Name: Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez l'imagerie du recyclage des vésicules synaptiques avec les colorants FM styryl dans les terminaisons nerveuses. Cette méthode permet d'évaluer les activités synaptiques évoquées et spontanées pour mieux comprendre la transmission neuronale.

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Les auteurs remercient les membres du laboratoire Harata pour des discussions utiles tout au long de l&#39;exécution de ce travail. Ce travail a été financé par des subventions de l&#39;American Heart Association, la Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation et la Fondation Whitehall à NCH

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit les protocoles de coloration et de décoloration des vésicules synaptiques en réponse à évoqué, l&#39;activité synaptique spontanée et miniature, et pour l&#39;imagerie au cours de la phase de décoloration. En plus des protocoles existants, nous avons inclus un nouveau protocole d&#39;observer la décoloration FM sur la base de l&#39;activité synaptique miniature. L&#39;utilisation de ces protocoles, nous l&#39;avons déjà identifié des anomalies dans les neurones en culture à partir d&#39;un modèle de so...

La fonctionnalité des vésicules synaptiques est un déterminant important de la transmission synaptique. Ces vésicules libèrent des neurotransmetteurs quand ils fusionnent avec la membrane plasmique présynaptique (exocytose), et ils seront prêts pour un autre cycle de libération après avoir été régénéré à partir de la membrane plasmique (endocytose) et rechargé avec neurotransmetteur. La recherche sur la dynamique des mécanismes sous-jacents et le recyclage des vésicules synaptiques a été fortement accélérée par l&#39;introduction de colorants styryles FM 1. Ces molécules bipolaires, qui ont chargés positivement groupes de tête hydrophiles et queues hydrophobes (plusieurs colorants dans la figure 1A, stereoview de FM1-43 dans la figure 1B), peuvent réversible entrer et sortir de membranes lipidiques sans les imprégner. Groupes de colorants FM partagent des caractéristiques similaires qui influent sur la plage de la lumière qu&#39;ils émettent. Par exemple, FM2-10, FM1-43, et FM1-84 ont une double liaison entre les deux composés cycliques et shoémission verte w. La différence entre eux est la longueur de la queue hydrophobe, qui détermine son hydrophobie et donc la vitesse de sortie de la membrane (décloisonnement). Dans les cas de FM5 et FM4-95-64, trois doubles liaisons relient les composés cycliques, et ils montrent émission dans le rouge. Ces colorants diffèrent en ce qui concerne leurs parties hydrophiles. Dans tous les colorants FM, l&#39;intensité de fluorescence augmente quand ils sont insérés dans les membranes biologiques, en raison d&#39;une augmentation du rendement quantique dans l&#39;environnement hydrophobe par rapport à l&#39;environnement hydrophile. Ainsi, les variations de l&#39;intensité FM représentent les variations de la valeur de la membrane. Les différentes couleurs (spectres d&#39;émission) et hydrophobicités font la FM teint un outil de recherche polyvalent dans le recyclage des vésicules synaptiques. Sur la base de ces caractéristiques, les colorants FM sont principalement utilisés selon le schéma suivant dans l&#39;analyse de recyclage des vésicules synaptiques (figure 2). Neurons sont baignées dans une solution extracellulaire contenant le colorant FM, ce qui lui permet d&#39;être pris dans des vésicules synaptiques (SVS) car ils forment par endocytose (coloration). Le colorant est ensuite lavé par application d&#39;une solution de colorant extracellulaire libre, ce qui révèle les terminaisons nerveuses fonctionnelles, c&#39;est à dire que ceux subissant une endocytose activement contiendra un groupe de vésicules synaptiques qui sont chargés avec le colorant (figure 2 du bas). Exocytose ultérieur conduit à la perte du colorant FM à l&#39;espace extracellulaire et une perte concomitante de la fluorescence (de décoloration; due à la fois à la décloisonnement à un environnement hydrophile et diffusion en dehors du site de l&#39;exocytose). Par conséquent, les changements dans FM intensité de fluorescence sont des indicateurs de la vésicule synaptique exo-et endocytose. Colorants FM ont été utilisés pour colorer et décolorer les vésicules synaptiques dans divers organismes et préparations 2,3. Les exemples incluent neur mammifèrescultures onal 4-9, des tranches de cerveau de mammifères 10,11, 12,13 jonctions neuromusculaires, les neurones bipolaires de la rétine 14,15 et cellules ciliées de la cochlée 16. En général, dans ces expériences, les colorations et décoloration sont déclenchées par la stimulation largement les neurones (activité évoquée). Récemment, cependant, de la vésicule synaptique recyclage en réponse à la stimulation faible a également été analysée, de même que le recyclage en l&#39;absence d&#39;un stimulus externe (de l&#39;activité synaptique spontanée et miniature) 9,17-19. Activités synaptiques spontanés et miniatures sont définis comme ceux qui se produisent en l&#39;absence de stimuli externes, avec l&#39;ancien impliquant la décharge spontanée de potentiels d&#39;action (figure 3). Ces activités synaptiques faibles sont associés à de faibles changements de signaux FM que celles déclenchées par une vaste stimulation. La mesure exige que les changements dans Déess FMintensité rence reflètent fidèlement l&#39;exocytose des vésicules synaptiques ou endocytose mais les changements ne artéfactuelles en intensité. L&#39;une des causes de l&#39;artefact est la présence d&#39;une coloration non spécifique de la membrane de plasma par des colorants FM. Lavage progressif de cette composante va conduire à un changement progressif dans l&#39;intensité de fluorescence mesurée, qui sera attribué à tort à des activités synaptiques. Ce facteur peut être réduite par des méthodes appropriées (voir Protocole). La cause la plus notable de l&#39;artefact est le photoblanchiment de colorant FM retenu dans les vésicules synaptiques. Les changements liés à l&#39;intensité photoblanchiment-FM doivent être petites par rapport aux biologiques (synaptiques) les changements qui sont évalués. Le développement récent des appareils sensibles, par exemple la caméra dispositif à couplage de charge d&#39;électrons multipliant (EMCCD), permet de réduire photoblanchiment en raccourcissant la durée d&#39;exposition et l&#39;affaiblissement de l&#39;intensité de la lumière utilisée pour exciter le fluorophore. Une autre cause de l&#39;artefact est une dérive in le niveau de focalisation du microscope optique. La dérive de mise au point au cours d&#39;une session de formation d&#39;image peut être causée par des effets mécaniques ou thermiques, et à tort entraîner un changement dans l&#39;intensité de fluorescence mesurée. Nous décrivons ici des protocoles et des équipements qui font qu&#39;il est possible d&#39;utiliser des colorants FM pour analyser recyclage des vésicules synaptiques, même dans le contexte de faible ou pas de stimulation, en particulier, l&#39;activité synaptique miniature. Nous montrons des exemples de la coloration et décoloration de vésicules synaptiques lors d&#39;événements évoqué et spontanées, en utilisant les neurones de rongeurs hippocampe en culture, et l&#39;imagerie de la phase de décoloration. Nous démontrons également comment évaluer le degré de photoblanchiment FM colorant, en l&#39;absence de toute perte de colorant FM en raison des activités synaptiques.

<table><tbody><tr><td>Générateur d'impulsions</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Stimulateur isolé&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Cet appareil sert à évaluer la morphologie cellulaire en faible grossissement.</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Cet appareil sert à l'imagerie en fluorescence et en lumière transmise à haute résolution, avec une dérive de mise au point minimale.</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td></td><td>Un objectif à immersion dans l'eau est recommandé. Un objectif à immersion dans l'huile peut être utilisé sauf si la structure observée se trouve profondément sous la surface de la lame (&lt;i&gt;par exemple&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Cube de filtres</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20 nm ex, 510 nm dclp, 520 nm LP em pour FM1-43</td></tr><tr><td>Cube de filtres</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em pour FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Cette caméra EMCCD est utilisée pour la détection de fluorescence à haute sensibilité.</td></tr><tr><td>Chillers à circulation liquide</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Cet appareil sert à perfuser en continu la caméra avec de l'eau refroidie afin de maintenir une température de -80&amp;deg;C, et ainsi réduire le bruit.</td></tr><tr><td>DEL</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>Cette source lumineuse sert à un contrôle rapide de l'excitation de la fluorescence (marche/arrêt).</td></tr><tr><td>Logiciel d'acquisition d'images</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d'imagerie</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion rapide</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tétrodotoxine</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Attention : réactif toxique. Manipuler avec précaution.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43 fixable par les aldéhydes (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 fixable par les aldéhydes (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Sel de Hanks&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Essentiel Minimum</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Cette solution ne contient pas de rouge de phénol, qui pourrait interférer avec l'imagerie en fluorescence.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Attention : réactif toxique. Manipuler avec précaution.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants fm pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Les vésicules synaptiques dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles subissent l&#39;exocytose et l&#39;endocytose. Ce recyclage des vésicules synaptiques peut être efficacement analysé en utilisant des colorants styryle FM, qui révèlent le chiffre d&#39;affaires de la membrane. Des protocoles classiques pour l&#39;utilisation de colorants FM ont été conçus pour l&#39;analyse suivante neurones stimulée (évoqué) l&#39;activité synaptique. Récemment, les protocoles sont devenues disponibles pour l&#39;analyse des signaux FM qui accompagnent les activités synaptiques plus faibles, tels que les événements spontanés ou décoratifs synaptiques. L&#39;analyse de ces petits changements dans les signaux FM nécessite que le système d&#39;imagerie est suffisamment sensible pour détecter de petites variations de l&#39;intensité, pour l&#39;instant que les changements d&#39;artefact de grande amplitude sont supprimées. Nous décrivons ici un protocole qui peut être appliquée à évoqué, spontanée, et les activités synaptiques miniatures, et en utilisant des neurones hippocampiques en culture, par exemple. Ce protocole comporte également un moyen d&#39;évaluer le taux de photoblanchiment des colorants FM, comme il s&#39;agit d&#39;une importantesource d&#39;artefacts lors de l&#39;imagerie de petits changements dans l&#39;intensité.

A titre d&#39;exemple, nous montrons des résultats représentatifs pour le cours du temps de décoloration des vésicules synaptiques (figure 4). Neurones hippocampiques en culture ont été colorées avec FM4-64, en utilisant l&#39;activité synaptique spontanée (étape 2.3) et lavées avec une solution sans colorant (solution de rinçage 2). L&#39;imagerie montre le cours initial de temps de décoloration utilisant activité spontanée (étape 5.3) (partie initiale de la ligne continue, la figure 4A).</stro...

Nous décrivons l&#39;utilisation de colorants styryles FM à l&#39;image synaptique recyclage des vésicules dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles. Ce protocole peut être appliqué non seulement à évoquer, mais aussi spontané et activités synaptiques miniatures. Le protocole élargit le choix des événements synaptiques qui peuvent être évaluées de manière efficace.

Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec le rouge FM colorant fluorescent 4-64 pour mesurer le taux de libération des vésicules présynaptiques dans les cultures de neurones hippocampiques.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

Colorants FM ont été d'une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d'autres, en boutons synaptiques.

Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

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Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

Cette vidéo présente un protocole permettant d’étudier le recyclage des vésicules synaptiques aux jonctions neuromusculaires chez des larves de drosophile exprimant la channelrhodopsine à l’aide d’un colorant fluorescent. La lumière bleue active les channelrhodopsines, provoquant un afflux de calcium et une exocytose des vésicules synaptiques. Le colorant s’intègre dans les membranes neuronales et est internalisé pendant l’endocytose, ce qui entraîne une fluorescence accrue. Une stimulation...

Analyse du recyclage des vésicules synaptiques et de l’absorption de colorant fluorescent chez les larves de drosophile

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

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FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

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Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

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Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

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Découvrez l'imagerie du recyclage des vésicules synaptiques avec les colorants FM styryl dans les terminaisons nerveuses. Cette méthode permet d'évaluer les activités synaptiques évoquées et spontanées pour mieux comprendre la transmission neuronale.

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