La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'effet cytotoxique du dérivé philanthotoxique PJ 34 pendant la mitose dans des cellules cancéreuses somatiques humaines multicentriques. Ceci est réalisé en marquant les centrosomes avec la tubuline gamma GFP et les chromosomes avec l'histone H two B read par transfection. L'objectif de la transfection est de permettre le traçage de la migration et du regroupement des centrosomes ainsi que de l'agencement des chromosomes pendant la mitose dans des cellules cancéreuses somatiques multicentriques vivantes.

En guise de deuxième étape, certaines des cellules transfectées sont exposées au PJ 34, une molécule qui agit comme un agent supplémentaire d'élimination des centrosomes excédentaires. Ensuite, les cellules cancéreuses vivantes transfectées sont analysées par microscopie confocale afin de capturer les événements survenant pendant la mitose, associés à la migration des centrosomes et des chromosomes. L'analyse de séquences d'images réorganisées montre les effets d'élimination et cytotoxiques du traitement par le PJ 34 sur les cellules cancéreuses durant la mitose, basée sur l'imagerie confocale de cellules vivantes.

Les implications de cette technique s'étendent à une thérapie anticancéreuse ciblée, éliminant exclusivement les cellules cancéreuses autosomiques pendant la mitose. La démonstration de cette technique sera réalisée par notre collaborateur, le Dr Asher Castillo du Centre de recherche sur le cancer du Centre médical Sheba, et le Dr Leonid Middleman de l'unité d'imagerie de la faculté de médecine Sacko de l'Université de Telaviv. Pour préparer les cellules de cancer du sein M-D-A-M-B 231 pour l'imagerie confocale en direct, ensemencez deux fois 10 à la puissance 5 cellules dans des boîtes de culture de 35 millimètres de diamètre à fond en verre revêtu de poly-L-lysine, dans deux millilitres de milieu complet, puis incubez à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

La culture cellulaire est prête pour la transfection lorsqu'elle atteint une confluence de 60 à 70 %. Les cellules seront transfectées avec deux plasmides, l'un codant pour la tubuline gamma, GFP pour la détection fluorescente des centrosomes, et l'autre codant pour l'histone rouge afin de détecter les chromosomes par fluorescence. La transfection est réalisée à l'aide du réactif de transfection liposomal jetPI, conformément au protocole du fabricant. Laver les cellules une fois avec du PBS, puis remplacer le milieu cellulaire par deux millilitres de DMEM chaud sans suppléments. Ajouter délicatement le mélange de transfection aux cellules dans le DMEM, puis remettre les cellules dans l'incubateur pendant huit heures. Après huit heures.

Remplacer le DMEM par deux millilitres de milieu complet et incuber les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures. Après la transfection, remplacer le milieu par deux millilitres de milieu complet contenant 20 micromolaire de PGA 34.

Incuber les cellules pendant 18 heures supplémentaires avant l'imagerie confocale en direct. Voici les paramètres techniques des réglages du scanner pour l'imagerie confocale en direct. Mode de balayage XYZT, diaphragme ajusté à 1,00 airy, zoom 3,5, résolution huit bits, laser DPSS 561 nanomètres, laser visible argon 488 nanomètres, laser hélium-néon visible 633 nanomètres.

Objectif H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63 fois 1,40 à immersion huile UV, ouverture numérique 1,4. Vitesse de balayage, 700 hertz et indice de réfraction 1,52. Soumettre les cellules à une imagerie confocale en temps réel pendant au moins 16 heures dans une chambre d'imagerie, en maintenant les cellules à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius.

L'efficacité de la transfection sera évaluée par microscopie à fluorescence. Commencez cette procédure en semant deux fois dix puissance cinq cellules MDA MB 231 dans une plaque de six puits contenant un lambeau par puits, en deux millilitres de milieu complet. Transfectez les cellules de la même manière qu'auparavant en utilisant le réactif de transfection liposomal jet PI, conformément au protocole du fabricant.

36 heures après la transfection. Retirer le milieu de chaque puits après avoir lavé les cellules transfectées fixées sur un lamelle avec du PBS. Fixer les cellules par une incubation dans une solution froide de méthanol et d'acétone en rapport un pour un pendant sept minutes à moins 20 degrés Celsius.

Après sept minutes, aspirez la solution de fixation et laissez sécher la lamelle avec les cellules montées dans une hotte chimique pendant 30 minutes. Ensuite, appliquez un réactif antifade à base d'or prolongé avec du DPI et laissez sécher la lamelle à l'abri de la lumière pendant six heures. Examinez la préparation au microscope à fluorescence et calculez le pourcentage de cellules transfectées présentant des signaux rouge et vert.

À partir de la population totale de cellules, le pourcentage de transfection souhaité est d'environ 20 à 40 % lorsque 100 à 200 cellules sont comptées. Pour commencer cette procédure, sémez deux fois dix puissance cinq cellules cancéreuses du sein M-D-A-M-B 231 sur des lamelles en verre dans une plaque de six puits contenant deux millilitres de milieu complet. Ajoutez le PJ 34 au milieu et incubez les cellules pendant la période requise.

Une fois l'incubation terminée, laver les lamelles une fois avec du PBS et fixer les cellules par une incubation dans une solution de méthanol et d'acétone glacés en rapport un pour un, pendant sept minutes à moins vingt degrés Celsius. Ensuite, aspirer la solution de fixation et laisser sécher les lamelles dans une hotte chimique pendant 30 minutes. Laver les lamelles une fois avec du PBST afin de permeabiliser les membranes cellulaires, puis bloquer les cellules avec 10 % de sérum de baudet normal dans du PBST pendant une heure à température ambiante.

Préparez le premier mélange d'anticorps en ajoutant les anticorps primaires antitubuline et anti-gamma tubuline à la solution de blocage et en vortexant. Appliquez ensuite 100 microlitres de ce mélange d'anticorps pour chaque lame sur le couvercle d'une plaque à six puits. Retournez délicatement la lame et placez-la doucement à l’envers sur la goutte d’anticorps, puis incubez pendant deux heures.

Ajouter la température ambiante. Cela colorera les fuseaux et les centrosomes. Remettre les lamelles dans les puits et laver les cellules trois fois avec du PBST.

Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires, LOR 488 et LOR 568, une goutte par lamelle sur une plaque de six puits. Placez ensuite les lamelles face vers le bas sur les gouttes d'anticorps, incubez pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation avec les anticorps secondaires, replacez les lamelles dans les puits et lavez les cellules trois fois avec du PBST.

Enfin, montez les lamelles à l'aide du réactif antifade prolongé gold avec une incubation prolongée pendant la nuit à température ambiante à l'abri de la lumière pour les faire sécher avant d'observer les cellules fixées par microscopie confocale. PJ 34 est un phantrodine stable et hydrosoluble qui, dans des études antérieures, s'est révélé éliminer de manière exclusive les cellules cancéreuses possédant des centrosomes multiples, sans altérer les cellules normales en cours de mitose dotées de deux centrosomes et de fuseaux bifocaux. Dans cette étude, l'activité cytotoxique de PJ 34 a été examinée à l'aide de cellules vivantes humaines de cancer du sein M-D-A-M-B 231, qui présentent une forte fréquence de centrosomes supplémentaires.

Les cellules ont été transfectées avec la GFP de la tubuline gamma afin de marquer les foyers de tubuline gamma, et avec l'histone H deux B rouge pour marquer les chromosomes. L'analyse par imagerie confocale des cellules M-D-A-M-B 231 pendant au moins 16 heures a révélé un regroupement bifocal des centrosomes, représentant un regroupement bifocal d'éléments centrosomiques supplémentaires dans la majorité des cellules en mitose, comme illustré dans les courtes vidéos suivantes. Cette première vidéo montre une cellule vivante choisie au hasard pendant la mitose, les centrosomes étant marqués en vert par la tubuline gamma.

La GFP dans la deuxième vidéo illustre le réarrangement chromosomique au cours de la mitose, visualisé dans une cellule M-D-A-M-B 231 choisie aléatoirement et transfectée avec l'histone H two B rouge. Cette troisième vidéo montre une cellule MDA MB 231 en cours de mitose, où les foyers bifocaux des extrafoci centrosomiques regroupés sont marqués en vert et les chromosomes en rouge. En revanche, des centrosomes non regroupés ainsi qu'un agencement anormal des chromosomes ont été détectés dans des cellules M-D-A-M-B 231 vivantes et transfectées, incubées avec 20 micromolaire de PJ 34, et la mitose dans ces cellules s'est terminée par une mort cellulaire, comme illustré dans ce film.

Cette documentation en temps réel de la mort cellulaire pendant la mitose soutient fortement une corrélation positive précédemment établie entre le nombre de cellules malignes humaines présentant des fuseaux multipolaires en mitose et le pourcentage de mort cellulaire dans les cellules incubées avec le PJ 34. Étant donné que le PJ 34 agit comme un inhibiteur puissant de la PARP une, la possibilité qu'une inhibition de la PARP une provoque une mort cellulaire associée à un échec mitotique a été étudiée. L'activité cytotoxique de concentrations croissantes de PJ 34 a été testée sur des fibroblastes embryonnaires de souris normaux et déficients en PARP une, et les résultats sont présentés ici.

Le graphique de gauche montre le pourcentage de fuseaux multifocaux calculé dans les fibroblastes embryonnaires de souris normaux, représentés par la ligne noire, et dans les fibroblastes déficients pour PARP1, représentés par la ligne grise, incubés pendant 48 heures avec PJ 34 aux concentrations indiquées. Ces pourcentages ont été calculés à partir de 20 fuseaux au total observés lors de trois expériences différentes. Le graphique de droite montre la survie des fibroblastes embryonnaires de souris normaux et déficients pour PARP1 incubés pendant 72 heures avec 20 micromolaire.

La survie des cellules PJ 34 a été évaluée par la production d'ATP cellulaire. Les valeurs moyennes de quatre mesures pour chaque lignée cellulaire, réalisées lors de trois expériences différentes, sont présentées. Ces résultats montrent que les doses de PJ 34 induisent de manière dépendante des fuseaux altérés et la mort cellulaire dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients pour PARP-1, mais pas dans les fibroblastes normaux.

Le fait que le PJ 34 ait éradiqué les cellules déficientes en PARP1 malgré leur déficience en PARP1, ainsi que la corrélation entre la formation de fuseaux multifocaux et l'éradication cellulaire dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients en PARP1 incubés avec du PJ 34 à des concentrations supérieures à celles nécessaires pour l'inhibition de PARP1, n'est pas compatible avec un lien de causalité entre le désembrouillement des centrosomes dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients en PARP1 et l'inhibition de PARP1. Ces images de microscopie confocale montrent des fibroblastes embryonnaires de souris normaux et déficients en PARP1 en mitose, fixés, perméabilisés et marqués immunologiquement pour la tubuline alpha et gamma, qui ont coloré leurs fuseaux en vert et leurs centrosomes en rouge respectivement. Les chromosomes ont été marqués en bleu avec le réactif DPI.

Les cellules ont été soit non traitées, soit incubées avec du PJ 34 pendant 48 heures aux concentrations indiquées. Des foyers de g-tubuline non regroupés, des fuseaux altérés et une mort cellulaire ont été observés dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients pour PARP1 traités avec le PJ 34, mais pas dans les fibroblastes embryonnaires de souris normaux traités avec le PJ 34. Certains des cultures cellulaires examinées ont été traités avec deux puissants inhibiteurs non aromatiques de PARP1, l'ABT-888 et l'AG-01469, qui inhibent l'activité enzymatique de PARP1.

Aucun des inhibiteurs de PARP1 testés n'a altéré les fibroblastes embryonnaires de souris normaux aux concentrations inhibant l'activité de PARP1. Ces inhibiteurs de PARP1 n'ont pas non plus affecté le regroupement des centrosomes dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients en PARP1. Ces résultats indiquent que l'activité cytotoxique de PJ 34 sur les cellules présentant plusieurs centrosomes n'était pas partagée par d'autres inhibiteurs puissants de PARP1 une fois maîtrisés.

Cette technique peut être utilisée dans d'autres types de cellules vivantes pour diverses propositions.