Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer le nombre et la qualité de diffraction des cristaux de protéines obtenus à partir d’une expérience de criblage de cristallisation. Pour ce faire, une matière cristalline ou précipitée est identifiée à partir d’une expérience de criblage de cristallisation de protéines existante établie à l’aide d’une protéine cible d’intérêt, la matière cristalline ou précipitée est récoltée puis utilisée pour générer un stock de graines de cristaux. Ensuite, une série de tamis de cristallisation est établie contenant à la fois la protéine cible d’intérêt et les graines cristallines.

Enfin, les tamis de cristallisation ensemencés sont surveillés pour la formation de cristaux et tout nouveau cristal de protéine est caractérisé. En fin de compte, l’application de cette procédure peut entraîner une augmentation du nombre, de la taille et de la qualité de diffraction des cristaux de protéines obtenus à partir d’expériences de criblage de cristallisation. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, par exemple, le micro-ensemencement traditionnel ou le macro-ensemencement, sont qu’elle peut être effectuée rapidement, qu’elle est très évolutive et qu’elle échantillonne beaucoup plus d’espace de cristallisation que les autres méthodes d’ensemencement.

Un autre avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas l’utilisation de matériel de départ cristallin de haute qualité pour la production de stocks de graines. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car un degré important de dextérité manuelle est requis lors des étapes de collecte et de manipulation des cristaux. Démonstration visuelle de la critique de la méthode si le micro-ensemencement à matrice aléatoire s’écarte considérablement des autres méthodes d’ensemencement de cristaux.

Les subtilités de cette méthode sont la clé du succès, et un certain nombre d’entre elles sont difficiles à communiquer avec précision sous forme de texte. Uniquement : Commencez cette procédure avec un plateau de cristallisation assis à l’aide d’un microscope binoculaire ou d’un système d’imagerie à cristal. Inspectez le plateau chaque jour pendant la première semaine.

Ensuite, une fois par semaine, notez la taille des cristaux. Dès qu’il n’y a aucun signe de croissance ultérieure, choisissez un ou plusieurs puits appropriés dans le plateau à partir desquels récolter les matériaux cristallins. Pour la génération de stocks de graines, n’importe quel matériau peut être utilisé, y compris de fines aiguilles, des lumières spiales, des microcristaux et des cristaux irréguliers et mal formés.

Les matériaux plus anciens sont plus susceptibles d’être partiellement réticulés et conviennent moins aux expériences d’ensemencement. Le jour de la récolte, utilisez un chignon enflammé pour faire une sonde arrondie à partir d’une pipette de pâturage en verre. Pour ce faire, chauffez la pipette près du milieu jusqu’à ce qu’elle devienne molle.

Ensuite, retirez-le rapidement de la flamme et retirez-le en écartant les extrémités. Essayez de tirer le verre vers le bas à un diamètre inférieur à 0,25 millimètre au point où il est d’environ 0,25 millimètre. Cassez le verre et plongez brièvement l’extrémité cassée dans la flamme.

Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un hémisphère de verre d’un diamètre d’environ 0,75 millimètre se forme à l’extrémité. Placez un microtube de centrifugation de 1,5 millilitre contenant une perle de graine sur de la glace. Ensuite, ouvrez le plateau de cristallisation sélectionné.

Eh bien, pour 24 plateaux de descente bien suspendus. Utilisez une pince à épiler pour retirer la lamelle. Ensuite, retournez la lamelle et placez-la sur une surface propre et stable.

Pour 96 plateaux de descente bien assis. À l’aide d’un scalpel, coupez le film de plafond en plastique sur le dessus du puits sélectionné, puis retirez la partie excisée du film de plafond à l’aide d’une pince à épiler. Retirez 50 microlitres de la solution réservoir et transférez ce liquide dans le tube de micro-centrifugeuse contenant la perle de graine, en veillant à ce que le tube reste sur la glace tout au long de la procédure.

Il est important d’effectuer cette opération exactement comme décrit et le plus rapidement possible. Prenez soin de bien écraser le matériel de semence avec la sonde et de récupérer autant que possible tout en regardant l’échantillon au microscope. Utilisez la sonde en verre préparée plus tôt pour bien écraser les cristaux sur le couvercle.

Glissade goutte. Les petits cristaux peuvent prendre plusieurs minutes à s’écraser complètement. Les cristaux faciles à écraser ne sont pas réticulés et ne sont pas des cristaux de sel.

Alors que les cristaux de sel produisent un clic distinctif qui peut être entendu et ressenti lorsqu’ils sont écrasés. Ensuite, retirez cinq microlitres de la solution réservoir du tube de perles de graines et transférez-les dans le sous-puits équivalent pour une expérience de goutte assise ou dans une lamelle de couverture pour une expérience de goutte suspendue contenant la matière cristalline à récolter. Pipetez ce liquide de haut en bas cinq à six fois pour remettre en suspension autant que possible le contenu du sous-puits ou de la lamelle.

Remettez la suspension dans le tube de perles de rocaille et répétez cette étape deux fois de plus, en veillant à ce que le plus de matière cristalline possible soit récoltée. Vortex, la perle de rocaille pendant deux minutes, en s’arrêtant toutes les 30 secondes pour refroidir le tube sur de la glace. Dans des tubes de 1,5 millilitre contenant une solution de réservoir.

Effectuer une série de dilutions pour archiver la dilution du stock de semences dans la solution réservoir par un facteur de quatre à 10 à chaque étape. Si les graines, le stock et les dilutions ne sont pas utilisés immédiatement, placez des aliquotes de 10 à 20 microlitres dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius pour le stockage. Une fois congelés, les stocks de graines peuvent être conservés indéfiniment jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Le criblage de cristallisation RMMS peut être effectué à l’aide de plateaux à 24 puits utilisant la méthode de diffusion de vapeur à goutte suspendue ou à 96 plateaux à usage de vapeur à goutte assise. Pour effectuer notre criblage MMS dans 24 plateaux de chute bien suspendus, utilisez une pipette pour transférer manuellement 300 microlitres de chaque condition à partir d’un tamis de cristallisation de 96 conditions en 10 millilitres. Format tube unique à chaque puits de 4 24.

Des plateaux de cristallisation bien pré-graissés de chaque réservoir de 300 microlitres transfèrent un microlitre de chaque condition de cristallisation à la surface d’une lamelle de recouvrement en plastique correspondante à partir de laquelle les bandes de protection avant et arrière ont été retirées sur le microlitre. Sur le couvercle, ajoutez un microlitre de solution protéique, puis 0,5 microlitre de bouillon de graines de cristaux. Dans le premier tour de RMMS, il est important de ne pas utiliser la solution de semence diluée.

Étant donné que plus la concentration de graines est importante, plus les résultats de cristallisation seront obtenus. Retournez chaque lamelle de manière à ce que la goutte de liquide soit tournée vers le bas et positionnée au-dessus de la position appropriée. Appuyez bien vers le bas sur la lamelle de couverture, en comprimant la graisse de plafond et en formant un joint sûr.

Une fois que les 96 gouttes sont établies, transférez le plateau dans un incubateur à une température de quatre à 18 degrés Celsius ou dans une pièce à température constante pour le stockage. Pour effectuer notre dépistage MMS en 96, des plateaux de chute bien assis. À l’aide d’un robot de cristallisation ou d’une pipette à huit canaux, transférer de 20 à 50 microlitres de chaque condition à partir d’un tamis de cristallisation de 96 conditions sous forme de bloc de puits profond dans chaque puits correspondant du plateau de cristallisation.

Ensuite, transférez, 1,0 microlitres de solution protéique, 1,0 microlitres de cristallisation et 0,5 microlitre de stock de graines dans les gouttes. Scellez le plateau à l’aide d’une feuille de plafond transparente et transférez-le dans un incubateur à une température de quatre à 18 degrés Celsius ou dans une pièce à température constante pour le stockage. Les expériences doivent être inspectées une fois toutes les 24 heures pendant cinq jours pendant cinq jours après l’établissement, puis une fois tous les sept jours pendant un maximum de quatre semaines à l’aide d’un microscope binoculaire ou d’un système d’imagerie à cristal. Inspectez chaque sous-puits ou lamelle de recouvrement dans l’ordre et notez tout signe de formation de cristaux.

Comparez les résultats de nos expériences de dépistage MMS avec ceux des dépistages non ED et notez les différences. Plusieurs cycles de RMMS observés peuvent être nécessaires. Avant une diffraction optimale, des cristaux de qualité sont produits pour des cycles supplémentaires.

Utilisez les stocks de graines dilués archivés au besoin pour contrôler le nombre de cristaux par puits. Démontrer l’efficacité du RMMS. Des méthodes de criblage ont été appliquées à la cristallisation du henné, du lysozyme blanc et du catalyseur hépatique bovin pour chaque condition de protéine 3 96.

Des tamis de cristallisation ont été utilisés J-C-S-G-P-A-C-T et Morpheus. Puis, après cinq jours, une seule condition de chaque plateau qui s’est avérée favoriser la croissance du matériau cristallin a été sélectionnée et utilisée pour la génération de stock de graines. Après cinq jours, les plateaux de cristallisation ont été inspectés et le nombre de gouttes contenant des cristaux a été enregistré.

Cette figure résume les résultats de cette expérience et fournit une analyse quantitative du lysozyme de blanc d’œuf de poule. Une augmentation de quatre à dix fois du taux de réussite de la cristallisation par rapport aux plateaux sans DE a été observée lorsque RMMS a été appliqué à cette protéine. Notamment, pour la catalase hépatique bovine, une seule affection dans le crible Morpheus a donné des cristaux, contre 55 affections identifiées après l’utilisation du RMMS.

De plus, il y a eu une augmentation de trois et deux fois du taux de réussite de la cristallisation des boîtes de foie bovin à l’aide des tamis JCSG et PACT respectivement dans tous les cas, et quel que soit le tamis de cristallisation utilisé, notre criblage MMS a donné un nombre total de cristaux significativement plus élevé que le criblage non RMMS. Nous concluons que notre MMS est une approche simple mais puissante, qui peut augmenter considérablement le taux de réussite des expériences de criblage de cristallisation des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une expérience de criblage aléatoire de matrice ensemencée de micros, de l’identification et de la récolte de matériel cristallin à la préparation du stock de graines de cristaux, et enfin, à l’établissement de la cristallisation ensemencée Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en moins d’une heure. Pour les expériences de criblage de micro-ensemencement à matrice aléatoire réalisées à l’aide d’un robot de manipulation de liquides, ou en trois heures environ pour les expériences réalisées à la main. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer que tous les tamis de cristallisation ensemencés sont bien scellés avant le stockage.