Ici, nous présentons des protocoles optimisés de nettoyage des tissus pour imager l’aorte murine en trois dimensions (3D). Nous décrivons des procédures de pointe pour l’immunomarquage, la clairance optique et l’imagerie dans le but de définir la proximité anatomique du système nerveux périphérique avec les plaques d’athérosclérose et l’adventice dans l’athérosclérose.

Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

Ce protocole fournit une méthodologie complète pour l’analyse quantitative des plaques d’athérosclérose afin de faciliter des recherches plus approfondies sur les mécanismes et la progression de l’athérosclérose.

Isolement et analyse de lésions de l’arc aortique et de la racine dans un modèle murin athérosclérotique

Des échantillons de tissu d’endartériectomie coronarienne ont été traités pour isoler un seul noyau selon un protocole de dissociation optimisé. L’intégrité des noyaux isolés a été validée par trois approches complémentaires : la coloration par bleu de trypan pour évaluer l’intégrité membranaire, la microscopie confocale basée sur DAPI pour confirmer la morphologie nucléaire, et la cytométrie en flux pour quantifier le rendement et la pureté nucléaires.

Isolation à noyau unique à partir du tissu endartériectomique coronarien des patients atteints de pontage coronarien

Il ya grand besoin d'identifier de façon non invasive l'athérosclérose, et ici, nous montrons comment FDG-PET/CT peut être utilisé pour détecter et quantifier l'activité la plaque d'athérome et l'inflammation vasculaire.

Quantification de l&#39;activité plaque d&#39;athérome et inflammation vasculaire à l&#39;aide [18 F] fluorodésoxyglucose par émission de positons / tomodensitométrie (FDG-PET/CT)

Découvrez un modèle ex vivo de plaques athéroscléreuses humaines pour étudier les processus inflammatoires cardiovasculaires. Cette méthode permet d'analyser les réponses aux cytokines et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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