Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale

L’objectif global de l’expérience suivante est de fournir une méthode nanométrologique pour surveiller et quantifier l’absorption cellulaire des nanotubes de carbone dans un nombre statistiquement pertinent de cellules. Pour ce faire, les cellules sont d’abord traitées avec des nanotubes de carbone dispersables dans l’eau, qui pénètrent dans les cellules en fonction de la concentration. Ces nanotubes de carbone sont finalement marqués avec un marqueur fluorescent.

Ensuite, après la fixation, chaque cellule est imagée dans les canaux en fond clair, en fond sombre et fluorescents d’un flux d’imagerie multispectral. Cytomètre. Pour visualiser la distribution des nanotubes de carbone et le niveau d’absorption de la lumière, de lumière diffusée et de fluorescence, le marquage des nanotubes induit dans chaque cellule sur une base pixel par pixel. En fin de compte, l’absorbance et la diffusion intrinsèques de la lumière à l’intérieur des cellules permettent la localisation et la quantification des nanotubes de carbone.

Cette méthode peut donc aider à répondre à de nouvelles questions dans les domaines de la nanotoxicologie et de la nanomédecine, telles que l’impact et le devenir des matériaux à base de carbone dans les cellules vivantes, ainsi que le potentiel en pot des nanotubes de carbone en tant que système d’administration de médicaments. Ensuite, sonicez les nanotubes dans une eau de bain à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, diluez les nanotubes à des concentrations de 0, 10, 20 et 50 microgrammes par millilitre dans un milieu complet, puis incubez deux millilitres de chaque dilution avec les cellules d’intérêt dans 1 plaque de 25 centimètres carrés par dilution à 37 degrés Celsius après 20 heures, retirez le milieu d’incubation de chaque plaque et rincez les cellules marquées en nanotubes de carbone avec du PBS.

Après le lavage, la trypsine fixe les cellules de chaque plaque, puis les remet en suspension dans un milieu DMEM complet. Ensuite, transférez chaque échantillon dans des tubes de faucon individuels de 15 millilitres, puis faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 200 fois G et à température ambiante. Remettre chaque pastille en suspension dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Après la fixation, faites tourner à nouveau les cellules vers le bas et remettez en suspension chaque échantillon granulé à 15 fois 10 à la cinquième cellule dans 150 microlitres de PBS. Ensuite, filtrez les échantillons à travers des passoires individuelles à mailles de 50 microns pour acquérir des images des cellules avec un flux d’images. Cytomètre en flux d’imagerie multispectrale.

Tout d’abord, sélectionnez un grossissement adapté, puis imagez les échantillons d’intérêt. Utilisez un laser de 685 nanomètres pour imager le fond noir et régler le cytomètre en flux. Canal numéro six pour collecter l’émission en champ noir à un passe-bande de 745 à 800 nanomètres.

Imagez les échantillons dans les canaux en fond clair numéro un et en fond noir numéro six pour l’analyse d’image. Tout d’abord, créez un diagramme à points paramétrique avec un rapport hauteur/largeur par rapport à la surface de la cellule. Cela permet de distinguer les cellules uniques qui ont une aire standard et un rapport d’aspect proche de un des événements multicellulaires, qui ont une grande surface et un petit rapport d’aspect, et des débris qui présentent une zone extrêmement petite.

Après avoir utilisé les images de cellules pour vérifier que les cellules individuelles ont été correctement sélectionnées, configurez un diagramme à points biparamétrique pour les cellules marquées à nanotubes de carbone à contraste élevé en traçant le contraste par rapport à la racine carrée moyenne du gradient pour permettre l’exclusion de la racine faible, du gradient carré moyen, des cellules non focalisées à faible contraste et de la sélection des cellules dans le plan focalisé. Ensuite, utilisez l’outil Trouver la meilleure fonctionnalité pour déterminer le paramètre qui fournit la meilleure séparation statistique entre les cellules étiquetées et non étiquetées. Par exemple, pour cette expérience représentative, la caractéristique d’objet de pixel moyen est la plus appropriée.

Ensuite, tracez ce paramètre par rapport à la fréquence normalisée pour tracer un histogramme permettant de quantifier les nanotubes absorbés par les cellules à chaque concentration expérimentale. Tracez maintenant un graphique biparamétrique pour l’objet pixel moyen en fond clair en fonction de l’intensité en fond sombre. Pour vérifier la corrélation entre ces deux paramètres, la quantification des nanotubes est également évaluée en créant sur les cellules des images car les nanotubes de carbone apparaissent comme des taches sombres intenses. Dans le canal Brightfield, sélectionnez une plage restreinte de pixels de faible intensité, par exemple, entre zéro et 533 pour créer le masque de seuil, L’un qui s’adapte précisément aux nanotubes sombres pour créer un deuxième masque est désigné Masque deux pour visualiser les nanotubes qui apparaissent brillants dans le canal du champ sombre.

Sélectionnez une plage de pixels à haute intensité. Par exemple, une plage de 150 à 4 095 a été choisie pour cette expérience. Ensuite, en utilisant l’aire du masque de fond clair un ou du masque de fond noir deux, établissez un graphique à points pour quantifier l’internalisation relative des nanotubes.

Par exemple, tracez la zone du canal six correspondant au champ sombre avec le masque deux par rapport à la zone du canal un, correspondant au champ clair avec le masque un. Après avoir déterminé la corrélation linéaire entre le masque un et le masque deux, visualisez les nanotubes dans le cytoplasme en créant d’abord un masque de la cellule entière, puis en érodant le masque. Désormais noté érode M 0 1 7 par sept pixels pour voir l’intérieur de la cellule.

Pour visualiser les nanotubes de carbone à l’intérieur de la membrane cellulaire, utilisez l’équation booléenne M zéro un et non éroder M 0 1 7. C’est-à-dire le masque de la cellule entière, soustrait de l’intérieur de la cellule pour créer un masque de la membrane uniquement pour évaluer les pixels sombres sur la membrane. Appliquez le masque à fond clair sur le masque à membrane.

Appliquez tous ces masques à plusieurs cellules à la fois pour confirmer une distinction entre les échantillons marqués et non étiquetés. Sélectionnez ensuite les pixels noirs sur la membrane à l’aide de l’outil de zone de caractéristique pour quantifier les nanotubes de carbone sur la membrane cellulaire. Enfin, pour distinguer les nanotubes de carbone qui ont été internalisés de ceux qui ont été absorbés par la membrane.

Tracez la zone noire de la membrane contre la zone noire de la cellule entière. Une fois que tous les tracés ont été créés pour une condition expérimentale, créez un modèle de rapport statistique. Enregistrez le modèle en tant que fichier A ST et regroupez tous les fichiers de données.

Le dispositif de flux d’images produit plusieurs images haute résolution de chaque cellule du cytomètre en flux, y compris les canaux en fond clair, en fond noir et en fluorescence, comme démontré ici avec trois cellules différentes marquées à des nanotubes. Les superpositions de ces canaux sont également illustrées. La présence de nanotubes de carbone induit des changements à la fois dans le contraste et le gradient des cellules marquées par rapport aux cellules non marquées.

Ainsi, la création d’un graphique à points biparamétrique est importante pour la sélection des cellules de focus. Les cellules non focalisées en jaune peuvent être discriminées par leur faible contraste et leur faible gradient quadratique moyen, indépendamment de la présence ou de l’absence de marquage des nanotubes. Les cellules focales non marquées présentent également un faible contraste, mais présentent une racine élevée, un gradient carré moyen lorsque les cellules focales sont marquées avec des nanotubes, cependant, les cellules présentent un profil de gradient carré moyen à contraste élevé, faible racine.

Les nanotubes de carbone internalisés sont facilement distingués, en particulier dans le canal Brightfield, où ils apparaissent comme des taches sombres intenses, dont les zones augmentent avec la concentration de nanotubes. Lorsque les signaux de pixels moyens des images en fond clair sont analysés, une quantification relative de l’absorption des nanotubes peut être déterminée. Par exemple, ces histogrammes démontrent l’augmentation significative de l’absorption des nanotubes qui se produit à chaque augmentation de la concentration de marquage des nanotubes, car il est démontré que la quantification des nanotubes de carbone est également possible grâce à l’utilisation de masques appliqués soit sur une plage restreinte de pixels sombres dans une image en champ clair, soit sur les pixels de haute intensité dans le champ sombre. correspondant aux zones où les nanotubes sont présents.

Le tracé de la zone de ces masques permet ensuite de quantifier davantage l’absorption de nanotubes de carbone. De plus, la corrélation entre les taches dans les images en champ clair et en fond sombre peut être évaluée en traçant l’intensité du champ sombre en fonction du signal de pixel moyen en champ clair, ou en traçant la zone du masque dans le champ clair en fonction de la zone dans le champ sombre. Dans ces deux figures suivantes, des analyses des nanotubes de carbone localisés à l’intérieur de la cellule sont présentées.

Ces premières images montrent les différents masques qui ont été créés. Notez que la robustesse des masques de localisation basés sur l’érosion du masque de cellule par défaut doit être vérifiée visuellement sur la collection des cellules étiquetées et non étiquetées. Comme nous venons de le démontrer dans ces diagrammes à points, la surface totale des points noirs sur la membrane cellulaire par rapport à celle de la cellule entière a été tracée pour déterminer le score d’internalisation.

Pour les cellules qui ont été incubées pendant 20 heures à 37 degrés Celsius par rapport aux cellules qui ont été incubées pendant deux heures à quatre degrés Celsius à quatre degrés Celsius, les nanotubes de carbone se trouvent principalement situés sur la membrane, tandis qu’à 37 degrés Celsius, les nanotubes de carbone sont internalisés dans plus de 90 % des cellules. La fluorescence des nanotubes de carbone n’est pas un bon indicateur de l’internalisation des nanotubes de carbone en raison d’une corrélation trop faible entre les taches fluorescentes et les taches dans les canaux de champ clair et sombre. En effet, la corrélation entre l’intensité fitzy et le pixel moyen en champ clair indique un coefficient de corrélation de Pearson de moins 0,2.

Comme le démontrent ces images, le signal fluorescent ne correspond pas de manière fiable aux points noirs en champ clair, aux nanotubes de carbone, au confinement et à l’agrégation dans les lysosomes intracellulaires qui ont partiellement éteint le signal fluorescent. En revanche, les nanotubes dispersés peuvent donner un signal fluorescent plus fiable après son développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des nanotechnologies et de la nanomédecine pour explorer l’interaction des cellules vivantes avec des nanomatériaux à base de carbone ou tout nanomatériau à haute capacité d’absorption et de diffusion de la vie à l’aide d’une méthode de cytométrie statistique à haut débit.