Name: Obtenir des échantillons avec ralenti accéléré et inversé vieillissement dans le Honey Bee Modèle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-29T16:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez comment obtenir des échantillons d'abeilles ouvrières présentant un vieillissement ralenti et inversé. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de sénescence cellulaire indépendamment de l'âge chronologique.

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Nous remercions Osman Kaftanoglu pour obtenir des conseils utiles et d&#39;assistance pendant le tournage. Nous tenons à remercier les relecteurs anonymes pour les commentaires perspicaces. Ce travail a été soutenu par le Conseil norvégien de la recherche (accorde 180504, 191699, 213976 et), Marie Curie/FP7 (projet ref. 238665), le National Institute on Aging (NIA subvention P01 AG22500), et les Pew Charitable Trusts.

Une. Le découplage de la sénescence âge chronologique Cette section décrit la configuration des colonies de la double cohorte, qui consistent d&#39;une cohorte d&#39;individus identifiés qui partagent le même âge chronologique («cohorte d&#39;âge unique&quot;) et une cohorte d&#39;abeilles nid. Les personnes âgées de même de la cohorte d&#39;âge unique finiront par se séparer en différents types de travailleurs ayant des dynamiques du vieillissement - ce sont les nourrices avec des abeilles butineuses ralenti et avec le déclin fonctionnel accéléré. Toutes les procédures sont décrites pour une colonie expérimentale. Nous vous conseillons cependant, d&#39;effectuer des expériences pour au moins deux répétitions colonie de sorte que les effets de la colonie peuvent être contrôlés pour (deux répliquée-conception). <ol><li> Préparation des boîtes de ruche pour les colonies de la double cohorte: Préparez une boîte régulière de ruche qui reçoit deux peignes alimentaires avec du miel, un autre peigne alimentaire avec du pollen, et deux rayons vides. Assurez-vous de trouver une reine fécondée ainsi qu&#39;une colonie de donateurs de plus de 3000abeilles nid. Les deux seront introduits plus tard (1.3). </li><li> L&#39;obtention et le marquage des individus avec l&#39;âge chronologique similaire: Recueillir peignes avec couvain operculé qui est sur ​​le point d&#39;émerger. Pour une répétition s&#39;attendre à recevoir des peignes avec un total de 3000-5000 cellules de couvain. Pour chaque répétition utiliser une quantité équilibrée de couvain d&#39;au moins trois sources différentes ruches pour éviter les distributions asymétriques de génotypes maternels (origine ruche). <ol><li> Placez couvain dans un incubateur réglé à 34 ° C avec 60-70% d&#39;humidité relative. Assurez-vous de stocker des peignes de telle manière que couvain naissant ne peut pas s&#39;échapper. </li><li> Laissez les abeilles sortent pendant deux jours et marquent ces abeilles avec une petite étiquette de peinture sur le thorax (par exemple POSCA Uni, Mitsubishi Pencil Co. Ltd). La marque de peinture permettra d&#39;identifier les abeilles de la cohorte d&#39;âge unique (jour de l&#39;émergence), et de les distinguer des autres colonies répétés. </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;une colonie de la double cohorte, qui comprend la cohorte de identified, les abeilles d&#39;âge unique: Le jour de jeunes abeilles ont été marqués, recueillent environ 2500-3000 abeilles de nidification d&#39;une colonie de donateurs (comparer l&#39;article 1 dans la discussion.), et ajouter ces abeilles non marquées à la boîte de ruche qui a été préparé avant (voir l&#39;étape 1.1). Les derniers individus constituent le nid d&#39;abeille non identifié cohorte. <ol><li> Ajouter la reine, qui sera initialement limité à une cage de reine (disponible dans le commerce). Sceller la cage avec des bonbons comestible (par exemple Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Allemagne) pour faire ouvrières libèrent lentement la reine. </li><li> Ajouter les abeilles nouvellement écloses et marqués, qui vont constituer la cohorte d&#39;âge unique. Ces abeilles sont les individus ne marquées, et sont le groupe de discussion pour toutes les étapes suivantes. </li></ol></li><li> Suivi recherche de nourriture apparition et butineuses marquage: Pour évaluer l&#39;apparition et de la dynamique de la transition infirmière-fourrier dans la cohorte d&#39;âge unique, de suivre l&#39;évolution démographique de l&#39;activité recherche de nourriture etrès autre jour pour chaque colonie. Commencer à compter les cinq jours suivant colonies ont été créées (Figure 1). <ol><li> Compter le nombre total d&#39;abeilles revenant de recherche de nourriture des vols (chiffres d&#39;entrée) à moins de 3 x 20 périodes d&#39;observation min à heures fixes. Assurez-vous de ne pas compter les abeilles pendant les périodes de vols d&#39;orientation (voir Discussion). </li><li> Lorsque les chiffres d&#39;entrée indiquent l&#39;activité de recherche de nourriture considérable pour commencer (&gt; 100 comptes d&#39;entrée / jour), commencer butineuses marquage. Pour ce faire, les butineuses de la cohorte d&#39;âge unique (individus marqués simples) reçoivent une deuxième marque de peinture au retour de leurs premiers vols de recherche de nourriture. Cette marque de peinture doit préciser le jour de la recherche de nourriture apparition, et permettra d&#39;identifier plus tard l&#39;âge de la recherche de nourriture pour chaque butineuse. </li><li> Répétez marques quotidiennes jusqu&#39;à ce qu&#39;un nombre suffisant d&#39;abeilles a été marqué. Pour estimer un nombre suffisant de butineuses marqués, s&#39;attendre à un taux de récupération de plus de 5-10% après ces abeilles avaient été âgés, généralement après 14 jours dela recherche de nourriture. </li></ol></li><li> Échantillonnage: Comme toutes les abeilles d&#39;abord marquées ont un âge chronologique, groupes d&#39;infirmières et de vieilles butineuses même âge peuvent être collectées simultanément, lorsque les butineuses ont butiné pour ≥ 14 jours. <ol><li> Simples nourrices marqués sont recueillies dans la ruche, et sont identifiés par des comportements de soins (alimentation et nettoyage des larves de têtes mises dans des cellules de couvain ouvert). </li><li> Butineuses doubles marqués sont également recueillies dans la ruche avant le début de l&#39;activité quotidienne la recherche de nourriture. </li><li> Recueillir les abeilles dans des cages (tubes, boîtes) qui fournissent une ventilation suffisante, et garder sombre jusqu&#39;à leur traitement ultérieur. Sinon, pour transcriptomique, protéomique épigénétique ou études, calées abeilles de congélation dans l&#39;azote liquide. Collecter des numéros équilibré des individus de tous les groupes d&#39;essai et de reproduire colonies. </li></ol></li></ol> 2. Reprise des travailleurs avec Rapid de travailleurs avec le vieillissement ralentie par l&#39;évolution démographique de la Ruche &lt;/ P&gt; Cette section détaille la façon dont la reprise de travailleurs avec un vieillissement accéléré (des butineuses) aux travailleurs avec le vieillissement ralenti (infirmières des abeilles) est effectuée. Cette inversion de comportement est induit, lorsque les butineuses face à un manque de nourrices, qui exercent normalement dans les soins du couvain. La procédure de réversion sera séparer une seule colonie répliquer dans deux ruches: une ruche avec la fraction infirmière d&#39;abeille («infirmière-dérivé&quot;), et une autre avec la fraction de butineuse (&quot;butineuse dérivés&quot;). Après inversion réussie, les symptômes possibles de plastique et de vieillissement inversé peuvent être étudiés dans la cohorte d&#39;âge unique des travailleurs rétrocédés, les fouilleurs continue, continue nourrices et butineuses nouvellement recrutés. Comme avant, les abeilles identifiés de la cohorte d&#39;âge unique, pas la cohorte des abeilles nid non identifiés, constituent le groupe de discussion expérimental. <ol><li> Préparation: Répliquer ruches avec des infirmières (seul marqué) et butineuses (double marquée) sont mis à disposition comme décrit dans la section précédente. Assurez-vous de ne pas commencer la réversion de moins de 500 butineuses marqués par répétition colonie pour assurer la récupération suffisante après le retour a été achevée. <ol><li> Pour une identification sûre des groupes d&#39;essai après l&#39;inversion, il est essentiel que l&#39;ensemble de la population de butineuses dans la ruche d&#39;origine a été marqué avant de réversion. La procédure suivante est décrite pour une répliquée. </li><li> La veille de la réversion, préparer un champ de ruche supplémentaire pour la ruche de butineuse dérivés (voir l&#39;étape 1.1). Repérez les deux reines et deux cadres de couvain de ruches donateurs. Avant le transfert vers les colonies expérimentales balayer toutes les abeilles adultes de ces peignes. Une reine en cage (voir l&#39;étape 1.3) et un couvain remplaceront reine et couvains dans la boîte de ruche d&#39;origine. L&#39;autre série de la reine et du couvain peigne sera utilisé le lendemain pour la nouvelle boîte de ruche. Répartition similaire de nouveaux cadres de couvain et les reines exotiques pour les deux, l&#39;original et la nouvelle ruche est conseillé de s&#39;assurer que les butineuses séparés et infirmières aura également l&#39;expérience changé indices ruche (&quot;odeur ruche&quot;). </li></ol></li><li> Réversion: Dans la matinée, juste avant le retour, ajouter la reine en cage et le couvain à la nouvelle boîte qui recevra la fraction de butineuse dérivés. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;heure de pointe de recherche de nourriture commence. Puis déplacez la colonie d&#39;origine avec butineuses balisés et nourrices au moins 100 m de l&#39;emplacement d&#39;origine. <ol><li> À l&#39;emplacement d&#39;origine, mettre en place la nouvelle boîte pour la ruche de butineuse dérivé de couvain et de la reine seulement. </li><li> Les butineuses vont quitter la boîte de ruche d&#39;origine luxation, et de retourner à l&#39;emplacement d&#39;origine. Permettre aux butineuses pour revenir à l&#39;emplacement d&#39;origine pendant 2 heures pour atteindre à côté de la séparation complète de la population butineuse des abeilles nid. </li><li> Ensuite, pour mettre fin à la séparation, fermer l&#39;original, maintenant &quot;infirmière dérivés&quot; ruche, et transférer à un rucher à moins de 3 km. </li></ol></li><li> Entretien ruche et suivi pour tâche sociale réussieinversion: Vérifiez les ruches expérimentales régulièrement pour la santé, couvain ouvert. <ol><li> Pendant les premiers jours après la manipulation de la colonie remplacer couvain sans surveillance et mort à réduire la charge pathogène potentiel. </li><li> Pour valider inversion réussie au sein de la ruche de butineuse dérivés, prendre des photos de rayons de couvain avant l&#39;introduction de ceux-ci, et à nouveau lorsque les peignes sont remplacés ou lorsque l&#39;expérience de réversion est terminée (Figure 2). Zones de couvain précédemment non plafonné et ouvert avec, nichée en direct sont des marqueurs fiables de l&#39;activité de soins infirmiers dans les colonies de butineuses dérivés. </li></ol></li><li> Échantillonnage: effets physiologiques qui accompagnent inversion sociale peuvent être détectés 3-8 jours après butineuses et les infirmières ont été séparées. <ol><li> Nous vous conseillons d&#39;échantillonnage tous les groupes d&#39;essai, les travailleurs à-dire rétrocédés et butineuses poursuivies (ruche de butineuse dérivés), ainsi que les infirmières poursuivies et butineuses nouvellement recrutés (ruche infirmière dérivés) 8 jours après inversion est lancée. </li><li> ColLect échantillons comme décrit dans l&#39;étape 1.5. </li></ol></li></ol> 3. Analyser travailleur de type Patterns de la sénescence cellulaire spécifique par quantification de Lipofuscin Lipofuscine est un biomarqueur universel de la sénescence cellulaire. En tant que produit d&#39;accumulation intrinsèque, autofluorescence spécifique de lipofuscine (émission max = 530-650 nm) peut être utilisée pour la détection 18. <ol><li> Dissection et fixation: abeilles de froid sur la glace jusqu&#39;à ce que immobile; supprimer et disséquer l&#39;échantillon de tissu désiré. <ol><li> Transférer dans un fixateur (paraformaldéhyde 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS, pH 7,2) pour une incubation pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Lavez échantillons 3 fois en PBS. </li></ol></li><li> Transformation de tissus et de montage: Couper des échantillons de tissus en sections avec plus de 40 um d&#39;épaisseur, par exemple en utilisant un microtome à lame vibrante, par exemple Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Allemagne). <ol><li&gt; Pour la compensation, incuber les coupes de tissus nuit dans 30% de glycérol (PBS), et un autre 2 heures dans 50% de glycérol (PBS). </li><li> Montez les sections sur des lames microscopiques dans 50% de glycérol (PBS). Pour sceau de stockage à long terme couvercle glisse avec le vernis à ongles. </li></ol></li><li> acquisition de l&#39;image: Pour détecter lipofuscine, nous vous conseillons d&#39;utiliser un microscope confocal à balayage laser qui fournit des lignes laser avec λ = 514, 561nm ou similaire pour l&#39;excitation, et la largeur de bande du détecteur fixé à 570-650 nm. <ol><li> Pour une meilleure identification de la lipofuscine, inclure un second canal, et faire un scan simultané à des spectres de longueur d&#39;onde plus courte (excitation = 405 nm; émission = 410-450 nm). Le canal de longueur d&#39;onde va révéler à la fois, la lipofuscine granulaire, mais aussi &quot;fond&quot; non spécifique en raison de la trachée autofluorescente et autres structures non granulaires. La deuxième, canal de longueur d&#39;onde plus courte ne révèlera autofluorescence non spécifique, mais pas lipofuscine. Ainsi, l&#39;identification de lipofuscine peut être faci<html> Tated en comparant les signaux dans les deux canaux, avec un seul d&#39;entre eux révéler les granules avec la fluorescence spécifique de la lipofuscine. </li><li> Pour l&#39;acquisition d&#39;images à haute résolution utiliser un objectif avec un grossissement de 40X ou plus, et de préférence une ouverture numérique de 1,25 ou plus. Image de balayage cumule avec des dimensions d&#39;environ 100 x 100 x 10 um 3. Chaque échantillon individuel et le tissu doit être représenté par plusieurs piles d&#39;images. </li><li> Pour réduire les variations intra-individuelles et inter-individuelles causée par la variation technique, gardez toujours la puissance du laser et la constante de la sensibilité du détecteur. </li><li> Pour réduire les biais par jour le jour les variations techniques numériser un nombre d&#39;échantillons égal de tous les groupes de test dans chacune des plusieurs séances de balayage. </li></ol></li><li> Traitement de l&#39;image: Utilisez des logiciels avec des modules qui permettent de traitement avancé des piles d&#39;images microscopiques, par exemple ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Etats-Unis,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Générer une projection maximale 2D pour chacune des piles d&#39;images 3D. </li><li> Appliquer un filtre de Gauss avec une taille de noyau modeste afin d&#39;atténuer le bruit à haute fréquence, et de préserver des structures avec des dimensions de granules de lipofuscine. </li><li> Fusionner les deux canaux de couleur pour faciliter l&#39;identification de lipofuscine (voir l&#39;étape 3.2). </li></ol></li><li> Analyses Image: Assurez-vous que le sujet d&#39;effectuer les étapes de quantification sera aveugle pour tester l&#39;identité du groupe. <ol><li> Pour toutes les images, choisissez d&#39;abord une région d&#39;intérêt (ROI) qui couvre les structures concernées, et a des dimensions similaires à celles du ROI d&#39;autres images. </li><li> Ensuite, sélectionnez le nombre souhaité de granules de lipofuscine qui représentent chaque ROI. Lors de la sélection des granules de lipofuscine dans un retour sur investissement, l&#39;application des règles suivantes sera de réduire le biais subjective. <ol><li> Choisissez un emplacement cohérent pour sélectionner la première granulationle. Cela peut être, par exemple, le bord le plus à gauche d&#39;un retour sur investissement, et le granulé qui est plus proche du bord sera toujours le premier choix. </li><li> Un après l&#39;autre, les granules sont choisis qui sont le plus proche de la sélection précédente (à côté du voisin). </li><li> Lorsque vous choisissez le voisin, se déplacer que dans un sens, par exemple que la recherche à droite de la sélection précédente. Cette règle empêche que la sélection est dominé par des groupes occasionnels de granules denses. </li><li> Lorsque la sélection est terminée, déterminer la taille de chaque particule de la lipofuscine en exposant et en mesurant la surface des granules respectif. Utilisez tests statistiques appropriés pour comparer les individus des différents groupes de test. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Sheehy, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-cytometric+method+for+quantification+of+neurolipofuscin+and+comparison+with+existing+histological+and+biochemical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gerontol+Geriatr%22%5BJournal%5D)">A flow-cytometric method for quantification of neurolipofuscin and comparison with existing histological and biochemical approaches.</a> Arch Gerontol Geriatr. 34, 233-248 (2002).</li>
<li>Hsieh, Y. S., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+trophocytes+and+fat+cells+as+target+cells+for+cellular+senescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Honeybee trophocytes and fat cells as target cells for cellular senescence studies.</a> Exp Gerontol. 46, 233-240 (2011).</li>
<li>Wolschin, F., Munch, D., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+proteomic+analyses+reveal+regional+brain+differences+during+honeybee+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and proteomic analyses reveal regional brain differences during honeybee aging.</a> J Exp Biol. 212, 4027-4032 (2009).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous adoptons ici approches décrites précédemment 8,16,17,19,20, et les intégrer dans un seul flux de travail qui facilitera l&#39;étude de vieillissement souple chez les abeilles. Notre objectif est de fournir aux scientifiques qui sont novices dans ce domaine avec un outil normalisé fixé pour obtenir du matériel de l&#39;échantillon concerné, et à améliorer la reproductibilité expérimentale entre différentes équipes de recherche. Bien que nos procédures sont simplifiées et ne nécessitent pas de matériel spé...

Les structures de la colonie complexes des animaux très sociaux sont maintenus grâce à l&#39;interaction d&#39;une caste de reproduction, et une caste d&#39;aide de typiquement travailleurs non-croisements avec des comportements différents de la tâche sociale. Dans les différentes catégories de travailleurs, des adaptations physiologiques spécifiques permettent des comportements de soins de sib distinctes, et sont également liés à des différences de durée de vie extrêmes. Les abeilles et les rats-taupes représentent modèles animaux les mieux développés pour étudier comment la socialité est liée à des motifs de l&#39;accélération, négligeable ou inversé vieillissement 1-3. Dans les colonies d&#39;abeilles, une seule reine de ponte est assisté par des milliers de travailleurs qui tendent le couvain, le fourrage pour la nourriture, et de s&#39;engager dans la garde, la thermorégulation ou comportements d&#39;hygiène 4. Parmi ces travailleurs sont les butineuses très courte durée de vie, nourrices avec intermédiaire, et l&#39;hiver (diutinus) abeilles avec une durée de vie plus longue. Les individus, cependant, ne sont pas liées de façon permanente à une certaine wode type rker, mais afficher une ontogenèse du comportement souple: ils changent de comportement de la tâche sociale à l&#39;autre («castes temporelles»). Abeilles Callow peuvent changer à couvain tendant nourrices, qui a finalement peut changer à la recherche de nourriture à l&#39;extérieur. Cependant, les abeilles inexpérimenté de nidification peuvent aussi se transformer en abeilles d&#39;hiver la plus longue durée de vie, et les butineuses de courte durée peuvent même revenir en infirmières généralement de plus longue durée. Les travailleurs avec une extrême (abeilles d&#39;hiver) et intermédiaire (nourrices) durée de vie ont bien développé production et de stockage organes alimentaires avec des ressources abondantes - par opposition à butineuses de courte durée (examinés dans 1,5). Cependant, que la réglementation de la durée de vie individuelle va au-delà de simples changements dans l&#39;équilibre d&#39;une personne ressource est suggéré par les recherches sur une protéine de jaune, qui a des fonctions adaptées divers dans la non-reproduction travailleur caste, comme la production de gelée 6, contrôle hormonal 7, immunitaire 8 et anti-oxydant défense 9. Les modèles de fbaisse unctional (sénescence) des disparités miroir de la durée de vie chez les travailleurs, établie pour olfactif, et aussi pour d&#39;autres fonctions cérébrales ou motrices 10-13. Plus précisément, la baisse significative de la fonction d&#39;apprentissage après seulement deux semaines de recherche de nourriture correspond à une progression de la mortalité similaire dans butineuses 14, par opposition à l&#39;absence de baisse détectable (sénescence négligeable) des abeilles 15 hiver longue durée de vie. Pour identifier les empreintes moléculaires du vieillissement souple, nous avons adapté paradigmes expérimentaux établis qui permettent de surveiller et de manipuler des transitions de type vieillissement 8,16,17. Expérience 1 détails la façon d&#39;obtenir des échantillons dans lesquels les effets de l&#39;âge chronologique et comportements sociaux spécifiques de type travailleur sur le vieillissement peuvent être séparés. Expérience 2 décrit le renversement des butineuses avec accélérées dans les nourrices avec la dynamique de vieillissement ralentis. Expérience 3 propose une approche pour sonder les effets de la sénescence cellulaire par anatomical quantification d&#39;un biomarqueur établi pour le vieillissement cellulaire (lipofuscine) 18.

<table><tbody><tr><td>Apifonda</td><td>S&#252 ; dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Merck</td><td>1.04094.1000</td><td></td></tr></tbody></table>

obtenir des échantillons avec ralenti accéléré et inversé vieillissement dans le honey bee modèle

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Sociétés d&#39;animaux très sociaux disposent de grandes différences de durée de vie entre les individus étroitement liés. Chez les insectes sociaux, l&#39;abeille est le meilleur modèle créé pour étudier la façon dont la plasticité dans la durée de vie et le vieillissement s&#39;explique par des facteurs sociaux. La caste des travailleurs des abeilles comprend nourrices, qui tendent le couvain et les abeilles butineuses, qui recueillent le nectar et le pollen. Des travaux antérieurs ont montré que les fonctions du cerveau et de la performance de vol sénescence plus rapidement dans les butineuses que chez les infirmières. Toutefois, les fonctions du cerveau peuvent récupérer, lorsque les butineuses reviennent à des tâches de soins infirmiers. Ces modèles de sénescence accélérée fonctionnelle et inversée sont liés aux niveaux de ressources métaboliques modifiées, à des altérations de la protéine abondance et de la fonction immunitaire. Vitellogénine, une protéine de jaune avec des fonctions adaptées à contrôle hormonal et de défense cellulaire, peut servir d&#39;élément de régulation important dans un réseau qui contrôle les différentes dynamiques du vieillissement chez les travailleurs. Ici, nous décrivons comment l&#39;émergence d&#39;infirmières et de butineuses peut être surveillé et manipulé, y compris la reprise de butineuses généralement de courte durée dans les infirmières de plus longue durée. Nos résultats représentatifs montrent comment les individus avec un âge chronologique se différencient en butineuses et nourrices dans des conditions expérimentales. Nous illustrons comment inversion comportementale de butineuses dos des infirmières peut être validé. Enfin, nous montrons comment les différents sénescence cellulaire peut être évaluée en mesurant l&#39;accumulation de lipofuscine, un biomarqueur universel de la sénescence. Pour étudier les mécanismes qui peuvent lier les influences sociales et vieillissement plasticité, ce protocole fournit un outil standardisé mis d&#39;acquérir du matériel de l&#39;échantillon concerné, et d&#39;améliorer la comparabilité des données entre les études futures.

sections 1 et 2 du Protocole détail comment les groupes de tests peuvent être obtenus à étudier les attributs de l&#39;accélération, ralenti et inversés vieillissement dans les colonies avec une seule cohorte d&#39;âge. Pour contrôler la différenciation de type travailleur qui accompagne l&#39;ontogenèse normale, nous avons évalué les chiffres butineuses («dénombrements d&#39;entrée») pour 6 colonies (figure 1, comparer section 1). Les graphiques montrent que le changement considérable de l&#39;infirmiè...

Chez les travailleurs d&#39;abeilles, le vieillissement dépend de comportements sociaux plutôt que sur l&#39;âge chronologique. Ici, nous montrons comment les travailleurs-types avec des modèles très différents de vieillissement peuvent être obtenues et analysées pour la sénescence cellulaire.

Obtenir des échantillons avec ralenti accéléré et inversé vieillissement dans le Honey Bee Modèle

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des types d'ouvrières d'abeilles chez lesquelles les mécanismes du vieillissement ont été ralentis ou inversés. Le vieillissement peut ainsi être étudié. Ceci est réalisé en dissociant d'abord la sénescence de l'âge chronologique, en assemblant des colonies qui reçoivent des abeilles nouveau-nées d'un même âge.Ces abeilles finissent par assumer différentes tâches sociales, soit s'occuper des larves, soit butiner, tout en ayant le même âge chronologique. Les abeilles nourricières peuvent présenter un vieillissement ralenti par rapport au vieillissement plus rapide des butineuses. Ensuite, une inversion des dynamiques de vieillissement, passant du butinage aux soins aux larves, est induite.D'abord, les butineuses sont séparées des abeilles nourrices, puis les butineuses qui connaissent un manque de nourrices reviennent aux tâches de nurse. Les résultats sont obtenus en comparant les symptômes de vieillissement cellulaire chez les ouvrières reverties, les butineuses habituelles et les abeilles nourrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, comme quels mécanismes peuvent contribuer à ralentir le déclin fonctionnel pendant le vieillissement.Un avantage essentiel de cette procédure est qu'elle ne nécessite pas d'équipement spécial. Ainsi, il devrait être facile de reproduire des expériences en utilisant ces méthodes. Certaines des procédures seront démontrées par Osman Craft ulu, chef de projet au laboratoire de recherche sur les abeilles, situé à l'Université d'État de l'Arizona.Cette section décrit la mise en place d'une colonie à deux cohortes, comprenant une cohorte de butineuses marquées appariées par âge et une cohorte de butineuses aléatoires de la ruche. Les butineuses marquées se répartissent entre des butineuses nourrices ou butineuses butineuses, qui présentent des dynamiques de vieillissement différentes. Les expériences doivent comprendre deux colonies ou plus de ce type.Tout d'abord, préparez une caisse de ruche ordinaire contenant deux rayons de nourriture avec du miel, un autre rayon de nourriture avec du pollen et deux rayons vides. Ensuite, repérez une reine fécondée ainsi qu'une colonie donneuse comptant plus de 3 000 abeilles dites « d'essaim ». Puis, récoltez des rayons portant des couvains operculés sur le point d'émerger : entre trois et 5 000 alvéoles bouchonnés sont nécessaires pour une colonie.Ces cadres doivent être prélevés auprès d'au moins trois ruches différentes afin d'éviter une distribution biaisée des génotypes maternels. Incubez maintenant les cadres de couvain collectés à 34 degrés Celsius, avec une humidité relative comprise entre 60 et 70 %. Laissez les abeilles émerger pendant deux jours et veillez à ce que les cadres soient stockés de manière à ce que le couvain émergent ne puisse pas s'échapper.Ensuite, marquer les abeilles émergentes avec une petite étiquette de peinture sur le thorax afin d'identifier les abeilles d'une même cohorte d'âge et de les distinguer des autres colonies réplicates. Le jour même, les jeunes abeilles ont été marquées. Prélever entre 2, 503, 000 abeilles nichées provenant d'une colonie donneuse et ajouter ces abeilles non marquées à la ruche préparée.Ensuite, ajoutez une reine des abeilles enfermée dans une cage scellée avec un bonbon comestible. Les ouvrières adultes robustes libéreront progressivement la reine. Enfin, ajoutez les abeilles marquées nouvellement émergées.L'objectif de l'étude est d'évaluer le début et la dynamique de la transition de l'ouvrière nourricière à l'ouvrière butineuse. Surveiller l'évolution démographique de l'activité de butinage tous les deux jours pour chaque colonie. Commencer le comptage cinq jours après la mise en place des colonies.La surveillance est effectuée en comptant le nombre total d'abeilles revenant de vols de butinage par le biais de comptages à l'entrée. Ceci est réalisé en trois périodes de 20 minutes à des heures fixes. Ne pas compter les abeilles pendant les périodes d'orientation.Vols lorsque le nombre d'entrées dépasse 100 par jour. Commencer à marquer les butinages. Utiliser une pince douce pour prélever des abeilles marquées individuelles lorsqu'elles reviennent de leurs vols afin de faciliter la capture des abeilles.Après l'atterrissage, rétrécissez l'entrée de la ruche à l'aide de mousse ou de treillis. Appliquez une deuxième marque de peinture indiquant le jour, ce qui permettra ultérieurement de déterminer l'âge au début de l'activité de butinage. Utilisez des couleurs différentes ou des combinaisons de couleurs pour marquer les abeilles chaque jour.Lorsqu'on envisage le nombre d'abeilles à marquer pour l'étude, prévoir de récupérer de cinq à dix pour cent des abeilles butineuses marquées. Après au moins deux semaines d'activité de butinage, collecter simultanément les abeilles nourrices marquées et les butineuses ; recueillir également les abeilles nourrices marquées directement dans la ruche. Ces abeilles s'occupent de nourrir et de nettoyer les larves, en introduisant leur tête dans les alvéoles ouvertes contenant la ponte. Collecter aussi les butineuses doublement marquées.Prélevez un nombre équilibré d'individus provenant de tous les groupes expérimentaux et des colonies répliquées. Transférez les abeilles dans des cages aérées et conservez-les à l'obscurité jusqu'à leur traitement ultérieur. Pour les études moléculaires, congélez immédiatement les abeilles collectées dans de l'azote liquide.Cette procédure consiste à séparer une colonie unique en deux ruches, l'une contenant la fraction des abeilles nourrices, B, et l'autre la fraction des butineuses. Pour cela, il faut une ruche préparée comme décrit dans la section précédente, conservant au moins 500 butineuses marquées et une population de butineuses entièrement marquée. La veille de la réversion, préparez une deuxième ruche neuve comme décrit précédemment.Ensuite, prélèvez deux cadres à couvain provenant de ruches donneuses. Brosser délicatement toutes les abeilles adultes présentes sur les cadres sélectionnés. Réunissez également deux reines de ruches donneuses, une reine dans une cage scellée avec du bonbon et un cadre à couvain.Remplacez la reine et les cadres à couvain dans la ruche d'origine. Un autre cadre à reine et couvain sera utilisé le lendemain pour l'autre ruche. Ce dispositif constitue un témoin destiné ultérieurement à conférer aux colonies issues de butineuses et d'ouvrières nourrices une odeur de ruche nouvelle.Le matin du jour de réversion, photographiez l'état des cadres à couvain neufs. Ensuite, ajoutez une nouvelle reine dans une cage scellée au bonbon et un cadre à couvain dans la nouvelle ruche. Pendant cette journée, au moment de pointe de l'activité de butinage, déplacez la colonie d'origine avec les butineuses et les nourrices marquées à au moins 100 mètres de leur emplacement d'origine, puis ramenez-les à cet emplacement initial.Installez la nouvelle boîte pour la ruche issue de la butineuse. Laissez la butineuse retourner à l'emplacement d'origine pendant deux heures. Ceci permet une séparation quasi complète de la population de butineuses des abeilles de la ruche.Pour interrompre la séparation, fermez la ruche d'origine et transférez-la dans un rucher situé à au moins trois kilomètres de distance. Vérifiez régulièrement les ruches expérimentales à la recherche de couvain ouvert sain. Pendant les premiers jours, remplacez tout couvain mort ou non pris en charge afin de réduire la charge potentielle de pathogènes ; les zones précédemment sans opercule et présentant du couvain ouvert vivant constituent des indicateurs fiables de l'activité de nurse dans les colonies issues d'ouvrières butineuses huit jours après le début du retournement.En utilisant la méthode précédemment décrite pour échantillonner les ouvrières réverties ainsi que les butineuses et nourrices continuatrices, prendre une autre photo des cadres introduits à la fin de l'expérience afin de surveiller la différenciation des types d'ouvrières, accompagnant le décompte normal des butineuses évalué sur six colonies. Une augmentation considérable de l'activité de butinage a été observée après 10 jours.Une certaine variabilité, indiquée par les points temporels rouges, est due aux conditions météorologiques changeantes. La réversion ontogénétique, des tâches de butinage vers celles de nurse, a été validée par l'inspection de cadres à couvain introduits dans les colonies issues de butineuses. En haut se trouve le cadre avant son introduction.Voici le même peigne huit jours après son introduction. La présence de zones de larves saines nouvellement couvées et un accroissement du stockage de pollen autour des alvéoles contenant des larves indiquent que les butineuses précédentes ont correctement accompli les tâches typiques de construction du nid et de soins aux jeunes. L'accumulation de lipofuscine, un symptôme fortement conservé du vieillissement cellulaire, a été évaluée dans divers tissus de jeunes butineuses et d'ouvrières nourricières âgées de manière comparable.17 jours de butinage ont entraîné une augmentation significative de la taille des granules de lipofuscine. Cette augmentation nette de l'accumulation de lipofuscine et de la taille des granules était liée à de longues durées de butinage, comme illustré par des flèches dans D. Lors de la réalisation de ces procédures, il est extrêmement important d'identifier directement les types d'ouvrières. Par exemple, évitez les erreurs d'identification des butineuses en cessant de marquer les abeilles pendant les périodes quotidiennes comportant des vols d'orientation, qui coïncident également avec le stade pré-buttinage.Les abeilles quitteront ou entreront dans la ruche selon nos procédures. D'autres méthodes, telles que la protéomique et la transcriptomique, peuvent être réalisées afin d'identifier les caractéristiques moléculaires du vieillissement souple.

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