Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

L'objectif général de l'expérience suivante est d'introduire une sonde unique informative dans des récepteurs couplés aux protéines G cibles afin de faciliter l'étude structurale et dynamique des complexes de signalisation. Ceci est réalisé en transfectant des cellules avec les plasmides nécessaires à l'expression du matériel traductionnel requis pour incorporer l'acide aminé non naturel zeto phénylalanine ou zeto fee dans un RCPG exprimé. La variante RCPG zeto fee peut ensuite être utilisée de trois manières différentes pour étudier la structure et la fonction du récepteur.

Tout d'abord, le zeto fee est utilisé comme agent de réticulation photoactivable dans le RCPG, ce qui permet d'identifier le site de fixation d'un ligand tritié. Ensuite, le zeto fee peut être utilisé comme ancrage chimique réactif afin de fixer un peptide conjugué ou une sonde fluorescente sur le RCPG par des chimies de marquage bio-orthogonales. Les résultats obtenus démontrent l'utilisation de la sonde moléculaire zeto fee dans la réticulation photo-ciblée, le marquage d'épitope ciblé et l'étiquetage fluorescent des RCPG, basés sur des méthodes biochimiques et en cellules vivantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'utilisation de ligands d'affinité photoactivables ou le marquage des cystéines, réside dans la flexibilité d'introduire de façon spécifique un acide aminé artificiel biologiquement inerte et réactif, la P-zeto phénol alanine, à une position connue d'un récepteur cible.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G, notamment en permettant la cartographie des sites d'interaction dans un complexe récepteur LIG dans l'environnement membranaire natif, et en facilitant les études de fluorescence à une molécule unique en identifiant des positions dans l'A-G-P-C-R adaptées au marquage bio-orthogonal. Troisièmement, cette méthode peut fournir des informations sur le mécanisme moléculaire des récepteurs couplés aux protéines G et peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que diverses protéines cellulaires et membranaires. Avant de commencer cette expérience, maintenir les cellules HEC 2 9 3 T dans un milieu Eagle modifié de KO, complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2.

Transfecter les cellules à une confluence de 60 à 80 % dans une plaque de 10 centimètres avec G pcr, r CD, NA en utilisant le réactif lipectomy plus, comme décrit dans le protocole du texte. Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance par du DMEM contenant 10 % de FBS et 0,5 millimolaire de fee. Analyser l'expression 48 heures après la transfection, comme décrit dans le texte.

Procédez aux procédures de photographie, de réticulation ou d'étiquetage comme décrit dans le reste de cette vidéo. Quarante-huit heures après la transfection, aspirez le milieu des cellules et remplacez-le par quatre millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à 1 x ou PBS, puis remettez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes afin que les cellules se détachent de la plaque. Resuspendez ensuite les cellules dans du PBS 1 x et transférez-les dans un tube Falcon. Centrifugez à 1500 tr/min pendant deux minutes.

Pour former un culot cellulaire, aspirez le surnageant avant de resuspendre le culot cellulaire dans une solution saline tamponnée de Hanks 1x contenant le ligand tritié à une concentration saturante pour la liaison, préparée comme décrit dans le protocole du texte. Incubez le culot à 37 degrés Celsius pendant la durée requise pour assurer la formation du complexe récepteur-ligand, laquelle dépend du récepteur et du ligand spécifiques. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits ou de 96 puits.

Ensuite, activer par photoactivation le zeto fee à l'aide d'une lampe ultraviolette à 365 nanomètres pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius, en maintenant la plaque sur de la glace afin d'éviter le réchauffement des échantillons et la lyse cellulaire. Après la photoactivation, transférer les cellules dans un tube einor et centrifuger pour former un culot cellulaire après la centrifugation. Éliminer le surnageant et procéder à l'analyse.

Resuspendre le culot cellulaire dans le tampon de lyse et incuber les cellules pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 minutes à 16 000 ×g. Avant de transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter à celui-ci de la résine SRO modifiée par un anticorps monoclonal 1D4, liée au gène B, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius afin d'immunopurifier le RCPG à l'aide de l'épitope d'anticorps monoclonal 1D4 intégré dans la terminaison C conçue. Le lendemain, laver plusieurs fois les billes avec le tampon de lyse. Éluer les échantillons avec du SDS 1 % à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation.

Transférez une partie de l'EENT dans un flacon de 15 millilitres contenant du liquide de scintillation et comptez à l’aide d’un compteur à scintillation bêta afin de quantifier la quantité de liaison spécifique du ligand tritié au récepteur. Résolvez le reste de l'EENT purifié par électrophorèse sur gel standard à l’aide d’un gel SDS 4 à 12 % avec une règle de protéines standard. Ensuite, transférez semi-sec sur une membrane A-P-V-D-F pour immunotransfert.

Bloquer la membrane PVDF avec 5 % de lait dans un tampon TBS contenant 0,05 % de Tween 20. Sonder la membrane pour confirmer l'expression du récepteur de pleine longueur à l'aide de l'anticorps monoclonal 1D four, suivi d'un anticorps secondaire anti-US IgG conjugué à la peroxydase de raifort (HRP). Ensuite, traiter la membrane avec un réactif d'immunodétection chimiluminescente amplifiée.

Exposer la membrane à un film d'autoradiographie pour visualiser les bandes. Ensuite, découper la membrane avec une lame de rasoir afin de séparer chaque voie d'échantillon, puis effectuer des coupes au niveau des marqueurs spécifiques de poids moléculaire. Transférer les segments de membrane dans des flacons contenant du liquide de scintillation, puis quantifier la quantité de tritium dans chaque segment de membrane par comptage sur un compteur à scintillation bêta.

Identifier le lien photochimique positif par la détection du tritium à la masse moléculaire apparente égale à la somme du RCPG et du ligand. Après avoir lavé et compté les cellules, prétraitez une plaque de 96 puits à fond transparent et haute liaison en ajoutant 100 microlitres de 10 microgrammes par millilitre de poly-D-lycine par puits, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, laver plusieurs fois avec un XPBS avant de laisser sécher à l'air libre la plaque contenant les cellules transfectées dans 200 microlitres à une densité de 60 à 80 000 cellules par puits. Dans la plaque de 96 puits, puis replacer à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2. Le lendemain.

Préparez les cellules pour l'étiquetage. Lavez délicatement les cellules trois fois avec 100 microlitres par puits en utilisant un XPBS pour éliminer tout milieu de croissance contenant du zeto fee. Préparez un tampon contenant 50 à 200 micromolaire de réactif d'étiquetage flag Tri AAL PHOSPHINE, comme décrit dans le protocole écrit.

Appliquez 60 microlitres dans chaque puits. Conservez un ensemble de puits sans traitement de marquage et avec tampon. Incluez également un témoin de type sauvage de RCPG pour comparer avec une variante de RCPG à alimentation zéro.

Replacer la plaque à 37 degrés Celsius entre 30 minutes et quatre heures après l'incubation. Laver les cellules trois fois avec 100 microlitres par puits de tampon de blocage afin d'éliminer complètement l'étiquette non réactive. Ensuite, ajouter 100 microlitres par puits de paraformaldéhyde à 4 % aux cellules après une incubation de 20 minutes à température ambiante.

Lavez les cellules trois fois avec le tampon de blocage. Effectuez un protocole EISA standard de surface cellulaire pour détecter le récepteur marqué et l'expression du récepteur en incubant d'abord avec l'anticorps primaire pendant 1,5 heure sur de la glace. Suivez ensuite par une incubation avec l'anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres d'anticorps secondaire Anti-Flag M deux dilué pour détecter l'épitope peptidique Flag du réactif de marquage Tri AAL phosphine. Probessez également les puits non marqués comme contrôle négatif.

Ensuite, ajoutez l'anticorps anti-CCR5 2D7 dilué à des séries de puits distinctes pour déterminer l'expression à la surface cellulaire des cellules GPCR de type sauvage ou Zeto Fee. Lavez les cellules trois fois avec le tampon de blocage et incubez-les avec 100 microlitres d'anticorps anti-IgG US conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dilué.

Après avoir soigneusement lavé les cellules cinq fois avec le tampon de blocage, ajouter 50 microlitres de tampon de détection et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, recueillir les données spectrales à l’aide d’un lecteur de plaques multifentes à fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 530 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 590 nanomètres. Commencer la procédure de marquage en lysant 10 millions de cellules récoltées exprimant le type sauvage ou zeto fee.

Variance de l'opsine de bâtonnet dans un millilitre de tampon de solubilisation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Recueillir la fraction surnageante après centrifugation du lysat cellulaire à 15 000 ×g pendant 10 minutes. Puis ajouter 100 microlitres d'anticorps monoclonaux 1D4 liés à la résine SpheroS™ 2B afin de capturer le récepteur par l'épitope 1D4 situé à l'extrémité C modifiée par ingénierie.

Après une incubation de 12 heures à quatre degrés Celsius, laver la résine trois fois comme décrit dans le protocole. Ensuite, marquer le récepteur immobilisé sur la matrice d'affinité immuno par l'ajout de 0,1 millimolaire de phosphine fluorescéine à un volume total de 0,3 à 0,5 millilitre, puis incuber pendant 12 heures à température ambiante avant de centrifuger, après élimination du surnageant. Laver la résine pour éliminer tout marqueur non réactif, puis éluer le récepteur marqué avec 100 microlitres de tampon Elian par incubation sur de la glace pendant une heure.

Séparer les échantillons marqués par électrophorèse SDS-PAGE en conditions réductrices. Rincer brièvement les gels dans du PBS avant le marquage d'un zeto fee. Récepteur couplé à la protéine G (GPCR) par fluorescence Ingel à l'aide d'un scanner à fluorescence confocale avec un laser de longueur d'onde de 488 nanomètres pour détecter le récepteur modifié avec la fluorescéine.

La méthodologie de mutagenèse par acide aminé non naturel a été utilisée pour introduire de manière spécifique des sondes moléculaires au site C de l’A-G-P-C-R à l’aide de la technologie de suppression du codon ambre. La technique de réticulation photo-induite peut ensuite être utilisée pour étudier les aspects structuraux des complexes ligand-récepteur GPCR dans des cellules vivantes, à l’aide d’un ligand de petite molécule marqué radioactivement, tritié. Ravi Rock a été utilisé pour identifier son site de fixation sur le G-P-C-R-C-C-R cinq.

Dans cet exemple, l'irradiation UV appliquée à des cellules exprimant zeto fee. CCR cinq variants pré-incubées avec Ravi tritié conduit à la formation de complexes réticulés de manière covalente, que l'on peut identifier à l'aide du marqueur radioactif sensible porté par le ligand.

Parmi les différentes positions testées sur CCR5, la lucine 28 zeto fee et le tryptophane 86 zeto fee ont pu s'associer par photocrosslinking au Ravi Rock tritié, comme illustré par des comptages de scintillation nettement plus élevés. Le récepteur de type sauvage n'a montré aucune liaison par photocrosslinking avec le ligand radioactif. Les chimies de marquage bio-orthogonales peuvent être utilisées pour modifier spécifiquement un zeto fee au site C.

Une stratégie de variation des RCPG implique le marquage ciblé d'un épitope d'un RCPG dans des cellules vivantes à l'aide d'une étiquette peptidique conjuguée, le peptide drapeau. Le réactif de marquage Tri AAL PHOSPHINE est utilisé pour modifier de manière spécifique et sélective un zeto fee. La variante CCR5 présentée ici correspond à des données représentatives provenant d'une stratégie de détection EISA sensible et multistep utilisée pour identifier les positions marquées par le peptide drapeau.

Parmi les positions sur CCR5 étudiées, toutes les variants CCR5 ont été exprimées à la surface cellulaire, et environ la moitié d'entre elles ont correctement subi une marquage ciblé par épitope. Le CCR5 de type sauvage a servi de contrôle négatif pour le marquage par épitope, montrant l'absence de signal anti-Flag. Dans une stratégie alternative, les protéines G zétosolubilisées par détergent ont été immobilisées sur une matrice d'immuno-affinité, telle qu'un anticorps monoclonal anti-1D4 conjugué à la résine Spheros 2B, puis marquées à l'aide d'un fluorophore conjugué.

L'image de fluorescence Ingel démontre le marquage fluorescent réussi de l'opsine RCPG à trois positions différentes, comme prévu ; l'opsine de type sauvage n'a montré aucune étiquetage de fond, comme en témoigne l'absence de bande fluorescente au poids moléculaire attendu du récepteur. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer l'expression complète de la lentille du RCPG cible à l'aide d'un ensemble spécifique d'acide introduit AOL Alanine. Après son développement.

Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des récepteurs pour explorer tout complexe récepteur-ligand ou marquer un récepteur cible. En utilisant un acide aminé non naturel introduit spécifiquement sur le site, la p-azétophénolalanine, comme sonde réactive. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la néogenèse d'acides aminés non naturels afin d'insérer une sonde moléculaire dans un RCPG pour faciliter l'étude structurale et dynamique des complexes de signalisation des RCPG à l'aide de techniques de photocrosslinking ciblé et de marquage bio-orthogonal.