Protéomique Préparation de l'échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

L’objectif général de cette procédure est de générer et de pré-fractionner des peptides à partir de matériel formel et fixe et incorporé en paraffine ou FFPE pour l’analyse protéomique. Ceci est accompli par l’isolement du tissu souhaité par microdissection, suivi de la lyse cellulaire. La deuxième étape consiste à générer des peptides par traitement d’échantillons.

L’utilisation d’un filtre de digestion multi-enzyme a aidé à la préparation des échantillons. Les peptides sont ensuite quantifiés en mesurant leur fluorescence de trytophane. La dernière étape est le fractionnement des peptides à l’aide d’une technique de séparation basée sur un échangeur d’anions puissant pour le fractionnement des peptides.

En fin de compte, les échantillons préparés permettent d’analyser des protéomes allant de quantités infimes de matériel à une profondeur de 10 000 protéines. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la digestion en gel ou en solution, est qu’elle est applicable à des quantités infimes d’échantillons cliniques tels qu’un laser microdisect cellules. La méthode fournit des échantillons contenant des peptides parfaits et purs.

Qu’est-ce qui facilite l’exploration protéomique des tissus et des maladies humaines ? L’ensemble du protocole est constitué de techniques développées et publiées dans le passé. Il s’agit notamment de la méthode de récupération élevée, de la pointe de la pipette et de la détermination de la teneur en peptides basée sur la fluorescence du tryptophane, démontrant que la procédure sera

Catina installer un technicien de notre laboratoire Pour commencer à préparer des coupes de tissu pour des sections coupées microdisectées avec un microtome. L’épaisseur des tranches dépend de l’échantillon. Habituellement, la microdissection fonctionne bien avec des tranches de sept à 10 micromètres.

Après avoir irradié les lames de membrane avec une lumière UV pendant 45 minutes, montez les sections dessus avant de les sécher à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Séparez les sections montées par deux incubations successives dans des bocaux consécutifs de xylène pendant deux minutes et demie et une minute et demie. Réhydratez ensuite les sections par suite

Incubation d’une minute dans de l’éthanol absolu, 70 % d’éthanol. Et enfin, l’eau. Après avoir coloré les sections avec de l’hématine de Meyer pendant 20 secondes.

Rincer à l’eau pendant une minute et laisser sécher à l’air libre. Prélever la population cellulaire d’intérêt à l’aide d’un système de microdissection par capture laser. Lors de l’utilisation de l’instrument de paume, prélevez les échantillons dans les capuchons adhésifs à l’aide de trois microlitres de tampon de lyse tissulaire pour 10 nanolitres de tissu microdisecté.

Appliquez le tampon sur le matériau micro disséqué dans le capuchon et fermez le tube. Récupérer la suspension après une courte centrifugation. Ensuite, les poux ont disséqué les tissus disséqués à 99 degrés Celsius dans un bloc chauffant avec agitation pendant une heure.

Clarifier l’extrait brut par centrifugation à 16 000 Gs et 18 degrés Celsius pendant 10 minutes. Mélangez jusqu’à 50 microlitres de lysat clarifié avec 200 microlitres de la solution UA dans une unité d’ultrafiltration. Puis centrifuger à 14 000 GS jusqu’à ce qu’il reste moins de 10 microlitres de solution dans le filtre.

Habituellement, cette étape nécessite 10 à 15 minutes de centrifugation. Ensuite, pipetez 200 microlitres de la solution UA vers l’unité d’ultrafiltration et la centrifugeuse. Comme précédemment, videz le tube de collecte avant de pipeter 50 microlitres de la solution I-A-A dans l’unité d’ultrafiltration.

Mélanger à 600 tr/min dans un mélangeur thermique à température ambiante pendant une minute et centrifuger. Comme précédemment, continuez les étapes d’ultrafiltration et de centrifugation comme indiqué dans le protocole textuel accompagnant cette vidéo. Transférez ensuite les unités de filtration dans de nouveaux tubes de collecte.

Pipeter 40 microlitres de tampon de digestion avec l’endo protéinase lic C avant de mélanger à 600 tr/min dans le thermo mixeur pendant une minute. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Après avoir centrifugé les unités de filtration comme fait précédemment, pipetez 160 microlitres du tampon DB et centrifugez.

Les unités de filtration à travers lesquelles le flux groupé contient les peptides libérés par l’endo-protéase lic C.Ensuite, collectez les peptides triptyques comme décrit dans le protocole de texte. La mesure de la teneur en peptides dans les digestions protéiques peut être effectuée dans un tampon dilué car les résidus de tryptophane sont bien accessibles au solvant. Pour quantifier les peptides, il faut d’abord pipeter 0,2 millilitre de tampon de dosage DB dans le quartz Q vet.

Placez ensuite le Q vet dans le support qve de l’instrument et enregistrez le spectre d’émission pour le blank. Préparez une courbe d’étalonnage à l’aide d’incréments de 0,1 microgramme en ajoutant des aliquotes d’un microlitre de la solution étalon de tryptophane au vétérinaire Q et en mélangeant doucement avec le tampon db. Après avoir nettoyé le Q vet, pipetez l’échantillon et enregistrez le spectre de l’échantillon.

Procéder au calcul de la concentration en protéines et en peptides comme décrit dans le protocole textuel avant le fractionnement. Préparez la colonne de pointes SAX en empilant six couches de EM. Importez une membrane ionique dans une pointe de pipette commune de 0,2 millilitre. Faites deux colonnes d’embouts SAX par échantillon.

Ensuite, préparez la pointe de la scène en empilant trois couches de M quatre C 18. Dans une pointe de pipette de 0,2 millilitre, faites six pointes en étage pour chaque échantillon. Pour commencer.

Fractionnement diluer les solutions peptidiques obtenues par digestions avec ly C avec 0,2 millilitres de BRI et tampon universel Robinson. pH 11 diluer de même les solutions peptidiques obtenues par digestions avec de la trypsine avec 0,2 millilitres de Britain et Robinson Universal buffer. pH cinq assembler la colonne de pointe SAX dans le couvercle de l’adaptateur de tube centrifuge avant de laver et d’équilibrer la colonne de pointe SAX et les pointes de l’étage C 18 comme indiqué dans le protocole de texte.

Ensuite, assemblez la colonne de pointe SAX dans la pointe de l’étage C 18. Chargez les solutions d’échantillon dans les colonnes de pointe SAX équilibrées et centrifugez les colonnes à 5 000 G pendant trois minutes. Lavez les colonnes de pointes de pipette avec 0,1 millilitre d’échantillons dilués.

Faciliter l’écoulement par centrifugation à 5 000 G.Transférez la colonne de pointe SAX vers la pointe de l’étage C 18 suivante et continuez à éluer les peptides comme décrit dans le protocole texte. Après avoir lavé les pointes de l’étage C 18 avec 0,05 millilitre de tampon a, éluez les fractions avec 0,05 millilitre de tampon B dans des flacons, qui sont ensuite utilisés pour l’injection des échantillons dans un système de chromatographie liquide assemblé avec un spectromètre de masse représentatif. Les résultats de l’extraction et de la digestion des protéines sont présentés ici.

La lyse de 250 nanolitres de tissu, ce qui correspond à une zone micro disséquée de 25 millimètres carrés à partir d’une tranche de 10 micromètres, donne environ 45 microgrammes de protéines totales après la digestion consécutive en deux étapes dans le format de jeûne avec la tranche d’endo-protéase C et la trypsine donne des rendements de plus de 50 % de la protéine totale. On voit ici une mesure représentative de la teneur en peptides par fluorescence, les spectres de l’étalon trytophane et l’échantillon montrent des maxima à 350 à 360 nanomètres. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la teneur en trytophane

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons de tissus élevés pour l’analyse protéomique à l’aide de la technique de microdissection, du traitement des échantillons et du fractionnement peptidique Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures plus le temps nécessaire à l’indigestion des protéines. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des tranches de tissu fraîchement préparées après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer les protéomes des tissus et des cellules et les anomalies chez l’homme en utilisant arval for in fixed and paren enchâssés.