Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de marquer les neutrophiles de la moelle osseuse de souris pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Pour ce faire, il faut d’abord prélever les cellules de la moelle osseuse de la souris, des fémurs et du tibia. Au cours de la deuxième étape, les globules rouges sont osmotiquement mélangés en les suspendant séquentiellement dans des solutions de chlorure de sodium à 0,2 % et 1,6 % respectivement.

Ensuite, les neutrophiles sont isolés par centrifugation à gradient de densité. Dans la dernière étape, les neutrophiles sont marqués avec des colorants de suivi cellulaire. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour déterminer le nombre de neutrophiles transférés par adoption recrutés dans divers tissus de souris.

Le principal avantage de l’isolement des neutrophiles de souris de la moelle osseuse sur le sang ou le péritoine est que le grand nombre de cellules suffisant pour les études fonctionnelles en aval et les expériences de transfert adoptif peut être obtenu à partir de la moelle osseuse à la fois pendant l’état d’équilibre et après l’infection. L’avantage d’utiliser une technique de centrifugation à gradient pour isoler les neutrophiles de souris par rapport à la sélection immunomagnétique du tri cellulaire activé par fluorescence est qu’elle est rapide, économique et qu’elle évite de marquer les neutrophiles avec des anticorps qui peuvent induire l’activation des neutrophiles. La démonstration de la procédure sera faite par muca swami us, un technicien de mon laboratoire, après avoir pulvérisé une souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70 %.

Faites une incision dans la région abdominale médiane de la peau de l’animal, puis retirez le tissu cutané de la partie distale de l’animal, y compris les membres inférieurs. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper les muscles des membres postérieurs de l’animal, puis disloquez soigneusement le beum ACE de l’articulation de la hanche, en évitant de casser la tête du fémur. Ensuite, utilisez les ciseaux dans un scalpel pour retirer le muscle restant du fémur et du tibia.

Séparez les os de la jambe au niveau de l’articulation du genou, en prenant soin de ne pas casser les extrémités des os, puis placez les os dans une boîte de Pétri contenant du RPMI 1 6 4 oh glacé. Complétez avec FBS et antibiotiques. Transférez la boîte dans une hotte de culture tissulaire, puis stérilisez l’extérieur de chaque os avec de l’éthanol à 70 % dans une nouvelle boîte de Pétri.

Après environ 10 à 15 secondes, rincez l’éthanol de la surface de chaque os avec trois lavages ultérieurs dans du PBS stérile et glacé. Ensuite, coupez et placez l’épiphyse de chacun des os dans une nouvelle boîte de Pétri stérile. Ensuite, fixez une aiguille de calibre 25 à une seringue de 12 cc remplie de 10 millilitres de RPMI.

Complétez avec FBS et EDTA. Ensuite, rincez les cellules de la moelle osseuse des deux extrémités de la tige de chaque paire de tibia de fémur sur un tube Falcon à vis de 50 millilitres estompé avec un filtre de 100 micromètres pour éliminer toutes les cellules. Grattez les surfaces internes des os avec la pointe de l’aiguille.

Lorsque les os apparaissent blanchis, les cellules ont été suffisamment éliminées. Utilisez maintenant un scalpel pour couper les épiphyses osseuses en petits morceaux Q de 0,5 à un millimètre, puis utilisez l’extrémité arrière d’une pointe de peigne einor de 2,5 millilitres et une pointe de pipette BioPure pour les écraser à travers le filtre de 100 micromètres. Après avoir fait tourner les cellules récoltées pendant sept minutes à 427 fois G et quatre degrés Celsius, lyez les globules rouges dans 20 millilitres de chlorure de sodium à 0,2 % pendant environ 20 secondes.

Ensuite, arrêtez la lyse avec 20 millilitres de chlorure de sodium à 1,6 %, faites tourner les cellules, puis remettez en suspension la pastille dans un supplément RPMI 1 6 4 oh avec FBS et EDTA. Comptez les cellules, puis, après les avoir fait tourner à nouveau, remettez en suspension la pastille lavée à un maximum de 100 fois 10 à six cellules par millilitre de glace. Froid stérile PBS Maintenant, distribuez trois millilitres de 18 à 26 degrés Celsius, son opaque 1 1 1 9 dans un tube conique de 15 millilitres, puis superposez lentement trois millilitres de 18 à 26 degrés Celsius.

Son opaque 1 0 7 7. En évitant de mélanger les deux densités immédiatement après la préparation de l’opaque, superposez soigneusement la suspension de cellules de la moelle osseuse sur la centrifugeuse opaque 1 0 7 7, le gradient de densité pendant 30 minutes à 834 fois G et 25 degrés Celsius sans pause, puis collectez les neutrophiles à l’interface de ses couches opaques 1 1 1 9 et 1 0 7 7. Après avoir lavé les neutrophiles collectés deux fois dans RPMI 1 6 4 oh FBS et antibiotiques Resus suspendent les cellules à cinq fois 10 à six cellules par millilitre dans PBS Prewarm à 37 degrés Celsius.

Après avoir compté les cellules, réservez une petite aliquote de chaque échantillon expérimental pour déterminer la pureté et la viabilité par cytométrie en flux, puis marquez les neutrophiles restants avec un colorant de suivi cellulaire à une concentration finale de cinq micromolaires pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau agitée dans l’obscurité. Enfin, lavez les cellules deux fois avec un supplément de RPMI 1 6 4 oh glacé avec FBS et des antibiotiques pour éviter la contamination croisée des colorants avant de mélanger les populations de neutrophiles marquées différentiellement pour les études de repeuplement compétitives en aval ici, des graphiques de cytométrie en flux représentatifs de la moelle osseuse isolés de gradient de densité de neutrophiles séparés d’une souris C 57 black six non infectée sont présentés dans ce panneau. Porte initiale utilisée pour les cellules de la moelle osseuse prélevées à l’interface de l’histopath 1 1 1 9 et de l’histopath 1 0 7 7.

En utilisant la diffusion directe et latérale, il est démontré que les neutrophiles séparés par gradient de densité sont purs à plus de 90 % et viables à plus de 95 % pendant au moins quatre heures après l’adoption du traqueur de cellules de transfert. Les neutrophiles marqués DIA peuvent être suivis par cytométrie en flux chez divers problèmes de souris. Par exemple, dans le sang, la moelle osseuse et les reins de la souris receveuse infectée par le candida C 57 black six montrés dans cette expérience en regardant sur le live CD 45 LY six cellules G CD 11 B, ces neutrophiles représentatifs marqués C-M-T-M-R transférés adoptivement peuvent être différenciés des neutrophiles natifs C-M-T-M-R et PE négatifs de la souris receveuse par leur expression PE.

Une fois maîtrisés, l’isolement et le marquage des neutrophiles de la moelle osseuse de souris peuvent être réalisés en trois heures.