Name: Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Découvrez l'incorporation de p-azido-L-phénylalanine dans les récepteurs couplés aux protéines G pour étudier leur structure et fonction. Cette méthode permet le photocroisement ciblé et le marquage bioorthogonal spécifique.

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Une. Incorporation génétique spécifique de site d&#39;acides aminés non naturels dans les RCPG <ol><li> Maintenir des cellules HEK293T dans du DMEM (4,5 g / L de glucose, de glutamine 2 mM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. </li><li> Transfecter les cellules cultivées à 60-80% de confluence dans une plaque de 10 cm en utilisant le réactif Lipofectamine Plus. <ol><li> 750 ul de DMEM, ajouter 10 ul de réactif Plus, 3,5 ug d&#39;ADNc de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contenant le codon d&#39;arrêt ambre dans une position souhaitée, 3,5 ug d&#39;ARNt suppresseur ADNc (pSVB.Yam) et 0,35 pg ARNt synthétase mutante de l&#39;ADNc de l&#39;amino-acyl de p-azido-L-phénylalanine (pcDNA.RS). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Également effectuer une transfection similaire en utilisant le poids GPCR ADNc (ne contenant pas de codon stop ambre) pour servir de contrôle. Ajouter ce mélange à 750 ul de DMEM avec 17 pi Lipofectamine. Après équilibration de 15 min à température ambiante, porter levolume total de 4 ml. </li><li> Aspirer le milieu sur plaque de 10 cm, appliquer le mélange de transfection à des cellules, et le retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère. Après 4-6 heures, compléter cellules avec 4 ml de DMEM contenant 20% de FBS et 1 mM AZF. </li></ol></li><li> Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF. </li><li> Récupération des cellules 48 heures après la transfection, pour analyser l&#39;expression ou de procéder à des procédures de photoréticulation ou d&#39;étiquetage décrites dans les sections suivantes. <ol><li> Confirmer l&#39;expression du mutant ambre GPCR en présence de la SAU dans le milieu de croissance. Nous faisons cela par détection Western blot. Lyse du culot cellulaire dans 1% (p / v) de dodécyl-β-D-maltoside (DDM) dans 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM pendant 1 heure à 4 ° C. Centrifuger le lysat à 16 000 xg et résoudre le surnageant dans des conditions réductrices par SDS-PAGE. Transférer sur une membrane de PVDF et effectuer des analyses d&#39;immuno-empreinte pour détecter l&#39;expression du récepteur de pleine longueur à l&#39;aide ee 1D4 mAb (Cellule Nationale Culture Center), qui reconnaît un épitope d&#39;ingénierie à l&#39;extrémité C-terminale du récepteur. 31 </li></ol></li></ol> 2. Cartographie d&#39;un site de liaison de ligand Utilisation ciblée Photoréticulation <ol><li> 48 heures après la transfection, les médias d&#39;aspiration à partir de cellules et les remplacer par 4 ml 1x tampon phosphate salin (PBS). Revenir à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec PBS 1x et transférer dans un tube Falcon. Centrifuger à 1500 rpm pendant 2 min pour sédimenter les cellules et aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution saline tamponnée de Hank contenant 1x mM HEPES, pH 7,5, BSA à 0,2% et le ligand tritié à la concentration de saturation de liaison pour la longueur nécessaire de temps et de température pour assurer la formation du complexe récepteur-ligand 20. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à une plaque à 24 puits ou à 96 puits pour la photoactivation de la AZF à 365 nm (par exemple, en utilisant une lampe UV-A) pendant 15 min à 4 ° C. Maintain la plaque sur de la glace afin d&#39;éviter le chauffage de l&#39;échantillon et de la lyse cellulaire. </li><li> Transférer les cellules à un tube Eppendorf, centrifugeuse pour sédimenter les cellules, éliminer le surnageant et procéder à l&#39;analyse. Les pastilles peuvent être stockées à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans du tampon de lyse contenant 1% (p / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 et des inhibiteurs de protéase. Après 1 heure d&#39;incubation à 4 ° C, centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 min à 16 000 xg, et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 1D4 résine mAb-Sepharose 2B au surnageant et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C à immunopurifier l&#39;GPCR en utilisant l&#39;extrémité C-terminale mAb 1D4 épitope d&#39;ingénierie. Le lendemain, les billes laver plusieurs fois avec du tampon de lyse. Échantillons élue avec 1% de SDS à 37 ° C pendant 1 h sous agitation. </li><li> Transférer une partie de l&#39;éluant à un flacon contenant 15 ml de fluide de scintillation et de compter sur un compteur à scintillation bêta pour quantifier la quantité de liaison spécifique du ligand tritié aux erécepteur d&#39;e. </li><li> Résoudre le restant 1D4 mAb éluant purifié par électrophorèse sur gel standard. Nous utilisons un gel SDS-PAGE 4-12% puis transfert semi-sec sur une membrane de PVDF pour immunoblot. Nous incluons également une voie avec échelle de protéine standard pour guider approximation visuelle de poids moléculaire. <ol><li> Bloquer la membrane de PVDF avec 5% de lait dans du tampon TBS contenant 0,05% de Tween-20. Sonder la membrane afin de confirmer l&#39;expression des récepteurs de pleine longueur avec l&#39;AcM 1D4 suivi d&#39;un anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à la HRP. </li><li> Traiter avec chimioluminescence amplifiée (ECL) de réactif et exposer la membrane à autoradiographie film visualiser les bandes. </li></ol></li><li> Couper la membrane avec une lame de rasoir pour séparer chaque voie échantillon, suivie d&#39;une découpe au niveau des marqueurs spécifiques de poids moléculaire. Transférer les segments de membrane dans des flacons contenant un liquide de scintillation. Quantifier la quantité de tritium dans chaque segment de membrane par comptage sur un compteur à scintillation bêta. </li><li> Identifier le positifune photo-détection avec le tritium à la masse moléculaire apparente égale à la somme de celle des GPCR et le ligand. </li></ol> 3. Ciblée épitope de l&#39;étiquetage et de surface cellulaire immuno-enzymatique (ELISA) <ol><li> 24 heures après la transfection, laver les cellules avec 1 ml de PBS 1x et trypsiniser avec 1 ml de 0,25% de trypsine pendant 3 min. Compléter avec 9 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF. Remettre les cellules et compter la densité cellulaire. Nous utilisons un hémocytomètre standard. </li><li> Pré-traiter, une plaque de 96 puits à fond transparent de haute liaison avec 100 ml de 0,01 mg / ml de poly-D-lysine par puits. Incuber pendant 30 min à température ambiante, laver à plusieurs reprises avec du PBS 1x et sécher à l&#39;air. </li><li> Plate 200 ul de cellules transfectées à une densité de 6 x 4 au 8 octobre x 10 4 cellules / puits à la plaque de 96 puits et retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère. </li><li> Le lendemain, préparer des cellules pour l&#39;étiquetage. Lavez délicatement trois fois avec 100 pl / puits de PBS 1x to éliminer tout contenant un milieu de croissance AZF. S&#39;assurer cellules restent collées, par exemple, à l&#39;aide de PBS contenant Ca 2 + et Mg 2 +. </li><li> Préparer 50-200 pM FLAG-triarylphosphinique réactif de marquage en 1x HBSS / PBS d&#39;un stock maintenu à 5-20 mM dans du PBS. Appliquer 60 ml à chaque puits (en triple exemplaire pour chaque mutant ambre) et retour à 37 ° C pendant 30 min à 4 h. Maintenir un ensemble de puits sans traitement de l&#39;étiquette en 1x HBSS / PBS. Inclure aussi un contrôle de GPCR de poids à comparer avec des variantes AZF-GPCR. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 100 pl / puits de tampon de blocage, BB (1 x PBS, 0,5% BSA), pour éliminer complètement l&#39;étiquette qui n&#39;a pas réagi. </li><li> Appliquer 100 pl / puits de paraformaldéhyde 4% (préparé à partir d&#39;un stock de 16% en 1x PBS) pour les cellules. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver trois fois avec BB. </li><li> Exécuter le protocole de test ELISA de surface cellulaire standard pour détecter le récepteur marqué et l&#39;expression du récepteur. Incuber avec l&#39;anticorps primaire pendant 1,5 heure sur la glace suivie d&#39;un secondairetibody incubation à température ambiante pendant 1 heure. <ol><li> Ajouter 100 ul d&#39;anticorps anti-FLAG M2 (par exemple, dilution 1:2000 de l&#39;anticorps fabriqué en BB) pour détecter FLAG épitope peptidique du réactif de marquage FLAG-triarylphosphine. Sonder aussi non-étiquette puits traités comme contrôle négatif. Ajouter anti-CCR5 2D7 (nous utilisons une dilution 1:500) anticorps à un ensemble distinct de puits afin de déterminer en poids ou AZF-GPCR expression à la surface cellulaire. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du BB, et incuber avec 100 pi d&#39;anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à HRP (1:2000 dilution). </li><li> Laver soigneusement les cellules cinq fois avec BB. Ajouter 50 ul de tampon de détection: Amplex Red, 20 mM de H 2 O 2, 1x PBS (rapport 1:10:90) et incuber 15 min à température ambiante. Recueillir des données spectrales sur un lecteur de plaques multi-puits fluorescence à λ = 530 ex et λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Marquage fluorescent d&#39;un GPCR <ol><li> Lyse10 7 cellules récoltées exprimant poids ou AZF-rhodopsine variantes dans 1 ml de tampon de solubilisation contenant 1% (p / v) de DM, HEPES 50 mM ou de Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM et des inhibiteurs de protéase pour une hr à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 15 000 xg pendant 10 minutes et recueillir la fraction de surnageant. </li><li> Ajouter 100 ul 1D4-mAb résine Sepharose 2B pour capturer récepteur utilisant le C-terminale 1D4 épitope ingénierie. Incuber pendant 12 heures à 4 ° C. Laver la résine à trois reprises avec 0,1% (p / v) DDM dans 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,3. </li><li> Ajouter 0,1 mM fluorescéine-phosphine dans un volume total de 0,3 à 0,5 ml d&#39;étiqueter récepteur immobilisé sur la matrice d&#39;immuno-affinité (mAb 1D4-Sepharose 2B). Incuber pendant 12 heures à température ambiante. Centrifugeuse et enlever le surnageant. Laver la résine pour enlever l&#39;étiquette n&#39;a pas réagi. </li><li> Éluer le récepteur marqué avec 100 ml de tampon d&#39;élution contenant 0,1% (p / v) de DDM et 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide contre l&#39;épitope 1D4)dans un tampon phosphate 2 mM, pH 6,0 par incubation sur de la glace pendant 1 heure. </li><li> Résoudre les échantillons marqués par SDS-PAGE dans des conditions réductrices. Laver gels brièvement dans du PBS, puis visualiser l&#39;étiquetage des AZF-GPCR par fluorescence dans le gel. Par exemple, en utilisant un scanner à fluorescence confocal avec un laser de longueur d&#39;onde 488 nm pour détecter les récepteurs modifiés avec de la fluorescéine. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Nous décrivons ici une méthode robuste pour incorporation spécifique du site d&#39;une sonde réactive, AZF, en RCPG et démontrons trois applications utiles de cet outil pour étudier la structure et la dynamique des RCPG. Notre méthode de site spécifiquement incorporer SAU contourne un problème fondamental d&#39;une stratégie alternative basée sur l&#39;étiquetage chimique 32, 33 ou 34 photoréticulants fixer à un seul mutant cystéine accessible. Bien que, chimies qui ciblent des groupes thiol cystei...

Heptahélice G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comprennent une superfamille de protéines de la membrane hautement dynamiques qui assurent la médiation des signaux extracellulaires importantes et variées. Dans le paradigme classique, l&#39;activation du récepteur est couplé à des changements de conformation induites par le ligand. 1, 2 Les récents progrès dans la biologie structurale des RCPG ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation transmembranaire. 3-5 Cependant, pour comprendre avec plus de précision chimique du mécanisme fonctionnel et dynamique des structures de signalisation des RCPG, une boîte à outils d&#39;approches sont nécessaires pour incorporer des sondes moléculaires et chimiques d&#39;information pour interroger des complexes de signalisation actifs. À cette fin, nous avons adapté une méthode de site spécifiquement introduire non ou minimalement sondes perturbateurs dans des récepteurs exprimés sur la base de contre nature acide aminé (SAU) de mutagenèse utilisant codon ambre technologie de suppression précédemment mis au point par Schultz et c. oworkers 6 Nous avons optimisé la méthode de mutagenèse SAU pour obtenir une expression à haut rendement et d&#39;un système de mutagenèse pour les protéines telles que les GPCR, qui sont difficiles à exprimer dans des systèmes hétérologues plus que d&#39;autres cellules de mammifères. L&#39;utilisation d&#39;un suppresseur orthogonal conçu ARNt et évolué aminoacyl-ARNt synthétase pour une SAU spécifique, nous place spécifiquement introduit SAU dans RCPG cibles exprimées. L&#39;incorporation réussie de SAU, la p-acétyl-L-phénylalanine (ACF), p-benzoyl-L-phénylalanine (BZF), et le p-azido-L-phénylalanine (AZF) a été démontrée dans les RCPG modèle - rhodopsine humaine et le récepteur de la chimiokine CC, CCR5. 7, 8 En principe, une SAU peut être génétiquement encodés à n&#39;importe quelle position dans la séquence de la protéine et cette propriété est un outil biochimique inestimable, car elle permet de numériser un seul codon d&#39;un GPCR cible. Nous nous concentrons ici spécifiquement sur la polyvalence de la SAU, AZF, qui a un azi réactivefaire partie. En plus de servir en tant que l&#39;infrarouge (IR) sonde unique, 8, 9 AZF peut aussi servir comme un agent de réticulation photo-activable par réaction avec des amines primaires aliphatiques voisins ou des atomes d&#39;hydrogène. En outre, le groupe azido biologiquement inerte peut participer en tant que poignée chimique sélective en réactions de marquage bioorthogonal. Ici, nous présentons des exemples illustrant les applications utiles de l&#39;incorporation spécifique du site de l&#39;usine AZF en GPCR, comme photoréticulation ciblées pour piéger un complexe récepteur-ligand, et la modification des RCPG par bioorthogonal marquage d&#39;épitope et les stratégies de marquage fluorescent. Des réactifs photo-activables ont été utilisées pour étudier les systèmes biologiques depuis les années 1960. 10 Durant cette période, une abondance d&#39;expériences de reticulation récepteur-ligand ont été rapportés pour étudier des complexes de GPCR, dont la plupart impliquaient l&#39;utilisation de ligands de photo-affinité 11, 12 Cependant, ceux-ci. applications sont techniquement limités, car ils Requirla synthèse de l&#39;e de ligands portant un groupe de reticulation. 13-15 En outre, avec le groupement réticulant dans le ligand, il est difficile d&#39;identifier l&#39;emplacement de la réticulation sur le GPCR. L&#39;introduction du site-spécifique groupes photoréticulation que SAU en protéines en utilisant le codon ambre technologie de suppression est un progrès important. 16, 17 Nous avons développé une technique de photoréticulation pour identifier l&#39;interface de fixation sur un récepteur qui est impliqué dans la formation d&#39;un complexe récepteur-ligand dans cellules vivantes en introduisant des groupes photolabiles dans les RCPG. 18, 19 Nous décrivons ici le protocole expérimental et la méthode d&#39;analyse des données pour l&#39;application de cette technologie de photoréticulation ciblée pour identifier le site de liaison d&#39;un ligand à petite molécule, le maraviroc tritiée, sur le CCR5. Ce procédé tire parti de la quantification précise de la poignée sur le ligand radioactif, en plus de conserver la structure chimique du ligand natif. Des techniques basées sur la fluorescence en charge la compréhension précise de la base structurelle de l&#39;activation du récepteur en sondant directement l&#39;état conformationnel du récepteur. 20, 21 Cependant, les techniques qui possèdent la flexibilité d&#39;introduire des marqueurs fluorescents dans les GPCR sont site spécifiquement limité. Nous sommes intéressés à utiliser des stratégies de modification chimique bioorthogonal pour faciliter la détection de molécule unique (SMD) de GPCR complexes de signalisation. 22 Le groupe azido peut participer à des chimies bioorthogonal tels que Staudinger-Bertozzi ligature, 23, 24 sans cuivre souche promu azoture cycloaddition alcyne (SpAAC) 25 et de l&#39;azoture-alcyne cycloaddition catalysée par le cuivre (CuAAC). 26 Nous nous concentrons ici sur la réaction de ligature Staudinger-Bertozzi qui implique la réaction spécifique entre un azoture et une phosphine. Nous démontrons l&#39;utilisation de deux dérivés de phosphine, les différents conjugués à un épitope de peptide (peptide FLAG) ou un marqueur fluorescent(Fluorescéine) afin de réaliser la modification spécifique d&#39;un site de GPCR. Nous avons déjà optimisé les conditions d&#39;étiquetage spécifique du site de la rhodopsine variantes AZF en utilisant la structure cristalline aux rayons X et des simulations dynamiques de choisir des sites cibles qui sont exposés au solvant. 27, 28 Nous avons également illustré la faisabilité d&#39;atteindre étiquetage sans fond par Staudinger- ligature Bertozzi. Nous démontrons ici 29 le mode opératoire général utilisé pour réaliser le marquage fluorescent d&#39;un récepteur de détergent solubilisé qui est immobilisé sur une matrice d&#39;immuno-affinité et ensuite visualisés par fluorescence dans le gel. En outre, nous démontrons une extension utile à cette stratégie d&#39;étiquetage pour identifier les positions se prêtant à l&#39;étiquetage sur un récepteur de structure inconnue, CCR5. Ceci est réalisé en utilisant une stratégie de marquage peptide-épitope cible qui repose sur une modification de bioorthogonal AZF-GPCR variants dans un format semi-haut débit à base de cellules. Cette 30méthode exploite les propriétés de détection multi-étapes d&#39;un test ELISA de surface cellulaire pour surveiller les événements en matière d&#39;étiquetage. Les méthodes que nous discutons ici sont générales et peuvent en principe être appliquées à tout GPCR incorporé avec AZF utilisant le codon ambre technologie de suppression. Dans les protocoles présentés ici nous détaillons les étapes impliquées dans l&#39;expression de cellules de mammifères avec des récepteurs intégrés SAU tels que AZF en utilisant le procédé de mutagenèse de l&#39;acide aminé non naturel et leurs applications ultérieures pour faciliter les études structurales et dynamiques de GPCR.

<table><tbody><tr><td>Plasmide pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>Plasmide pcDNA.RS pour azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plasmides pMT4.Rho et pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Contiennent éventuellement le codon stop ambré (TAG) à une position souhaitée</td></tr><tr><td>Cellules HEK 293T Cellules</td><td></td><td></td><td>adhérentes</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum Fœtal Bovin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine : 18324-012 Plus : 11514-015</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>p-azido-L-phénylalanine</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Tableau 1. Incorporation génétique spécifique au site d’acides aminés non naturels dans les matériaux des RCPG</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S Lampe UV-A</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF est activée par la lumière de 365 nm</td></tr><tr><td>Solution de sel tamponné de Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr>Ligand <td></td><td></td><td>marqué au tritium</td><td>d’un collaborateur (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1 % (p/v) n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA&</td><td>nbsp ;</td></tr><tr>Résine <td></td><td></td><td>1D4-sépharose</td><td>1D4 mAb immobilisé sur résine de sépharose 2B activée par le CNBr</td></tr> 1<tr><td> % (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12 % SDS gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE réalisé sur appareil NuPAGE</td></tr><tr><td>Appareil Trans-Blot SD</td><td>Biorad</td><td></td><td>Appareil pour transfert semi-sec</td></tr><tr><td>Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) Immobilon</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lait écrémé</td><td></td><td>Fisher Scientific NC9934262</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Fluide de scintillation</td></tr><tr><td>Flacons de scintillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Compteur à scintillation liquide</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Compteur à bêta-scintillation</td></tr><tr><td>Anti-rhodopsine 1D4 mAb</td><td>Centre national de culture cellulaire</td><td>personnalisé</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>IgG anti-souris conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR film</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Tableau 2. Matériaux de photoréticulation ciblés</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>FLAG-triarylphosphine</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>M2 FLAG mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>anticorps anti-CCR5 2D7 BD</td><td>Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Fond transparent, haute liaison EIA/RIA</td></tr><tr><td>Phosphate salin (calcium, magnésium)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>KPL, Inc.</td> <td>conjugué à HRP</td><td>474-1516</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>IgG anti-lapin KPL</td><td>, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222²</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques multi-puits à fluorescence CytoFluor II</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Tableau 3. Marquage ciblé des peptides-épitopes et matériaux ELISA de surface cellulaire</td></tr><tr><td>Fluorescéine-phosphine</td><td></td><td></td><td>(Huber et al., soumis en 2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (peptide C9)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptide imitant l’épitope 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1 % (p/v) n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr>Résine <td></td><td></td><td>1D4-sépharose</td><td>1D4 mAb immobilisé sur sépharose activée par CNBr Résine 2B</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12 % SDS gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE réalisé sur appareil NuPAGE</td></tr><tr><td>Scanner de fluorescence confocal Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>abandonné</td><td>Scanner avec laser de longueur d’onde de 488</td></tr> <tr><td>nm&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Tableau 4. Matériaux d’étiquetage Fluorescents</td></tr></tbody></table>

molecular probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Pour faciliter les études structurales et dynamiques du G récepteur couplé à la protéine (GPCR) des complexes de signalisation, de nouvelles approches sont nécessaires pour introduire des sondes ou des étiquettes informatives en récepteurs exprimés qui ne perturbent pas la fonction du récepteur. Nous avons utilisé la technologie de suppression de codon ambre génétiquement coder l&#39;acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine (AZF) à différents postes ciblés dans GPCR hétérologue exprimées dans les cellules de mammifères. La polyvalence du groupe azido est illustré ici dans différentes applications d&#39;étudier RCPG dans leur environnement cellulaire natif ou sous détergents conditions solubilisées. Tout d&#39;abord, nous démontrons une technologie à base de cellules photo-réticulation ciblée pour identifier les résidus dans la poche de liaison au ligand de GPCR où un ligand à petite molécule marquée au tritium est réticulé à un acide azido aminé génétiquement codé. Nous démontrons alors modification spécifique au site des RCPG par le bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligature réactionstion qui vise le groupe azido en utilisant des dérivés de phosphine. Nous discutons d&#39;une stratégie générale pour l&#39;étiquetage ciblé peptide épitope de protéines membranaires exprimées dans la culture et sa détection en utilisant une approche basée sur ELISA cellule entière. Enfin, nous montrons que AZF-GPCR peuvent être étiquetés de manière sélective avec des sondes fluorescentes. Les méthodes sont discutés général, en ce qu &#39;ils peuvent en principe être appliquée à n&#39;importe quelle position d&#39;acide aminé dans toute GPCR exprimé pour interroger les complexes de signalisation actives.

Nous avons employé la méthode de mutagenèse d&#39;acide aminé non naturel spécifique de site pour introduire des sondes moléculaires dans un GPCR en utilisant le codon ambre technologie de suppression. Le schéma de la figure 1 présente les étapes marquantes de la méthodologie et les différentes applications de l&#39;intégration de la SAU polyvalent, p-azido-L-phénylalanine (AZF), dans les RCPG. Expression de AZF-GPCR dans des cellules de mammifères permet photoréticulation ciblé à des ligands, ...

Nous génétiquement coder l&#39;acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d&#39;un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d&#39;épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'introduire une sonde unique informative dans des récepteurs couplés aux protéines G cibles afin de faciliter l'étude structurale et dynamique des complexes de signalisation. Ceci est réalisé en transfectant des cellules avec les plasmides nécessaires à l'expression du matériel traductionnel requis pour incorporer l'acide aminé non naturel zeto phénylalanine ou zeto fee dans un RCPG exprimé. La variante RCPG zeto fee peut ensuite être utilisée de trois manières différentes pour étudier la structure et la fonction du récepteur.Tout d'abord, le zeto fee est utilisé comme agent de réticulation photoactivable dans le RCPG, ce qui permet d'identifier le site de fixation d'un ligand tritié. Ensuite, le zeto fee peut être utilisé comme ancrage chimique réactif afin de fixer un peptide conjugué ou une sonde fluorescente sur le RCPG par des chimies de marquage bio-orthogonales. Les résultats obtenus démontrent l'utilisation de la sonde moléculaire zeto fee dans la réticulation photo-ciblée, le marquage d'épitope ciblé et l'étiquetage fluorescent des RCPG, basés sur des méthodes biochimiques et en cellules vivantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'utilisation de ligands d'affinité photoactivables ou le marquage des cystéines, réside dans la flexibilité d'introduire de façon spécifique un acide aminé artificiel biologiquement inerte et réactif, la P-zeto phénol alanine, à une position connue d'un récepteur cible.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G, notamment en permettant la cartographie des sites d'interaction dans un complexe récepteur LIG dans l'environnement membranaire natif, et en facilitant les études de fluorescence à une molécule unique en identifiant des positions dans l'A-G-P-C-R adaptées au marquage bio-orthogonal. Troisièmement, cette méthode peut fournir des informations sur le mécanisme moléculaire des récepteurs couplés aux protéines G et peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que diverses protéines cellulaires et membranaires. Avant de commencer cette expérience, maintenir les cellules HEC 2 9 3 T dans un milieu Eagle modifié de KO, complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2.Transfecter les cellules à une confluence de 60 à 80 % dans une plaque de 10 centimètres avec G pcr, r CD, NA en utilisant le réactif lipectomy plus, comme décrit dans le protocole du texte. Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance par du DMEM contenant 10 % de FBS et 0,5 millimolaire de fee. Analyser l'expression 48 heures après la transfection, comme décrit dans le texte.Procédez aux procédures de photographie, de réticulation ou d'étiquetage comme décrit dans le reste de cette vidéo. Quarante-huit heures après la transfection, aspirez le milieu des cellules et remplacez-le par quatre millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à 1 x ou PBS, puis remettez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes afin que les cellules se détachent de la plaque. Resuspendez ensuite les cellules dans du PBS 1 x et transférez-les dans un tube Falcon. Centrifugez à 1500 tr/min pendant deux minutes.Pour former un culot cellulaire, aspirez le surnageant avant de resuspendre le culot cellulaire dans une solution saline tamponnée de Hanks 1x contenant le ligand tritié à une concentration saturante pour la liaison, préparée comme décrit dans le protocole du texte. Incubez le culot à 37 degrés Celsius pendant la durée requise pour assurer la formation du complexe récepteur-ligand, laquelle dépend du récepteur et du ligand spécifiques. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits ou de 96 puits.Ensuite, activer par photoactivation le zeto fee à l'aide d'une lampe ultraviolette à 365 nanomètres pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius, en maintenant la plaque sur de la glace afin d'éviter le réchauffement des échantillons et la lyse cellulaire. Après la photoactivation, transférer les cellules dans un tube einor et centrifuger pour former un culot cellulaire après la centrifugation. Éliminer le surnageant et procéder à l'analyse.Resuspendre le culot cellulaire dans le tampon de lyse et incuber les cellules pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 minutes à 16 000 ×g. Avant de transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter à celui-ci de la résine SRO modifiée par un anticorps monoclonal 1D4, liée au gène B, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius afin d'immunopurifier le RCPG à l'aide de l'épitope d'anticorps monoclonal 1D4 intégré dans la terminaison C conçue. Le lendemain, laver plusieurs fois les billes avec le tampon de lyse. Éluer les échantillons avec du SDS 1 % à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation.Transférez une partie de l'EENT dans un flacon de 15 millilitres contenant du liquide de scintillation et comptez à l’aide d’un compteur à scintillation bêta afin de quantifier la quantité de liaison spécifique du ligand tritié au récepteur. Résolvez le reste de l'EENT purifié par électrophorèse sur gel standard à l’aide d’un gel SDS 4 à 12 % avec une règle de protéines standard. Ensuite, transférez semi-sec sur une membrane A-P-V-D-F pour immunotransfert.Bloquer la membrane PVDF avec 5 % de lait dans un tampon TBS contenant 0,05 % de Tween 20. Sonder la membrane pour confirmer l'expression du récepteur de pleine longueur à l'aide de l'anticorps monoclonal 1D four, suivi d'un anticorps secondaire anti-US IgG conjugué à la peroxydase de raifort (HRP). Ensuite, traiter la membrane avec un réactif d'immunodétection chimiluminescente amplifiée.Exposer la membrane à un film d'autoradiographie pour visualiser les bandes. Ensuite, découper la membrane avec une lame de rasoir afin de séparer chaque voie d'échantillon, puis effectuer des coupes au niveau des marqueurs spécifiques de poids moléculaire. Transférer les segments de membrane dans des flacons contenant du liquide de scintillation, puis quantifier la quantité de tritium dans chaque segment de membrane par comptage sur un compteur à scintillation bêta.Identifier le lien photochimique positif par la détection du tritium à la masse moléculaire apparente égale à la somme du RCPG et du ligand. Après avoir lavé et compté les cellules, prétraitez une plaque de 96 puits à fond transparent et haute liaison en ajoutant 100 microlitres de 10 microgrammes par millilitre de poly-D-lycine par puits, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, laver plusieurs fois avec un XPBS avant de laisser sécher à l'air libre la plaque contenant les cellules transfectées dans 200 microlitres à une densité de 60 à 80 000 cellules par puits. Dans la plaque de 96 puits, puis replacer à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2. Le lendemain.Préparez les cellules pour l'étiquetage. Lavez délicatement les cellules trois fois avec 100 microlitres par puits en utilisant un XPBS pour éliminer tout milieu de croissance contenant du zeto fee. Préparez un tampon contenant 50 à 200 micromolaire de réactif d'étiquetage flag Tri AAL PHOSPHINE, comme décrit dans le protocole écrit.Appliquez 60 microlitres dans chaque puits. Conservez un ensemble de puits sans traitement de marquage et avec tampon. Incluez également un témoin de type sauvage de RCPG pour comparer avec une variante de RCPG à alimentation zéro.Replacer la plaque à 37 degrés Celsius entre 30 minutes et quatre heures après l'incubation. Laver les cellules trois fois avec 100 microlitres par puits de tampon de blocage afin d'éliminer complètement l'étiquette non réactive. Ensuite, ajouter 100 microlitres par puits de paraformaldéhyde à 4 % aux cellules après une incubation de 20 minutes à température ambiante.Lavez les cellules trois fois avec le tampon de blocage. Effectuez un protocole EISA standard de surface cellulaire pour détecter le récepteur marqué et l'expression du récepteur en incubant d'abord avec l'anticorps primaire pendant 1,5 heure sur de la glace. Suivez ensuite par une incubation avec l'anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure.Ensuite, ajoutez 100 microlitres d'anticorps secondaire Anti-Flag M deux dilué pour détecter l'épitope peptidique Flag du réactif de marquage Tri AAL phosphine. Probessez également les puits non marqués comme contrôle négatif.Ensuite, ajoutez l'anticorps anti-CCR5 2D7 dilué à des séries de puits distinctes pour déterminer l'expression à la surface cellulaire des cellules GPCR de type sauvage ou Zeto Fee. Lavez les cellules trois fois avec le tampon de blocage et incubez-les avec 100 microlitres d'anticorps anti-IgG US conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dilué.Après avoir soigneusement lavé les cellules cinq fois avec le tampon de blocage, ajouter 50 microlitres de tampon de détection et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, recueillir les données spectrales à l’aide d’un lecteur de plaques multifentes à fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 530 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 590 nanomètres. Commencer la procédure de marquage en lysant 10 millions de cellules récoltées exprimant le type sauvage ou zeto fee.Variance de l'opsine de bâtonnet dans un millilitre de tampon de solubilisation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Recueillir la fraction surnageante après centrifugation du lysat cellulaire à 15&nbsp;000&nbsp;×g pendant 10&nbsp;minutes. Puis ajouter 100&nbsp;microlitres d'anticorps monoclonaux 1D4 liés à la résine SpheroS™ 2B afin de capturer le récepteur par l'épitope 1D4 situé à l'extrémité C modifiée par ingénierie.Après une incubation de 12 heures à quatre degrés Celsius, laver la résine trois fois comme décrit dans le protocole. Ensuite, marquer le récepteur immobilisé sur la matrice d'affinité immuno par l'ajout de 0,1 millimolaire de phosphine fluorescéine à un volume total de 0,3 à 0,5 millilitre, puis incuber pendant 12 heures à température ambiante avant de centrifuger, après élimination du surnageant. Laver la résine pour éliminer tout marqueur non réactif, puis éluer le récepteur marqué avec 100 microlitres de tampon Elian par incubation sur de la glace pendant une heure.Séparer les échantillons marqués par électrophorèse SDS-PAGE en conditions réductrices. Rincer brièvement les gels dans du PBS avant le marquage d'un zeto fee. Récepteur couplé à la protéine G (GPCR) par fluorescence Ingel à l'aide d'un scanner à fluorescence confocale avec un laser de longueur d'onde de 488 nanomètres pour détecter le récepteur modifié avec la fluorescéine.La méthodologie de mutagenèse par acide aminé non naturel a été utilisée pour introduire de manière spécifique des sondes moléculaires au site C de l’A-G-P-C-R à l’aide de la technologie de suppression du codon ambre. La technique de réticulation photo-induite peut ensuite être utilisée pour étudier les aspects structuraux des complexes ligand-récepteur GPCR dans des cellules vivantes, à l’aide d’un ligand de petite molécule marqué radioactivement, tritié. Ravi Rock a été utilisé pour identifier son site de fixation sur le G-P-C-R-C-C-R cinq.Dans cet exemple, l'irradiation UV appliquée à des cellules exprimant zeto fee. CCR cinq variants pré-incubées avec Ravi tritié conduit à la formation de complexes réticulés de manière covalente, que l'on peut identifier à l'aide du marqueur radioactif sensible porté par le ligand.Parmi les différentes positions testées sur CCR5, la lucine 28 zeto fee et le tryptophane 86 zeto fee ont pu s'associer par photocrosslinking au Ravi Rock tritié, comme illustré par des comptages de scintillation nettement plus élevés. Le récepteur de type sauvage n'a montré aucune liaison par photocrosslinking avec le ligand radioactif. Les chimies de marquage bio-orthogonales peuvent être utilisées pour modifier spécifiquement un zeto fee au site C.Une stratégie de variation des RCPG implique le marquage ciblé d'un épitope d'un RCPG dans des cellules vivantes à l'aide d'une étiquette peptidique conjuguée, le peptide drapeau. Le réactif de marquage Tri AAL PHOSPHINE est utilisé pour modifier de manière spécifique et sélective un zeto fee. La variante CCR5 présentée ici correspond à des données représentatives provenant d'une stratégie de détection EISA sensible et multistep utilisée pour identifier les positions marquées par le peptide drapeau.Parmi les positions sur CCR5 étudiées, toutes les variants CCR5 ont été exprimées à la surface cellulaire, et environ la moitié d'entre elles ont correctement subi une marquage ciblé par épitope. Le CCR5 de type sauvage a servi de contrôle négatif pour le marquage par épitope, montrant l'absence de signal anti-Flag. Dans une stratégie alternative, les protéines G zétosolubilisées par détergent ont été immobilisées sur une matrice d'immuno-affinité, telle qu'un anticorps monoclonal anti-1D4 conjugué à la résine Spheros 2B, puis marquées à l'aide d'un fluorophore conjugué.L'image de fluorescence Ingel démontre le marquage fluorescent réussi de l'opsine RCPG à trois positions différentes, comme prévu ; l'opsine de type sauvage n'a montré aucune étiquetage de fond, comme en témoigne l'absence de bande fluorescente au poids moléculaire attendu du récepteur. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer l'expression complète de la lentille du RCPG cible à l'aide d'un ensemble spécifique d'acide introduit AOL Alanine. Après son développement.Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des récepteurs pour explorer tout complexe récepteur-ligand ou marquer un récepteur cible. En utilisant un acide aminé non naturel introduit spécifiquement sur le site, la p-azétophénolalanine, comme sonde réactive. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la néogenèse d'acides aminés non naturels afin d'insérer une sonde moléculaire dans un RCPG pour faciliter l'étude structurale et dynamique des complexes de signalisation des RCPG à l'aide de techniques de photocrosslinking ciblé et de marquage bio-orthogonal.

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