Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines
26 septembre 2013
En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.
L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches dérivées du tissu adipeux à partir de la graisse obtenue sous forme d'aspirat de liposuccion. Cela est réalisé en éliminant d'abord la solution chirurgicale et en lavant l'aspirat afin d'éliminer les globules rouges contaminants. La deuxième étape consiste à libérer les cellules souches par digestion enzymatique de l'aspirat de liposuccion lavé à l'aide de collagénase.
Ensuite, les cellules libérées sous forme de fraction vasculaire stromale ou FVS sont recueillies par centrifugation. La dernière étape consiste à éliminer le surnageant et à mettre en culture les cellules FVS afin de sélectionner et cultiver les ASC adhérents. Enfin, une induction in vitro de ces ASC cultivés vers l'os, les graisses et le cartilage.
Les lignées peuvent être utilisées pour confirmer la présence de ces cellules dans la culture, en plus de confirmer leur pluripotentialité. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la logistique liée à la manipulation de grands volumes de liposuif prélevé avant la récolte des cellules. Préparez une solution stérile de collagénase de type I et un milieu témoin stérile.
Prélevez l'aspirat de lippo dans un récipient d'aspiration. Versez soigneusement l'aspirat de lippo dans un flacon stérile en verre d'un litre. Une fois les couches de l'aspirat de lippo séparées par gravité, aspirez la couche huileuse supérieure si elle est présente.
En outre, retirez la couche inférieure aqueuse. Évaluez le volume de la couche de tissu adipeux obtenue. Ajoutez un volume égal de PBS stérile 1X et mélangez à l’aide de la pipette utilisée pour l’aspiration.
Une fois les deux couches stabilisées, aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Poursuivez le lavage de la fraction tissulaire adipeuse avec du PBS jusqu’à ce que la couche adipeuse présente une couleur jaune or. Aspirez une dernière fois le surnageant, en laissant la fraction tissulaire adipeuse.
Dans l'enceinte en verre. Laisser les couches de l'aspirat lipidique se décanter pendant cinq minutes après le dernier lavage et avant l'aspiration finale. Dans une unité de filtration, préparer une solution stérile de collagénase un.
Ajoutez un volume équivalent à celui de la fraction adipeuse et filtrez de manière stérile. Versez ensuite soigneusement la fraction adipeuse lavée dans la solution de collagénase et fermez hermétiquement le flacon. Incubez ensuite une trentaine de minutes le mélange collagénase-adipeux dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en effectuant des mouvements de rotation doux toutes les cinq à dix minutes. Évaluez l'apparence de la couche de tissu adipeux qui doit devenir plus lisse au fur et à mesure de la digestion, et si nécessaire, prolongez le temps de réaction afin de dissoudre les éventuels morceaux solides de graisse.
Stérilisez l'unité de filtration contenant le mélange d'adipocytes digérés à la collagénase avec de l'éthanol à 70 % et replacez-la dans la hotte de sécurité biologique. Prélevez ensuite des aliquotes de 25 millilitres du mélange contenant la fraction vasculaire stromale et transférez-les dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres. Ajoutez 25 millilitres de milieu de contrôle dans chaque tube et incubez à température ambiante pendant cinq minutes afin d'inactiver la collagénase.
Ensuite, centrifuger pendant 10 minutes à 1 200 × g pour recueillir la fraction vasculaire stromale sous forme de culot dans la hotte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant de chaque tube. Veiller à ce que la couche huileuse supérieure et les adipocytes flottants éventuels soient aspirés avec ce surnageant.
Ensuite, regrouper les culots de la fraction vasculaire stromale dans un seul tube de centrifugation en utilisant 30 millilitres de milieu conditionné, puis répartir équitablement dans deux nouveaux tubes de centrifugation de 50 millilitres. Après centrifugation, aspirer les surnageants provenant des deux culots. Si une lyse des globules rouges est souhaitée, chacun de ces deux culots peut être remis en suspension dans 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges et incubé à température ambiante pendant 10 minutes. Après une nouvelle centrifugation, aspirer les surnageants afin d'obtenir des culots de la fraction vasculaire stromale.
Combinez ces deux pellets dans un nouveau tube de centrifugeuse. À l’aide de cinq à dix millilitres de milieu témoin, les particules tissulaires de grande taille peuvent être filtrées à l’aide d’un filtre en maille de 100 microns placé sur un nouveau tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Répartissez maintenant par aliquots la fraction filtrée contenant les cellules souches adipeuses dans des boîtes de culture tissulaire.
Ensuite, compléter chaque boîte avec un volume approprié de contrôle. Cultiver les cellules pendant trois à quatre jours sans changement du milieu ; aspirer le milieu de culture, puis laver les cellules une fois avec du PBS stérile afin d'éliminer les éventuelles cellules sanguines rouges contaminantes, puis renouveler le milieu et poursuivre la culture lors de l'utilisation de cette méthode manuelle enzymatique pour l'isolement d'une fraction vasculaire stromale à partir d'un échantillon volumineux de liposuccion.
La population de CSM cultivée obtenue est relativement homogène en apparence et composée de cellules de type fibroblaste, ce qui constitue le moyen de validation le plus courant. L'induction in vitro de la population de CSM à l'aide de conditions de culture définies conduit à leur différenciation en lignées mésodermiques, ectodermiques et endodermiques. Tandis que le potentiel tri-germinatif in vitro a conduit à l'utilisation des CSM dans une grande variété de modèles régénératifs.
La différenciation en cellules adipogéniques, ostéogéniques et congéniques est généralement suffisante pour identifier la CS et confirmer sa pluripotence. En outre, les CS peuvent également être différenciées en lignées myogéniques squelettiques et myogéniques lisses, en cellules de la lignée ectodermique ou en lignée cellulaire hépatique endodermique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une fraction vasculaire stromale à partir de liposuccion.
Pour le but de Turing, il s'agit d'un composant SC.
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Aperçu
Cet article décrit l'isolement de cellules souches dérivées des adipocytes (ASCs) à partir de lipoaspirats, en utilisant un protocole manuel de digestion enzymatique avec de la collagénase. Le processus comprend le lavage de l'aspirat, la digestion enzymatique et la culture des cellules pour des études ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Médecine régénérative
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) constituent une source prometteuse pour les thérapies régénératives.
- Les ASC peuvent se différencier en divers types cellulaires, notamment osseux, adipeux et cartilagineux.
- L'isolement des ASC à partir du tissu adipeux est essentiel pour leur utilisation en recherche et en thérapie.
- Des études antérieures ont établi des méthodes d'isolement des ASC, mais leur optimisation est en cours.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches adipeuses (ASC) à partir de lipoaspirats.
- Améliorer l'efficacité de l'isolement des ASC à des fins de recherche.
- Faciliter l'étude de la différenciation des ASC et de leurs applications thérapeutiques potentielles.
Méthodes utilisées
- Élimination de la solution chirurgicale et lavage du lipoaspirat.
- Digestion enzymatique du lipoaspirat lavé à l’aide de collagénase.
- Récupération de la fraction stromale vasculaire (SVF) par centrifugation.
- Ensemencement des cellules de la SVF pour la sélection et la culture des ASC adhérents.
Résultats principaux
- Isolation réussie des ASC à partir de lipoaspirats en utilisant le protocole décrit.
- Des ASC viables ont été obtenues et cultivées pour des études ultérieures de différenciation.
- La méthode a démontré une efficacité dans l'élimination des contaminants et la maximisation du rendement cellulaire.
- Les ASC ont montré un potentiel de différenciation en plusieurs lignées cellulaires in vitro.
Conclusions
- Le protocole de digestion enzymatique décrit est efficace pour l'isolement des ASC.
- Les ASC isolées peuvent être utilisées pour diverses applications en médecine régénérative.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer le potentiel complet des ASC dans des contextes thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) à partir de lipoaspirats fournit une source évolutible de cellules multipotentes pour la recherche en médecine régénérative à un stade précoce. Ce protocole permet la validation de cibles et le criblage phénotypique dans des systèmes pertinents pour la maladie en générant des populations de cellules ASC adhérentes capables de différenciation multilignée. La méthode soutient la réduction des risques mécanistiques et renforce la prévisibilité des modèles précliniques en produisant des cellules homogènes dérivées de la fraction stromale-vasculaire pour des applications en aval.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger l'hétérogénéité des cellules souches mésenchymateuses et de valider fonctionnellement la multipotence des ASC par des tests de différenciation définis.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode reproductible pour isoler les ASC à partir de tissu adipeux humain, réduisant ainsi la variabilité dans l'approvisionnement en cellules primaires pour les études de validation ciblée.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des populations de cellules souches adhérentes (ASC) adaptées au criblage à haut débit de composés modulant les voies adipogénique, ostéogénique ou chondrogénique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des culots de fraction vasculaire stromale (SVF) qui peuvent être standardisés indépendamment du volume de lipoaspirat, permettant l'extensibilité des tests et la reproductibilité entre laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : La différenciation en lignées adipoïgènes, ostéogéniques et chondrogéniques confirme la puissance fonctionnelle, permettant l'utilisation dans des modèles précliniques de régénération tissulaire.
- Valeur opérationnelle : L'isolement évolutif à partir de lipoaspirats de grand volume soutient un approvisionnement cellulaire constant pour des études précliniques longitudinales et des travaux préparatoires à une demande d'IND.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le flux de travail d'isolement des ASC s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible jusqu'à l'optimisation du composé candidat, en fournissant une source cellulaire renouvelable pour des tests mécanistiques et des criblages phénotypiques avant la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la fonction des cellules stromales et la modulation des voies dans des populations mésenchymateuses d'origine humaine.
- Tri : Fournit des monocouches adhérentes de cellules souches adipeuses avec une morphologie constante, adaptées au criblage de bibliothèques de composés et à l'analyse des profils dose-réponse.
- Analytique : Permet la quantification de l'efficacité de la différenciation par coloration spécifique aux lignées (par exemple, rouge d’Oïl, rouge d'alizarine) comme paramètre quantitatif des effets des composés.
- Recherche translationnelle : La capacité de différenciation en lignées mésodermiques assure une continuité vers des modèles précliniques de réparation osseuse, adipeuse et cartilagineuse.
- Réutilisation en entreprise : L'adaptabilité du protocole à différents volumes de lipoaspirat permet une réutilisation dans plusieurs projets et domaines thérapeutiques sans besoin de réoptimisation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduction de l'ambiguïté mécanistique grâce à une évaluation validée de la multi-potentialité des ASC isolées.
- Valeur opérationnelle : La standardisation des étapes de digestion enzymatique et de lavage minimise la variabilité entre lots en termes de rendement de la FVS.
- Valeur stratégique : Des décisions éclairées d'aller/arrêt basées sur le potentiel de différenciation réduisent l'abandon en phase avancée des programmes régénératifs.
- Impact sur le portefeuille : Une priorisation ajustée au risque des thérapies dérivées des ASC, rendue possible par des indicateurs fiables de puissance issus de la différenciation in vitro.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules primaires et en technique stérile pour maintenir la viabilité des ASC durant leur isolement.
- Dépend de l'accès à une collagénase de type I stérile, à des hottes de sécurité biologique et à des centrifugeuses réfrigérées pour le traitement de la fraction stromale-vasculaire (SVF).
- Exige une standardisation des protocoles de lavage afin d'obtenir une coloration homogène du tissu adipeux et une élimination efficace des globules rouges.
- Les ajustements nécessaires incluent la modification de la concentration en collagénase et du temps d'incubation en fonction de la densité du lipoaspirat et de la variabilité entre donneurs.
- Les limites pratiques comprennent la variabilité du rendement cellulaire liée à l'âge du donneur, à l'IMC et à la technique de liposuccion, comme indiqué dans la documentation source.
