2.3: PCR : réaction de polymérisation en chaîne

La réaction en chaîne par polymérase ou PCR est une méthode largement utilisée pour amplifier les fragments d'ADN. La PCR utilise une répétition de thermocycles, à savoir une succession de chauffage et de refroidissement de la réaction par le biais de trois températures distinctes appelées: dénaturation, hybridation et élongation.

La réaction en thermocycles commence lorsque les réactifs de la PCR sont mis dans une machine thermocycleur, qui est programmée pour chauffer et refroidir précisément la réaction.

Le cycle de la PCR commence avec la dénaturation, qui a lieu durant 20 à 30 secondes à 95°C, bien au-dessus de la température de fonte de l'ADN. La température de fonte de l'ADN est un état où la moitité de l'ADN est un double brin en hélice et l'autre est un simple brin à enroulement aléatoire. La température de dénaturation est bien au-delà de la température de fonte, en vue d'assurer que toutes les liaisons hydrogènes entre les paires de base complémentaires soient rompues laissant uniquement des ADN simples brins. Les simples brins appariés sont appelés les brins sens et anti-sens. La séquence du sens, ou brin codant, est identique à la séquence de l'ARNm, qui va finalement coder une protéine. Donc, il s'agit du brin sens lorsque, en lisant de gauche à droite, il commence avec le phosphate 5' et finit avec l'hydroxyle 3'. Le brin anti-sens est aussi appelé brin complémentaire et commence avec l'hydroxyle 3' et finit avec le phosphate 5' en lisant de gauche à droite.

Dans la deuxième étape, l'hybridation, les petits morceaux d'ADN, appelés amorces, qui sont spécifiques aux brins sens ou anti-sens se lient par des liaisons hydrogènes. L'amorce qui se lie à un brin anti-sens et qui a la même séquence que le brin sens est l'amorce de transfert ou de sens. L'amorce qui se lie au brin sens et qui a une séquence inverse et complémentaire au brin sens est l'amorce inverse ou anti-sens. En fonction de la longueur des amorces utilisées, la température d'hybridation pour cette étape est habituellement 3 à 5 °C en-dessous de la plus basse des températures de fonte de vos deux amorces. L'hybridation tend à apparaitre entre 50 et 65°C et dure 20 à 40 secondes.

Une fois que les amorces se lient à l'ADN, elles amorcent la réaction par la création d'un goupe de terminaison hydroxyle 3', auquel un polymérase, un enzyme qui réplique l'ADN, va se lier.

L'étape suivante, appelée élongation, a lieu à 72°C, qui est la température optimale pour l'activité des polymérases. Une fois lié, le polymérase commence à ajouter des nucléotides triphosphates libres, ou dNTP, à la fin des amorces, un par un, dans la direction 5' vers 3' pour fabriquer le double brin d'ADN.

Une fois que l'élongation est finie, le cycle suivant commence. Dans le cycle suivant, les amorces vont se lier à des brins simples d'ADN formés par l'élongation précédente. Le court fragment que vous essayez d'amplifier, l'amplicon, sera finalement formé, lorsque le polymérase se sera étendu de l'amorce de transfert sur un brin qui fut généré par amplification jusqu’à l'amorce inverse, ou vice versa. Une fois généré, la quantité d'amplicon va croitre exponentiellement grâce aux cycles suivants. En fonction du but de votre réaction, 20 à 40 cycles seront nécessaires.

Pour de longs amplicons, une étape finale d'élongation est généralement exécutée à 72°C, pendant 5 à 15 minutes, en vue d'assurer que tout l'ADN soit double brin. Généralement, une étape finale de maintien à 4°C est programmée dans le thermocycleur, en tant qu'étape préventive pour assurer que l'ADN reste stable, jusqu'à ce qu'il soit retiré du thermocycleur.

La réaction de PCR requiert plusieurs réactifs clés. Le premier est l'ADN modèle, qui est l'échantillon d'ADN à partir duquel votre fragment va être amplifié. Ensuite il y a vos amorces, qui sont les morceaux d'ADN ou oligonucléotides qui amorcent la réaction de polymérase.

Il y a plusieurs considérations importantes qui doivent être prises en compte lorsque vous choisissez vos amorces. D'abord, elles doivent être complémentaires aux régions 5' et 3' de votre échantillon d'ADN qui encadrent la séquence que vous voulez amplifier. Deuxièmement, elles doivent être longues de 15 à 30 paires de base et contenir environ 50% de guanines et de cytosines. Troisièmement, les températures de fonte des deux amorces devraient être au-dessus de 50°C et dans un intervalle de un à deux degrés l'une de l'autre, de manière à ce qu'elles puissent se lier efficacement à la même température d'hybridation. Quatrièmement, elles ne peuvent pas être complémentaires l'une à l'autre et former des dimères d'amorces. Et cinquièmement, elles ne devraient pas contenir de structure secondaire, formée par auto-hybridation avec l'une des amorces.

En plus des amorces et de l'ADN modèle, l'ADN polymérase est essentielle pour la réaction de PCR. L'enzyme la plus communément utilisée en PCR est la Taq polymérase, qui est une enzyme thermostable isolée de la bactérie Thermus aquaticus qui prolifère lors de printemps chauds. La Taq polymérase peut résister à des températures supérieures à 90°C.

Les dinucléosides triphosphates ou dNTPs, qui inclueront les paires de base dans les brins de croissance, doivent aussi être ajoutés à la réaction. Un tampon de réaction, qui maintient le pH et contient d'importants ions comme le manganèse, le magnésium et le potassium, est aussi un composant nécessaire qui stabilise la réaction et fournit des cofacteurs importants à l'enzyme polymérase. Comme toutes les réactions, la PCR a besoin d'un solvant, c'est pourquoi de l'eau de qualité PCR, qui est exempte d'ions qui peuvent inhiber la réaction, est utilisée.

Avant de commencer la PCR soyez sûr que l'environnement de travail est propre pour éviter toute contamination. Des gants doivent toujours être portés.

Pour vous aider à suivre la trace des composants de la réaction dont vous aurez besoin, préparez un tableau avec les volumes de réactifs et les concentrations pour chacun de vos échantillons, en incluant ceux de contrôle. Pour ce qui est des volumes, une réaction typique devrait contenir 5μL de tampon de réaction 10X, 4μL de MgCl2 à 25 mM, 1μL de dNTP à 10 mM, 2μL d'amorces transfert et inverse à 50 ng/μL, et 0,3μL de Taq polymérase à 5 U/μL. Vous devez ajouter assez d'ADN modèle pour qu'il y ait 100ng présents dans cette réaction. Finalement, la plupart des réactions de PCR sont réalisées dans un volume total de 50μL. De ce fait, un volume d'eau de qualité PCR doit être ajouté pour assurer que le volume total soit en effet de 50μL.

Une fois que votre réaction est planifiée sur papier, rassemblez vos réactifs dans la glace.

Ensuite, ajoutez vos réactifs au tube de PCR. Ajoutez d'abord l'eau, ensuite votre modèle, vos amorces, le tampon, le chlorure de magnésium, les dNTPs et enfin les Taq polymerase, et mélangez minutieusement.

Après que votre réaction est mise en place, mettez votre échantillon dans le thermocycleur et commencez le programme de PCR. Brièvement, les parties de la machine consistent en un thermobloc, où le tube (ou plat de PCR) est inséré et sujet à des changements de température précis; Un couvercle chauffant, qui empêche la condensation afin qu'il n'y ait pas de perte de l'échantillon et une interface avec un écran pour programmer les températures de la PCR et la durée des cycles. Paramétrez toujours votre programme avant de mélanger les réactifs.

Une fois que le thermocycleur a fait son travail, sortez votre réaction et vérifiez les produits de la PCR avec une électrophorèse sur gel. Si la PCR est un succès, vous devriez voir l'amplicon à la taille correcte de paires de base.

Voici quelques astuces utiles pour travailler avec une PCR. Lorsque vous essayez d'amplifier le même produit de PCR depuis un nombre de modèles différents vous aurez donc beaucoup de réactions différentes à mettre en place, il est alors utile d'augmenter la taille de la réaction pour créer un mélange principal. Le mélange de PCR principal (ou maître) est un grand volume de mélange de tous les réactifs partagés par vos échantillons, qui est plus tard distribué dans plusieurs tubes de réaction.

La plupart des réactions de PCR commencent avec une étape initiale de dénaturation, qui a lieu à 95°C pendant 1 à 9 minutes. Cette étape assure que tous les contenus du modèle sont bien dénaturés en simple brin pour le premier cycle d'amplification.

Il est souvent désirable d'utiliser une paillasse spécifique à PCR (ou un meuble PCR) quand le risque de contamination de votre échantillon est grand. Pour vérifier s'il y a eu contamination il faut mettre en place un contrôle négatif, qui n'a pas de modèle d'ADN dedans et ne devrait pas produire de produit dans le gel d'ADN.

La PCR doit souvent être optimisée par l'ajustement des températures, de la concentration en chlorure de magnésium, ou par l'essai de nouvelles amorces. Une fois que vous avez votre PCR en cours, c'est une bonne idée de toujours exécuter un échantillon de contrôle positif, que vous savez qui va produire un produit.

De nombreuses variations et applications de la PCR existent pour une variété d'objectifs.

Une variation de la PCR, la PCR à départ chaud, implique le retrait de la polymérase hors de la réaction jusqu'après la première étape de dénaturation, polymérase qui empêche l'amplification non-spécifique qui pourrait avoir lieu avant le lancement des cycles.

La PCR peut aussi être modifiée pour amplifier simultanément des séquences multiples d'ADN par l'emploi de multiples amorces dans une seule réaction de PCR appelée PCR multiplexe.

En combinaison avec des sondes oligonucléotidiques fluorescentes, la PCR peut en fait devenir une technique qui peut mesurer les niveaux relatifs ou absoluts de l'expression de gènes, ou combien d'ARNm est produit pour un gène donné ou groupe de gènes. Cette méthode est référencée comme qPCR.

La PCR peut aussi être utilisée pour déterminer la présence d'une séquence particulière d'ADN dans un organisme. Cette procédure est référencée comme génotypage. Par exemple, le génotypage peut être utilisé pour déterminer l'authenticité d'échantillons de poissons en tentant de voir si une séquence spécifique d'espèce est présente dans l'échantillon. Le génotypage est aussi utilisé en analyses médico-légales pour déterminer si l'ADN trouvé sur une scène de crime correspond à un suspect.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la PCR. Dans cette vidéo nous avons vu ce qu'est une PCR et comment elle fonctionne, les nombreux composants de la réaction de PCR, le mécanisme par lequel la PCR peut amplifier l'ADN et de nombreuses variations et applications de cette technique hautement utile. Merci de nous avoir regardé!