Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les propriétés synaptiques et d’excitabilité des cellules embryonnaires de poisson-zèbre. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’embryon de poisson zèbre pour exposer la surface ventrale de la cervelle postérieure. La deuxième étape consiste à placer la préparation disséquée sur la platine d’un microscope à pince de patch et à identifier la bouche dans leurs cellules.

Prochain patch. Fixez-les sur les cellules M en utilisant le mode d’enregistrement approprié et enregistrez l’activité synaptique et les propriétés d’excitabilité. La dernière étape consiste à analyser les données enregistrées pour déterminer les propriétés synaptiques ou d’excitabilité.

En fin de compte, le clampage par patch de ces cellules est utilisé pour montrer les propriétés des récepteurs synaptiques dans un organisme en développement. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront deux principaux domaines de difficulté. La première est la dissection.

La deuxième formation de la scène des concerts peut être difficile. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai décidé de travailler sur une préparation de poisson-zèbre dans laquelle le cerveau postérieur était attaché à la moelle épinière, démontrant la procédure sera Burram Roy, un étudiant diplômé au doctorat dans mon laboratoire, Commencez cette procédure en préparant le plat de dissection tapissé de Sard. Tout d’abord, fixez les rondelles à la glissière avec de la graisse.

Ajoutez ensuite du sard liquide au centre de la rondelle. Le sard durcit généralement pendant la nuit et forme un petit lit circulaire sur la lame de verre, qui devient la base du plat de dissection. Après avoir placé une lamelle sur la diapositive, placez la diapositive dans la chambre d’enregistrement pour servir de base à la dissection.

Ensuite, préparez les solutions requises. Les solutions extracellulaires doivent être laissées à température ambiante tandis que les solutions intracellulaires doivent être maintenues stériles. On peut également ajouter 0,1 % de jaune à la solution intracellulaire, de sorte que la visualisation de la morphologie des cellules M puisse être effectuée à la fin de l’expérience pour confirmer l’identité cellulaire.

Ensuite, élevez les embryons de poisson zèbre de type sauvage dans de l’eau d’œuf à 28,5 degrés Celsius et collectez-les et stabilisez-les selon la publication précédente. Pour la dissection, transférez les embryons dans la boîte de dissection qui sert également de chambre d’enregistrement. Ensuite, anesthésez-les pendant sept à 10 minutes.

Dans une solution saline anesthésiante qui se rapproche beaucoup de la solution saline physiologique, on peut déterminer s’ils sont correctement anesthésiés en examinant la réponse à un léger pincement de la queue. Ensuite, épinglez les embryons à travers le no accord et sur la boîte de protection SIL avec un fil de tungstène de 0,001 pouce sous un microscope de dissection avec un grossissement de 25x. Ajustez le grossissement de la lunette de dissection à 40 à 50 x pour effectuer la dissection.

Maintenant, retirez la mâchoire, les yeux et le cerveau antérieur à l’aide d’une paire de pinces fines. Retirez doucement le cerveau postérieur du cordon ganglionnaire sous-jacent en travaillant soigneusement la pince entre le cordon ganglionnaire et le cerveau. Ensuite, retournez doucement le cerveau postérieur de manière à ce que la surface ventrale soit tournée vers le haut.

Ce positionnement permet un bon accès aux cellules M, qui se trouvent généralement à moins de cinq à 10 micromètres de la surface ventrale chez les jeunes embryons et de 20 à 50 micromètres chez les larves plus âgées. Ensuite, déplacez soigneusement la préparation vers la configuration d’enregistrement où l’expérience de patch clamp peut être effectuée. Les cellules M sont visualisées avec un contraste d’interférence différentiel, bien que d’autres modes d’imagerie puissent également être utilisés pour préparer le serrage par patch.

Commencez par tirer des pipettes CLA patch avec du verre de bosilicate à paroi mince. Dans une pipette à traction horizontale, le diamètre de la pointe est d’environ 0,2 à 0,4 micromètre après le polissage au feu jusqu’à un bord lisse, et le cône de la tige mesure environ quatre millimètres de long. Remplissez l’extrémité de la pipette avec une solution intracellulaire en trempant l’extrémité dans le liquide intracellulaire.

Insérez ensuite une aiguille de seringue dans la pipette et expulsez doucement la solution intracellulaire de la seringue. Pour finir de remplir la pipette, fixez la pipette à l’étage de tête de l’amplificateur Dans la configuration électrophysiologique, il est important de maintenir l’étage de tête à un angle d’environ 45 degrés par rapport à l’axe horizontal, car cela garantit un angle d’entrée pour la pipette adapté à la formation de joints à haute résistance avec la bouche dans leur cellule juste avant que la pipette ne descende dans la solution du bain, Appliquez une petite pression positive sur la pipette pour réduire le risque de blocage de la pointe. Continuez à vous approcher de la cellule M avec une petite quantité de pression positive dans la pipette.

La pression positive pousse doucement la cellule d’un côté à l’autre et, lorsqu’elle est positionnée immédiatement au-dessus de la cellule, forme une petite fossette sur la membrane cellulaire. Laissez maintenant la pipette en place pendant quelques secondes pour nettoyer délicatement la surface de la cellule afin qu’une étanchéité solide entre la pipette et la membrane puisse être formée. Relâchez ensuite la pression positive dans la pipette pour initier le scellement.

Une petite quantité de pression négative associée à un potentiel de pipette négatif permet de former des joints giga en quelques secondes. Par la suite, modifiez le potentiel de maintien dans l’amplificateur à moins 60 millivolts. Rompre la membrane cellulaire avec une série de courtes impulsions d’aspiration.

Ensuite, enregistrez immédiatement les potentiels de membrane et minimisez les artefacts de capacité. Compensez la capacité de la cellule et la résistance d’accès de 70 à 85 % La résistance d’accès doit être surveillée toutes les 30 secondes à une minute, et s’il y a un changement de 20 % ou plus, interrompez l’expérience. Une fois l’expérience terminée et que suffisamment de données ont été acquises, sacrifiez l’embryon en enlevant le cerveau postérieur à l’aide d’une paire de pinces.

Cette figure montre les enregistrements représentatifs des courants excitateurs des récepteurs A MPA et NMDA obtenus à partir de 48 embryons HPF. Voici les CSP spontanées A MPA ME enregistrées à partir d’une cellule M à un potentiel de maintien de moins 60 millivolts. Et c’est le PSC ME moyen.

Voici les PSC spontanées A MPA et NMDA enregistrées à partir d’une cellule M à un potentiel de maintien de 40 millivolts. Et c’est la moyenne des PSC ME glutamate me PSCs ont été enregistrées en présence d’un TTX micromolaire pour bloquer les potentiels d’action, de cinq micromolaires stricts neuf et de 100 micromolaires de ritoxine pour bloquer la glycine et l’occurrence de G. Voici les CSP MI spontanées enregistrées à partir d’une cellule M à un potentiel de maintien de moins 60 millivolts.

Et les PSCs MI moyennes ont été enregistrées en présence d’un TTX micromolaire pour bloquer les potentiels d’action. Un millimolaire d’acide chimérique pour bloquer l’activité du récepteur du glutamate et 10 micromolaires par Qing pour bloquer l’apparition de GABA. Il s’agit des potentiels d’action enregistrés à partir d’une cellule M dans cette cellule particulière.

Un stimulus de seuil SRA de 0,48 nanoampères a déclenché plusieurs potentiels d’action, mais un stimulus au seuil n’entraîne que la production d’un seul potentiel d’action. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de patcher l’enregistrement des cellules M et d’autres neurones rachidiens réticulaires dans les embryons de poisson-zèbre.