Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines
26 septembre 2013
En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.
L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules souches dérivées du tissu adipeux à partir de la graisse obtenue sous la forme d’une lipo-aspiration. Ceci est accompli en retirant d’abord la solution chirurgicale et en lavant l’aspiration des globules rouges contaminants. La deuxième étape consiste à libérer les cellules souches par digestion enzymatique de la lipo-aspiration lavée avec de la collagénase.
Ensuite, les cellules libérées sous la forme d’une fraction vasculaire stromale ou SVF sont collectées par centrifugation. La dernière étape consiste à retirer le surnageant et la plaque, les cellules SVF pour la sélection et la culture des ASC adhérents. Finalement, l’induction in vitro de ces ASC cultivées vers l’os, la graisse et le cartilage.
Les lignées peuvent être utilisées pour confirmer la présence de ces cellules au sein de la culture en plus de confirmer leur multipotentialité. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à cause de la logistique liée au travail avec de grands volumes de lipo-aspirine avant la récolte des cellules. Préparez une solution de collagénase stérile et un milieu de contrôle stérile.
Récupérez lippo aspiré dans un récipient d’aspiration. Décantez soigneusement l’aspiration lippo dans un haut-parleur en verre stérile d’un litre. Lorsque les couches d’aspiration lippo se sont séparées par gravité, aspirez la couche d’huile supérieure si elle est présente.
Retirez également le fond inate. Évaluez le volume de la couche de tissu adipeux résultante. Ajouter un volume égal de XPBS stérile et mélanger avec la pipette utilisée pour l’aspiration.
Lorsque les deux couches se sont déposées, aspirez l’inate à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Continuez à laver la fraction de tissu adipeux avec du PBS jusqu’à ce que la couche adipeuse ait une couleur or jaune. Aspirez l’inné une dernière fois, en laissant la fraction de tissu adipeux.
Dans le haut-parleur en verre. Laissez les couches d’aspiration de lippo reposer pendant cinq minutes après le dernier lavage et avant l’aspiration finale. Dans une unité de filtration, préparez une solution de collagénase stérile.
Ajouter un volume égal à celui de la fraction adipeuse et du filtre stérile. Versez ensuite soigneusement la fraction adipeuse lavée dans la solution de collagénase et fermez bien le flacon. Ensuite, incubez le mélange adipeux de collagénase dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un léger tourbillon toutes les cinq à 10 minutes, évaluez la couche de tissu adipeux pour une apparence plus lisse au fur et à mesure que la digestion progresse et, si nécessaire, augmentez le temps de réaction pour dissoudre tous les morceaux de graisse solides.
Stérilisez l’unité de filtration contenant le mélange adipeux de collagénase digéré avec de l’éthanol à 70 % et remettez-le dans l’enceinte de biosécurité. Maintenant, pipetez des aliquotes de 25 millilitres de l’inate contenant la fraction vasculaire stromale dans des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres. Ajoutez 25 millilitres de milieu de contrôle dans chaque tube et laissez incuber à température ambiante pendant cinq minutes pour inactiver la collagénase.
Ensuite, centrifugez pendant 10 minutes à 1 200 fois G pour recueillir la fraction vasculaire stromale sous forme de pastille dans l’enceinte de biosécurité. Aspirez le surnageant de chaque tube. Assurez-vous que la couche supérieure d’huile et tous les adipocytes flottants sont aspirés avec ce surnageant.
Ensuite, combinez les pastilles SVF dans un tube de centrifugation en utilisant 30 millilitres de média conditionné et répartissez-les également sur deux nouveaux tubes de centrifugation de 50 millilitres après centrifugation, aspirez les surnageants des deux granulés. Si la lyse des globules rouges est souhaitée, ces deux pastilles peuvent chacune être remises en suspension dans 10 millilitres d’un tampon de lyse des globules rouges et incubées à température ambiante pendant 10 minutes. Après la centrifugation, aspirer les surnageants pour produire des granules de la fraction vasculaire stromale.
Combinez ces deux granulés dans un nouveau tube à centrifuger. À l’aide de cinq à 10 millilitres de média témoin, les grosses particules de tissu peuvent être filtrées à l’aide d’un filtre à mailles de 100 microns placé sur un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Maintenant, aliquote la fraction filtrée contenant les cellules souches adipeuses dans des boîtes de culture tissulaire.
Complétez ensuite chaque plat avec un volume de contrôle approprié. La culture médiatique. Pendant trois à quatre jours sans changement de milieu, les cellules aspirent la culture, le milieu et lont une fois les cellules avec du PBS stérile pour éliminer tous les globules rouges contaminants, puis reconstituent le milieu et continuent la culture lors de l’utilisation de cette enzyme manuelle pour l’isolement d’une fraction vasculaire stromale à partir d’un échantillon d’aspiration lippo de grand volume.
La population A SC cultivée qui en résulte est d’apparence relativement homogène et composée de cellules de type fibroblastes comme moyen de validation le plus populaire. L’induction in vitro de la population A SC à l’aide de conditions de culture définies entraîne leur différenciation en lignées mésodermiques, ectodermiques et endodermiques. Alors que le potentiel de la couche trigerminale in vitro a entraîné l’utilisation d’ASC pour une grande variété de systèmes modèles régénératifs.
La différenciation en cellules adipogènes, ostéogéniques et congéniques est généralement suffisante pour identifier l’A SC et confirmer sa multi-puissance. De plus, les ASC peuvent également être différenciées en cellules de lignées myogéniques squelettiques et myogéniques lisses de la lignée ectodermique ou en lignées de cellules hépatiques endodermiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une fraction vasculaire stromale des lipos.
Pour Turing, il s’agit d’un composant SC.
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Aperçu
Cet article décrit l'isolement de cellules souches dérivées des adipocytes (ASCs) à partir de lipoaspirats, en utilisant un protocole manuel de digestion enzymatique avec de la collagénase. Le processus comprend le lavage de l'aspirat, la digestion enzymatique et la culture des cellules pour des études ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Médecine régénérative
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) constituent une source prometteuse pour les thérapies régénératives.
- Les ASC peuvent se différencier en divers types cellulaires, notamment osseux, adipeux et cartilagineux.
- L'isolement des ASC à partir du tissu adipeux est essentiel pour leur utilisation en recherche et en thérapie.
- Des études antérieures ont établi des méthodes d'isolement des ASC, mais leur optimisation est en cours.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches adipeuses (ASC) à partir de lipoaspirats.
- Améliorer l'efficacité de l'isolement des ASC à des fins de recherche.
- Faciliter l'étude de la différenciation des ASC et de leurs applications thérapeutiques potentielles.
Méthodes utilisées
- Élimination de la solution chirurgicale et lavage du lipoaspirat.
- Digestion enzymatique du lipoaspirat lavé à l’aide de collagénase.
- Récupération de la fraction stromale vasculaire (SVF) par centrifugation.
- Ensemencement des cellules de la SVF pour la sélection et la culture des ASC adhérents.
Résultats principaux
- Isolation réussie des ASC à partir de lipoaspirats en utilisant le protocole décrit.
- Des ASC viables ont été obtenues et cultivées pour des études ultérieures de différenciation.
- La méthode a démontré une efficacité dans l'élimination des contaminants et la maximisation du rendement cellulaire.
- Les ASC ont montré un potentiel de différenciation en plusieurs lignées cellulaires in vitro.
Conclusions
- Le protocole de digestion enzymatique décrit est efficace pour l'isolement des ASC.
- Les ASC isolées peuvent être utilisées pour diverses applications en médecine régénérative.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer le potentiel complet des ASC dans des contextes thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) à partir de lipoaspirats fournit une source évolutible de cellules multipotentes pour la recherche en médecine régénérative à un stade précoce. Ce protocole permet la validation de cibles et le criblage phénotypique dans des systèmes pertinents pour la maladie en générant des populations de cellules ASC adhérentes capables de différenciation multilignée. La méthode soutient la réduction des risques mécanistiques et renforce la prévisibilité des modèles précliniques en produisant des cellules homogènes dérivées de la fraction stromale-vasculaire pour des applications en aval.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger l'hétérogénéité des cellules souches mésenchymateuses et de valider fonctionnellement la multipotence des ASC par des tests de différenciation définis.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode reproductible pour isoler les ASC à partir de tissu adipeux humain, réduisant ainsi la variabilité dans l'approvisionnement en cellules primaires pour les études de validation ciblée.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des populations de cellules souches adhérentes (ASC) adaptées au criblage à haut débit de composés modulant les voies adipogénique, ostéogénique ou chondrogénique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des culots de fraction vasculaire stromale (SVF) qui peuvent être standardisés indépendamment du volume de lipoaspirat, permettant l'extensibilité des tests et la reproductibilité entre laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : La différenciation en lignées adipoïgènes, ostéogéniques et chondrogéniques confirme la puissance fonctionnelle, permettant l'utilisation dans des modèles précliniques de régénération tissulaire.
- Valeur opérationnelle : L'isolement évolutif à partir de lipoaspirats de grand volume soutient un approvisionnement cellulaire constant pour des études précliniques longitudinales et des travaux préparatoires à une demande d'IND.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le flux de travail d'isolement des ASC s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible jusqu'à l'optimisation du composé candidat, en fournissant une source cellulaire renouvelable pour des tests mécanistiques et des criblages phénotypiques avant la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la fonction des cellules stromales et la modulation des voies dans des populations mésenchymateuses d'origine humaine.
- Tri : Fournit des monocouches adhérentes de cellules souches adipeuses avec une morphologie constante, adaptées au criblage de bibliothèques de composés et à l'analyse des profils dose-réponse.
- Analytique : Permet la quantification de l'efficacité de la différenciation par coloration spécifique aux lignées (par exemple, rouge d’Oïl, rouge d'alizarine) comme paramètre quantitatif des effets des composés.
- Recherche translationnelle : La capacité de différenciation en lignées mésodermiques assure une continuité vers des modèles précliniques de réparation osseuse, adipeuse et cartilagineuse.
- Réutilisation en entreprise : L'adaptabilité du protocole à différents volumes de lipoaspirat permet une réutilisation dans plusieurs projets et domaines thérapeutiques sans besoin de réoptimisation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduction de l'ambiguïté mécanistique grâce à une évaluation validée de la multi-potentialité des ASC isolées.
- Valeur opérationnelle : La standardisation des étapes de digestion enzymatique et de lavage minimise la variabilité entre lots en termes de rendement de la FVS.
- Valeur stratégique : Des décisions éclairées d'aller/arrêt basées sur le potentiel de différenciation réduisent l'abandon en phase avancée des programmes régénératifs.
- Impact sur le portefeuille : Une priorisation ajustée au risque des thérapies dérivées des ASC, rendue possible par des indicateurs fiables de puissance issus de la différenciation in vitro.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules primaires et en technique stérile pour maintenir la viabilité des ASC durant leur isolement.
- Dépend de l'accès à une collagénase de type I stérile, à des hottes de sécurité biologique et à des centrifugeuses réfrigérées pour le traitement de la fraction stromale-vasculaire (SVF).
- Exige une standardisation des protocoles de lavage afin d'obtenir une coloration homogène du tissu adipeux et une élimination efficace des globules rouges.
- Les ajustements nécessaires incluent la modification de la concentration en collagénase et du temps d'incubation en fonction de la densité du lipoaspirat et de la variabilité entre donneurs.
- Les limites pratiques comprennent la variabilité du rendement cellulaire liée à l'âge du donneur, à l'IMC et à la technique de liposuccion, comme indiqué dans la documentation source.
