Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de marquer des neutrophiles à partir de la moelle osseuse de souris pour des études fonctionnelles ultérieures et des expériences de transfert adoptif. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant les cellules de la moelle osseuse à partir des fémurs et tibias de souris. Lors de la deuxième étape, les globules rouges sont lysés par voie osmotique en les suspendant successivement dans des solutions de chlorure de sodium à 0,2 % et à 1,6 %, respectivement.

Ensuite, les neutrophiles sont isolés par centrifugation en gradient de densité. Dans la dernière étape, les neutrophiles sont marqués avec des colorants traceurs de cellules. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour déterminer le nombre de neutrophiles transférés adoptivement recrutés dans divers tissus de souris.

L'avantage principal de l'isolement des neutrophiles de souris à partir de la moelle osseuse par rapport au sang ou au péritoine est que le grand nombre de cellules nécessaire pour des études fonctionnelles ultérieures et des expériences de transfert adoptif peut être obtenu à partir de la moelle osseuse, tant à l'état stable qu'après une infection. L'avantage de l'utilisation d'une technique de centrifugation en gradient pour l'isolement des neutrophiles de souris par rapport à la sélection immunomagnétique ou au tri cellulaire activé par fluorescence réside dans sa rapidité, son coût modéré, et le fait qu'elle évite l'étiquetage des neutrophiles par des anticorps, ce qui pourrait induire leur activation. La démonstration de la procédure sera effectuée par Muca Swami Us, technicienne de mon laboratoire, après avoir vaporisé une souris euthanasiée avec de l'éthanol à 70 %.

Pratiquer une incision dans la région abdominale médiane de la peau de l'animal, puis retirer le tissu cutané de la partie distale de l'animal, y compris les membres inférieurs. Ensuite, utiliser des ciseaux pour découper les muscles des membres postérieurs de l'animal, puis désarticuler soigneusement l'articulation coxo-fémorale de l'articulation de la hanche, en évitant de briser la tête du fémur. Utiliser ensuite les ciseaux comme un scalpel pour retirer le muscle restant du fémur et du tibia.

Séparez les os des membres au niveau de l'articulation du genou, en prenant soin de ne pas briser les extrémités osseuses, puis placez les os dans une boîte de Pétri contenant du RPMI 1 6 4 oh glacé. Complétez avec du FBS et des antibiotiques. Transférez la boîte dans une hotte de culture tissulaire, puis stérilisez l'extérieur de chaque os à l'aide d'éthanol à 70 % dans une nouvelle boîte de Pétri.

Après environ 10 à 15 secondes, rincez l'éthanol de la surface de chaque os à l'aide de trois lavages successifs dans du PBS stérile glacé. Ensuite, découpez et placez l'épiphyse de chacun des os dans une nouvelle boîte de Pétri stérile. Puis, fixez une aiguille de calibre 25 à une seringue de 12 cm³ remplie de 10 millilitres de RPMI.

Compléter avec du FBS et de l'EDTA. Ensuite, rincer les cellules de la moelle osseuse à partir des deux extrémités de la diaphyse de chaque paire fémur-tibia dans un tube Falcon de 50 millilitres à visser, préalablement muni d'un filtre de 100 micromètres, afin d'éliminer toutes les cellules. Racler les surfaces internes des os à l'aide de la pointe de l'aiguille.

Lorsque les os apparaissent décolorés, les cellules ont été suffisamment éliminées. Utilisez maintenant un scalpel pour découper les épiphyses osseuses en petits morceaux de 0,5 à un millimètre de côté, puis utilisez l'extrémité arrière d'une pipette de 2,5 millilitres dotée d'une pointe einor comb tip plus BioPure pour les broyer à travers un filtre de 100 micromètres. Après avoir centrifugé les cellules récoltées pendant sept minutes à 427 ×g et à quatre degrés Celsius, lysez les globules rouges dans 20 millilitres de chlorure de sodium à 0,2 % pendant environ 20 secondes.

Ensuite, arrêter la lyse avec 20 millilitres de chlorure de sodium à 1,6 %, centrifuger les cellules, puis resuspendre le culot dans du RPMI 1640 supplémenté avec du FBS et de l'EDTA. Compter les cellules, puis après une nouvelle centrifugation, resuspendre le culot lavé à une concentration maximale de 100 × 10⁶ cellules par millilitre de PBS froid stérile. Prélever maintenant 3 millilitres de milieu opaque 1119 à une température de 18 à 26 degrés Celsius dans un tube conique de 15 millilitres, puis recouvrir lentement de 3 millilitres de milieu opaque 1119 à une température de 18 à 26 degrés Celsius.

Sa couche opaque 1 0 7 7. Évitez de mélanger les deux densités immédiatement après avoir préparé l'his opaque ; déposez soigneusement la suspension de cellules de la moelle osseuse au-dessus de l'his opaque 1 0 7 7, puis centrifugez le gradient de densité pendant 30 minutes à 834 × g et à 25 degrés Celsius sans frein, puis recueillez les neutrophiles à l'interface des couches his opaque 1 1 1 9 et 1 0 7 7. Après avoir lavé les neutrophiles recueillis deux fois dans du RPMI 1 6 4 0 avec du FBS et des antibiotiques, resuspendez les cellules à une concentration de 5 × 10⁶ cellules par millilitre dans du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius.

Après avoir dénombré les cellules, conserver un petit aliquot de chaque échantillon expérimental afin de déterminer la pureté et la viabilité par cytométrie en flux, puis marquer les neutrophiles restants avec un colorant traceur de cellules à une concentration finale de cinq micromoles pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie agité à l’abri de la lumière. Enfin, laver les cellules deux fois avec du RPMI 1 6 4 0 glacé supplémenté de FBS et d'antibiotiques afin d'éviter toute contamination croisée par le colorant avant de mélanger les populations de neutrophiles différemment marquées pour des études compétitives de recolonisation ultérieures. Ici, des histogrammes représentatifs de cytométrie en flux de neutrophiles isolés du tissu osseux, séparés par gradient de densité, provenant d'une souris C 57 black six non infectée sont présentés dans ce panneau. Le premier fenêtrage utilisé pour les cellules de moelle osseuse collectées à l'interface d'Histopaque 1 1 1 9 et d'Histopaque 1 0 7 7.

L'utilisation de la diffusion directe et latérale montre que les neutrophiles séparés par gradient de densité présentent une pureté supérieure à 90 % et une viabilité supérieure à 95 % pendant au moins quatre heures après le transfert adoptif marqué au traceur cellulaire. Les neutrophiles marqués au DIA peuvent être suivis par cytométrie en flux dans divers tissus murins. Par exemple, dans le sang, la moelle osseuse et les reins de la souris C57BL/6 réceptrice infectée par Candida, comme illustré dans cette expérience en sélectionnant les cellules vivantes CD45 LY6G CD11b, ces neutrophiles représentatifs transférés adoptivement et marqués au CMTMR peuvent être différenciés des neutrophiles natifs CMTMR et PE négatifs de la souris réceptrice par leur expression de PE.

Une fois maîtrisée, l'isolement et l'étiquetage des neutrophiles de la moelle osseuse de souris peuvent être réalisés en trois heures.