Name: Protéomique Préparation de léchantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez une méthode optimisée de préparation d'échantillons de tissus FFPE pour la protéomique quantitative. Ce protocole permet l'analyse du protéome jusqu'à 10 000 protéines à partir de microdissections laser.

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L&#39;auteur remercie le Dr Matthias Mann pour le soutien continu et Mme Katharina Zettl pour démontrer la méthode. Ce travail a été soutenu par la Société Max-Planck pour l&#39;avancement des sciences.

Une. Instrumentation requis <ol><li> Préparation des tranches de tissu pour microdissection et échantillon lyse <ol><li> Thermoblock réglé sur 99 ° C ou un bain d&#39;eau bouillante. </li><li> Laser exploitation microdissecteur (par exemple PALM, Zeiss, Göttingen, Allemagne). </li><li> Thermostaté paillasse centrifugeuse, température réglée à 20 ° C. </li><li> Chambre humide (boîte) avec un support pour les tubes d&#39;évacuation de type Eppendorf. </li><li> Incubateur réglé à 37 ° C. </li><li> Spectrofluorometer permettant la mesure de la fluorescence excitée à proximité de la lumière UV avec des cuves en quartz micro-échelle (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Solutions <ol><li> «Tissue Lysis Buffer» (TLB): 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de DTT, 0,5% (p / v) de polyethylene glycol 20 000 et 4% de SDS. </li><li> Solution UC: 8 M d&#39;urée dans 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5. Préparer 1 ml par 1 échantillon. Solutions UC et de l&#39;AAI doivent être fraîchement préparées et utilisées dans une journée. </li><li> Solution IAA: 0,05 M iodoacetamide en UC. Préparer 0,1 ml par 1 échantillon. </li><li> Endoprotéinase Lys-C, la solution mère. </li><li> Trypsine, la solution mère. </li><li> «Tampon de digestion» (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Préparer 0,25 ml par 1 échantillon. </li><li> «Tryptophane Standard Solution &#39;: 0,1 ug tryptophane dans 1 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Assay tampon B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Solution mère de Britton &amp; Universal Buffer Robinson (brub). Préparer une solution contenant 0,1 M de CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, et 0,1 MH 3 BO 3 et ajuster avec NaOH 1 M à pH requis (2, 4, 5, 6, et 11). Avant utilisation diluer 5 fois avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Tampon A: 1% (v / v) de CH 3 COOH dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Tampon B: 60% (v / v) de CH 3 CN, 1% (v / v) de CH3COOH dans l&#39;eau désionisée. </li></ol> 3. Pipette Conseil et colonnes &quot;StageTip &#39; <ol><li> Préparer SAX pointe-colonne par empilement de 6 couches de membrane Empore-anion dans une common 0,2 ml pointe de la pipette. Faites deux colonnes SAX-pointe par exemple. </li><li> Préparez &#39;StageTip&#39; en empilant trois couches de Empore-C 18 dans une pipette de 0,2 ml. Faire 6 conseils de Scène pour chaque échantillon. </li></ol> 4. Préparation des tranches de tissu pour microdissection et d&#39;échantillons de lyse <ol><li> Des sections avec un microtome coupé (l&#39;épaisseur des tranches dépend de l&#39;échantillon. Habituellement microdissection fonctionne bien avec des tranches de 7-10 um). </li><li> Irradier les diapositives de la membrane (MembraneSlide 1.0 PEN) avec la lumière UV pendant 45 min. </li><li> Montez les sections sur les lames de la membrane irradier et sec à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Déparaffiner les sections montées par deux incubations successives dans le xylène pendant 2,5 minutes et 1,5 min. Réhydrater les sections par des incubations successives dans l&#39;éthanol absolu, 70% d&#39;éthanol et de l&#39;eau, chaque pendant 1 min. </li><li> Colorer les sections avec l&#39;hématoxyline de Mayer pendant 20 secondes, rincer à l&#39;eau pendant 1 min, et sécher à l&#39;air. </li><li> Recueillir les populati cellulairesd&#39;intérêt en utilisant le système de microdissection par capture laser. Lors de l&#39;utilisation de l&#39;instrument PALM (Zeiss) collecter les échantillons dans les bouchons adhésifs (adhésif PAC 200). </li><li> Pipeter une aliquote de la TLB sur le matériau microdisséquée dans le capuchon. Fermer le tube et recueillir la suspension par une courte centrifugation. Lyse la microdissection de tissu à 99 ° C dans un bloc chauffant avec agitation (600 rpm) pendant 1 heure. Utilisez 3 pi de tampon pour 10 nl du tissu microdissection. </li><li> Clarifier l&#39;extrait brut par centrifugation à 16 000 g à 18 ° C pendant 10 min. Le lysat peut être conservé congelé à -20 ° C. </li></ol> 5. Traitement des échantillons <ol><li> Mélangez jusqu&#39;à 50 pi de lysat clarifié avec 200 pi d&#39;UC dans les unités d&#39;ultrafiltration (30k légale) et centrifuger à 14 000 xg jusqu&#39;à moins de 10 pi de la solution resteront dans le filtre. Habituellement, cette étape nécessite 10-15 min centrifugation. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltrationet centrifuger comme en 5.1. Vider le tube de collecte. </li><li> Pipette 50 ul de solution IAA et mélanger à 600 rpm dans un thermo-mélangeur pendant 1 min et centrifuger comme en 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 100 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger comme en 5.1. Répétez cette étape deux fois </li><li> Ajouter 100 pi de la DB à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger à 5.1. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Transférer les unités de filtration de nouveaux tubes de prélèvement. Introduire à la pipette 40 ul de DB avec l&#39;endoprotéinase Lys-C (protéinase par rapport au total de protéine de 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 18 heures. </li><li> Centrifuger les unités de filtration à 14 000 x g comme dans 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 160 ul d&#39;eau désionisée et on centrifuge les unités de filtre comme dans 5.1. Le flux continu commun (5.7 et 5.8 étapes) contient les peptides libérés par endoprotéinase Lys C. </li><li> Transférer l&#39;unité d&#39;ultrafiltration à un nouveau tube de collecte. Ajouter 40 ulDB avec de la trypsine (rapport enzyme à protéine 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 4 heures. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour recueillir les peptides tryptiques. </li></ol> 6. La quantification des peptides <ol><li> La mesure de la teneur en peptides dans les produits de digestion de protéines peut être réalisée dans un tampon dilué, parce que les résidus tryptophane sont bien accessibles au solvant. </li><li> Introduire à la pipette 0,2 ml d&#39;ABB dans la cuvette de quartz et d&#39;enregistrer le spectre d&#39;émission de «blanc». </li><li> Préparer la courbe d&#39;étalonnage en utilisant 0,1 ug étapes en ajoutant 1 ul aliquotes de TSS à la cuvette et doux mélange avec l&#39;ABB. </li><li> Nettoyer la cuvette. </li><li> Pipeter l&#39;échantillon et enregistrer le spectre (échantillon). </li><li> Calcul de la concentration de protéine et de peptide Etant donné que 0,1 ug tryptophane correspond à environ 9 pg de protéine (sur la base de la moyenne de 1,1% de la teneur en tryptophane dans des mélanges protéiques obtenus by lyser les cellules humaines) la teneur en protéines de l&#39;échantillon ou dans le peptide contenu dans le produit de digestion est égale à: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> où F (Standard1) est la fluorescence de 0,1 ug norme tryptophane. La teneur en peptide permet de calculer le rendement de la procédure de digestion et fournit des informations essentielles pour le peptide suivant le fractionnement et l&#39;analyse par spectrométrie de masse. </li></ol> 7. Fractionnement des Lys-C et tryptiques peptides <ol><li> Diluer les solutions de peptides obtenus par digestion avec Lys-C et de la trypsine avec 0,2 ml de brub pH 11 et pH 5, respectivement. </li><li> Monter la pointe SAX-colonne dans la centrifuge couvercle de l&#39;adaptateur de tube. </li><li> Laver et équilibrer la colonne de bout-SAX successivement avec 0,1 ml de methanol, 0,1 ml de NaOH 1 M, et trois fois avec 0,1 ml de brub, pH 11 pour la séparation de Lys-C Peptides et brub, pH 5 pour les peptides tryptiques. L&#39;écoulement des solutions à travers la matière de la colonne est facilitée par centrifugation à 4000 x g. </li><li> Laver et équilibrer les C 18 - &#39;StageTips&#39; ensuite, avec 0,05 ml de methanol, puis avec 0,05 ml de tampon B et avec 0,05 ml de tampon A. Préparer six C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 pour la séparation de la Lys- C peptides et deux pour la séparation des peptides trypsiques. </li><li> Assemblez le Tip-colonne SAX dans le C 18 - &#39;StageTip. Chargez les solutions d&#39;échantillon dans les SAX Tip-colonnes équilibrées et centrifuger les colonnes à 5000 g pendant 3 min. </li><li> Equilibrer les colonnes «pipette à pointe» avec 0,1 ml de la brub, pH 11 ou pH 5, respectivement à la Lyc-C et des échantillons tryptiques. Faciliter la circulation par centrifugation à 5000 x g. </li><li> Transférer le Tip-colonne SAX pour le prochain C 18 - &#39;StageTip. </li><li> Continuer l&#39;élution des peptides avec brub pH 6, 4 et 2 pour l&#39;échantillon C et avec Lys BRUB pH 2 pour l&#39;échantillon avec des peptides tryptiques. Pour chaque étape d&#39;élution utiliser un C séparé 18 - &#39;StageTip. </li><li> Laver les C 18 - «StageTips» avec 0,05 ml de tampon A. </li><li> Éluer des fractions de 0,05 ml de tampon B dans des flacons utilisés directement pour l&#39;injection des échantillons dans le système de LC assemblés avec un spectromètre de masse. </li></ol>

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</ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à révéler.

La possibilité d&#39;étudier la matière FFPE par la technologie protéomique à une profondeur comparable à séquençage des acides nucléiques et des techniques de puces à ADN ouvre de nouvelles perspectives dans les biomarqueurs et la découverte de cibles de médicament. Le protocole décrit permet la caractérisation et la quantification des protéomes des populations de cellules par microdissection sur une échelle de 10 000 protéines. Lorsque vous utilisez moins de la matière microdisséqués un petits ensembles de données peuvent être générés, mais peut-être dans de nombreux cas, les personnes peuvent aussi fournir de précieuses données cliniques. Ainsi, soit les échantillons peuvent être analysés directement après la procédure MED-FASP ou peuvent être séparés en fractions moins. Depuis procédure de FASP est compatible avec tout type de protéase, d&#39;autres enzymes ou leur combinaison peuvent être utilisés à partir de digestions protéiques 6. La qualité de la matière FFPE semble être le problème le plus critique de l&#39;analyse. Nous avons fait l&#39;expérience que le tissu fixé de la même origine, mais provenant de différentscliniques de rentes ont des propriétés distinctes. En utilisant des tissus provenant d&#39;une source, nous avons pu générer des peptides à des rendements élevés, tandis que d&#39;un autre matériau similaire clinique était presque inutile. Il est probable que la fixation et appliqué les procédures d&#39;enrobage ainsi que les conditions de stockage sont les principaux facteurs qui influent sur ​​les propriétés du matériau clinique 12. Par conséquent, il est conseillé de tester les propriétés de quelques échantillons avant de commencer un projet plus vaste. De nombreuses publications ont signalé l&#39;utilisation de la matière de FFPE dans le passé. Cependant, le nombre de protéines identifiées dans ces études n&#39;a jamais dépassé plus de protéines 1000-2000 4. Compte tenu de la taille des protéomes spécifiques de cellules humaines comprenant plus de 10 000 protéines, ces études ont pu seulement de fournir une image très superficielle, presque limité à des protéines hautement abondantes impliquées dans les fonctions d&#39;entretien ménager. Notre protocole permet l&#39;isolement efficace du matériel clinique ou biologique from conservé tissu et est optimisé pour la lyse, la transformation des protéines et des peptides préfractionnement. En conséquence notre échantillon préparation flux de travail, lorsqu&#39;il est couplé à la spectrométrie de masse haut de gamme, permet un aperçu des protéomes presque complets. Notable, cela est possible à des exigences minute montant de l&#39;échantillon. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation des tissus conservés est leur large disponibilité relative. Échantillons FFPE archivés pendant de nombreuses années et des décennies, et parfois considérés comme inutiles, maintenant, grâce à la technologie protéomique, apparaissent comme matériau de grande valeur pour la recherche clinique. Alors que de nombreuses maladies peuvent être étudiés en utilisant l&#39;enquête de matière fraîche ou congelée de matériel FFPE semble être particulièrement important pour l&#39;étude des maladies rares 12, étaient collecte d&#39;un ensemble représentatif de l&#39;échantillon prend généralement beaucoup de temps.

Fixation au paraformaldéhyde et l&#39;intégration dans la paraffine (FFPE) est la méthode standard pour la conservation et l&#39;enquête pathomorphologiques de matériel tissulaire clinique. Microscopie du tissu conservé permet l&#39;identification des maladies liées à des changements morphologiques, et la détection et la notation de l&#39;apparition de maladies liées à des antigènes. Etant donné que généralement seule une petite partie de l&#39;échantillon FFPE est utilisé dans ces analyses, de grandes quantités de matériel clinique restent archivés et peuvent être exploitées dans d&#39;autres types d&#39;études. Au cours de la dernière décennie de la recherche en sciences de la vie a été renforcé par la technologie protéomique puissant. Cette technologie permet l&#39;identification et la quantification de milliers de protéines dans des mélanges complexes de protéines. Une caractéristique importante de cette technologie est que seulement des quantités infimes de matière sont nécessaires pour des analyses à grande échelle. Études protéomiques récentes ont démontré que les protéines peuvent être étudiés sur une échelle de un échantillon de près deLete Protéomes 1, 2. Ce type de système permet d&#39;investigations larges perspectives dans la composition des cellules et l&#39;identification des groupes de protéines qui se produisent à des niveaux anormaux de maladies. Considérant que ces études doivent grandes capacités de spectrométrie de masse, le travail récent a montré que dans la même mesure de l&#39;identification peut être réalisée en une seule journée de mesure 3. L&#39;exigence de la quantité d&#39;échantillon relativement faible et la grande disponibilité des échantillons cliniques et d&#39;autres conservés nous tentés de développer des méthodes permettant l&#39;exploration protéomique de la matière de la FFPE (pour une revue voir 4). Profitant de la réversibilité de la fixation au formol sous un traitement thermique, nous avons mis au point un protocole permettant l&#39;extraction quantitative des protéines à partir du tissu fixe 5. Nous avons montré que la procédure de fixation conserve pas seulement des protéines, mais aussi au moins certaines modifications post-traductionnelles. Phosphorylation et de N-glycosylation peuvent être étudiés en utilisant les échantillons FFPE 5, cependant une condition préalable pour cela est une des conditions de collecte de tissus, de stockage et de fixation contrôlés soigneusement. Ensuite, nous avons optimisé la méthode de microdissection par capture laser de tissu fixe et pour le réacteur en fonction protéomique traitement des échantillons 6, 7. Une étude à grande échelle sur le cancer colorectal a permis une analyse quantitative des protéines à partir de 7500 par microdissection de matériel clinique 8. Enfin, nous avons amélioré la façon de l&#39;exploration de la matière microdissection par l&#39;application consécutive de deux protéines de l&#39;étape protocole de digestion 9. En comparaison avec les stratégies de digestion communes utilisant enzyme unique, cette procédure permet la génération de plusieurs peptides de séquence unique et, par conséquent, se traduit par une plus grande profondeur de l&#39;identification des protéines. Analyse de microdissection adénome colique humaine a permis l&#39;analyse protéomique à une profondeur de 9500 protéines par exemple 3. Dans ce goujony nous avons cartographié 55 000 peptides par échantillon permettant l&#39;identification de 88-89% de protéines d&#39;au moins 2 peptides. Ici, nous présentons un protocole optimisé pour la préparation d&#39;échantillons à partir du matériau pour l&#39;analyse LC-MS/MS FFPE. Ce protocole comprend la préparation de coupes de tissu pour microdissection, la lyse des cellules isolées, et le traitement des échantillons dans un format de réacteur (FASP) 6. Ensuite, nous décrivons une détermination spectrofluorométrique des rendements peptidiques; une tâche avec une grande importance pour l&#39;identification de peptides optimale par la spectrométrie de masse. Enfin, nous démontrons un échangeur fort d&#39;anions (SAX) à base de technique de séparation pour le peptide fractionnement. Dans ce procédé, à la fois la séparation du peptide et le nettoyage final sont effectués en utilisant une pipette à pointe micro-colonnes 10, 11. Cette étape est facultative mais recommandée dans les études où plus de quelques microgrammes peptides peuvent être obtenus à partir d&#39;un seul échantillon. Le SAX-fractionnement peut augmenter considérablement le nombre et la gamme dynamique de identfications et étendre la couverture de la séquence de protéine 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Microscopie Carl-Zeiss GmBH, Göttingen, Allemagne</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon adhésif 200 opaque</td><td>Microscopie Carl-Zeiss GmBH, Göttingen, Allemagne</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline de Mayer </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Allemagne</td><td>MRCF0R030</td><td>(Précédemment vendu sous le nom de Microcon YM-30) </td></tr><tr><td>Empore Anion</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoprotéinase Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

protéomique préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Matériel clinique préservé est une source unique pour la recherche protéomique des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole optimisé permettant l&#39;analyse quantitative à grande échelle de formol et inclus en paraffine fixé (FFPE) tissus. Le procédé comprend quatre étapes distinctes. Le premier est la préparation d&#39;articles à partir du matériau de FFPE et microdissection de cellules d&#39;intérêt. Dans la deuxième étape, les cellules isolées sont lysées et traitées à l&#39;aide &#39;filtre assistée préparation des échantillons&#39; (FASP) technique. Dans cette étape, les protéines sont épuisées à partir de réactifs utilisés pour la lyse de l&#39;échantillon et sont digérés en deux étapes à l&#39;aide de l&#39;endoprotéinase LysC et trypsine. Après chaque digestion, les peptides sont recueillis dans des fractions séparées et leur contenu est déterminée en utilisant une mesure de fluorescence très sensible. Enfin, les peptides sont fractionnés sur microcolonnes «pipette à pointe». Les LysC-peptides sont séparés en 4 fractions alors que la pe tryptiqueptides sont séparés en deux fractions. De cette manière, les échantillons préparés permettent l&#39;analyse des protéomes de quantités infimes de matière à une profondeur de 10 000 protéines. Ainsi, le flux de travail décrit est une technique puissante pour étudier les maladies dans un système à l&#39;échelle de la mode ainsi que pour l&#39;identification de biomarqueurs potentiels et de cibles thérapeutiques.

L&#39;analyse protéomique de matériel FFPE nécessite des méthodes robustes et reproductibles pour la préparation des échantillons. Dans cette publication, nous démontrons un protocole qui permet une isolation efficace des populations de cellules à partir de la matière fixée et de leur traitement chimique résultant en des fractions peptidiques de haute pureté qui peuvent être directement utilisées pour l&#39;analyse LC-MS/MS. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) de fractionnement les peptides (figure 1). Dans la première étape de la procédure, les échantillons FFPE sont coupés avec un microtome et montées sur des lames de la membrane recouverte. Pour augmenter l&#39;adhérence entre les sections de tissu et la surface de la membrane de coulissement est nécessaire d&#39;irradier la surface de glissement avec une lumière UV. A cet effet, on utilise la lumière d&#39;une lampe UVintégré dans un banc de culture cellulaire. Après cette étape, les lames sont soumises à des lavages permettent l&#39;élimination de la paraffine et de réhydratation des échantillons. Le matériau réhydraté est coloré avec l&#39;hématoxyline pendant une courte période. Il en résulte une faible coloration de l&#39;échantillon, mais est suffisant pour la visualisation des zones de l&#39;échantillon pour microdissection. Le procédé de coloration doit être arrêtée rapidement par rinçage des lames avec un excès d&#39;eau. Une coloration prolongée des résultats de l&#39;échantillon des rendements peptidiques pauvres. Dans l&#39;étape suivante, les sections séchées sont soumises à une microdissection. La sélection des zones de tissu de cellules individuelles dépend du type d&#39;enquête et nécessite toujours une connaissance spécifique en histologie ou pathomorphologie. Le matériau laser-libéré est recueilli sur des surfaces adhésives des tubes de prélèvement d&#39;échantillon. Etant donné que la capacité de liaison de la matière adhésive est limitée, il est nécessaire de transférer la matière à partir de la microdissection couvercle à til tube après dissection de chaque 5.3 mm 2 de l&#39;échantillon. Ceci peut être facilement réalisé par pipetage de quelques microlitres de tampon de lyse tissulaire (LTB) sur le couvercle et une courte rotation du tube dans une centrifugeuse. Après que l&#39;échantillon est recueilli dans le fond du tube, la microdissection et le prélèvement de l&#39;échantillon sur le couvercle peuvent être poursuivies. Une fois que la totalité de l&#39;échantillon est collecté les tubes doivent être en plus bouché avec du Parafilm et on les incube dans un bain d&#39;eau à environ 99 ° C avec une agitation continue pendant 1 h. Etant donné que pendant l&#39;incubation de l&#39;eau se condense sur le couvercle, toutes les 15 min les tubes doivent être centrifugés brièvement pour collecter l&#39;eau de retour dans le cône de tube. Pour obtenir des peptides les lysats de tissus sont traités à l&#39;aide de l&#39;approche MED-FASP. Dans ce procédé, les protéines sont épuisées lysées du détergent et d&#39;autres substances de faible poids moléculaire, à carboamidomethylated résidus cystéinyle, puis consécutivement digérés par deux enzymes difféfrances à leurs spécificités de clivage: endoprotéinase LysC et la trypsine. Après chaque étape de digestion des peptides sont recueillis en fractions séparées. Dans cette partie de la préparation des échantillons, il est important de continuer à chacune des étapes de centrifugation jusqu&#39;à ce que plus de 95% de la solution initialement chargé dans l&#39;unité de filtration passé la membrane. L&#39;analyse de tissu de côlon et le cancer de sa nous avons observé que cette procédure rendements 3-6 pg de peptide pour 100 nl (tissu de 100 ug ou 10 mm 2 d&#39;une section de 10 um) de la matière microdisséquée (tableau 1). Étant donné que la protéine totale extraite de tissus est d&#39;environ 10% du poids du tissu les procédures d&#39;extraction et de digestion résultent ensemble dans un rendement de 30 à 60% dans le rapport à l&#39;origine du tissu frais. Ces valeurs reflètent les pertes de la protéine au cours de la déshydratation et de la coloration, microdissection, et la rétention de la partie de l&#39;échantillon non digéré dans les unités d&#39;ultrafiltration. Parce que l&#39;extraction et le traitement de pastissu FFPE n-microdisséquée résulté en un rendement de 5 75%, il est probable que les pertes d&#39;échantillons critiques se produisent au cours des étapes avant MED-FASP protéine-peptide-à-conversion. Une caractéristique importante des mélanges de peptides obtenus par cette procédure est leur grande pureté qui facilite en outre le processus de fractionnement des peptides de fractionnement et l&#39;identification par spectrométrie de masse. Ceci a été montré récemment, par une analyse des échantillons de l&#39;adénome colorectal 3. Dans cette étude, 40% des événements de MS / MS a conduit à l&#39;identification de peptides de tissu FFPE et a abouti à la cartographie d&#39;un maximum de 17 000 peptides seul passage par LC-MS/MS. Taux d&#39;identification plus élevés ont été atteints que dans l&#39;analyse de cellules congelées in vitro en culture 3. Dans les deux dernières parties de l&#39;ensemble de la procédure les peptides isolés sont quantifiés et fractionné sur microcolonnes pipette à pointe. Depuis les quantités de peptide isolé du tissu microdisséqués sont êtrebas 10 ug ils ne peuvent être quantifiés en utilisant des analyses de protéines couramment utilisées à base de colorants. De plus, les A 280 mesures spectrale UV à ces concentrations ne sont pas utiles en raison de l&#39;effet de diffusion de la lumière. En revanche, les mesures de fluorescence des résidus tryptophane offrent un moyen fiable pour la détermination de la teneur en peptide. Récemment, nous avons montré que jusqu&#39;à 5000 protéines à partir de cellules cultivées peuvent être identifiés dans un &quot;seul coup&quot; 4 d&#39;analyse h LC-MS/MS 7. Toutefois, ce type d&#39;analyse appliquée aux tissus natifs permet rarement l&#39;identification de plus de 3.000 milliers de protéines. Pour augmenter la profondeur de l&#39;analyse des peptides générés dans MED FASP doivent être pré-fractionné avant LC-MS/MS. Le micro-colonne de séparation SAX base est une méthode simple et efficace de fractionnement 10. Il a déjà été utilisée dans plusieurs études protéomiques y compris ceux analyser tissu fixe 5, 8, 9. Le SAX-microcolu «pipette à pointe &#39;mns, et le C 18 - dessalage colonnes &#39;StageTip&#39; 9 sont faciles à préparer. Les colonnes sont assemblées par empilement de bouchons, coupés de la SAX ou C 18 membranes, dans une pointe de pipette 200 pl 11. Des exemples de l&#39;analyse des échantillons FFPE SAX fractionnée sont présentés dans le tableau 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la procédure. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) le fractionnement de les peptides. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Échantillon </td><td fo:width="1in"> Échantillon de pré-fractionnement / digestion </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spectromètre de masse utilisé </td><td fo:width="1.25in"> rendement de peptides ng / échantillon nL (± écart-type) </td><td fo:width="1.25in"> Identifications de protéines uniques par échantillon unique </td><td fo:width=".75in"> Référence </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • muqueuse colique normale </td><td> SAX / une enzyme </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colique adénome </td><td> SAX / deux enzymes </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Des résultats représentatifs des analyses protéomiques du tissu microdisséqués FFPE.

Formol archives fixé et inclus en paraffine (FFPE) échantillons cliniques sont un matériel précieux pour l&#39;étude des maladies. Ici, nous démontrons une préparation flux d&#39;échantillons permettant une analyse en profondeur protéomique des tissus FFPE microdissection.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

L'objectif général de cette procédure est de générer et de pré-fractionner des peptides à partir de tissus fixés dans du formol et inclus en paraffine, ou matériaux FFPE, en vue d'une analyse protéomique. Cela est réalisé par l'isolement du tissu ciblé par microdissection, suivi de la lyse cellulaire. La deuxième étape consiste à générer des peptides par traitement de l'échantillon.Utilisation d'une préparation d'échantillon assistée par filtration avec digestion par plusieurs enzymes. Les peptides sont ensuite quantifiés en mesurant leur fluorescence du tryptophane. La dernière étape consiste en la fractionnation des peptides à l'aide d'une technique de séparation basée sur un échangeur anionique fort pour la fractionnation des peptides.En fin de compte, les échantillons préparés permettent l'analyse de protéomes à partir de quantités minimes de matériau, jusqu'à une profondeur de 10 000 protéines. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la digestion en gel ou en solution, est qu'elle s'applique à de très faibles quantités d'échantillons cliniques, tels que des cellules issues de microdissection laser. La méthode fournit des échantillons contenant des peptides parfaits et purs.Qu'est-ce qui facilite l'exploration protéomique des tissus humains et des maladies ? L'ensemble du protocole repose sur des techniques développées et publiées antérieurement. Ces techniques comprennent la méthode fasp à haut rendement, la purification en embout de pipette et la détermination de la teneur en peptides fondée sur la fluorescence du tryptophane, ce qui montre que la procédure sera Mme.Catina, une technicienne de notre laboratoire, prépare les échantillons de tissu pour la microdissection en découpant des sections à l'aide d'un microtome. L'épaisseur des tranches dépend de l'échantillon. Généralement, la microdissection fonctionne bien avec des sections de sept à dix micromètres.Après avoir irradié les lames de membrane avec une lumière UV pendant 45 minutes, monter les coupes sur celles-ci avant de les faire sécher à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Déparaffiner les coupes montées par deux incubations successives dans des bocaux consécutifs de xylène pendant deux minutes et demie et une minute et demie. Ensuite, réhydrater les coupes de manière consécutive.Des incubations d'une minute dans de l'éthanol absolu, de l'éthanol à 70 %, et enfin de l'eau. Après coloration des coupes avec l'hématine de Meyer pendant 20 secondes.Rincez à l’eau pendant une minute et laissez sécher à l’air. Récupérez la population cellulaire d’intérêt à l’aide d’un système de microdissection par capture laser. Lorsque vous utilisez l’instrument palmé, collectez les échantillons dans les capuchons adhésifs en utilisant trois microlitres de tampon de lyse tissulaire pour 10 nanolitres de tissu microdissecté.Appliquer le tampon sur le matériel microdisséqué dans le bouchon et fermer le tube. Recueillir la suspension après une courte centrifugation. Ensuite, lyser le tissu microdisséqué à 99 degrés Celsius dans un bloc chauffant sous agitation pendant une heure.Clarifiez l'extrait brut par centrifugation à 16 000 Gs et à 18 degrés Celsius pendant 10 minutes. Mélangez jusqu'à 50 microlitres du lysat clarifié avec 200 microlitres de la solution UA dans une unité de filtration ultrafine. Puis centrifugez à 14 000 Gs jusqu'à ce qu'il reste moins de 10 microlitres de solution dans le filtre.En général, cette étape nécessite une centrifugation de 10 à 15 minutes. Ensuite, pipeter 200 microlitres de la solution UA dans l'unité de filtration ultrafine et centrifuger. Comme précédemment, vider le tube de collecte avant de pipeter 50 microlitres de la solution IAA dans l'unité de filtration ultrafine.Mélanger à 600 tr/min dans un mélangeur thermique à température ambiante pendant une minute et centrifuger. Comme précédemment, poursuivre les étapes de filtration ultra et de centrifugation telles que décrites dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Puis transférer les unités de filtration vers de nouveaux tubes de collecte.Prélvez 40 microlitres de tampon de digestion contenant l'endoprotéinase lic C avant de mélanger à 600 tr/min dans le mélangeur thermique pendant une minute. Incubez les unités dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Après avoir centrifugé les unités de filtration comme précédemment, prélvez 160 microlitres du tampon DB et centrifugez.Les unités filtrantes par lesquelles passe le flux groupé contiennent les peptides libérés par l'endoprotéase lic C. Ensuite, recueillir les peptides triptyques comme décrit dans le protocole écrit. La mesure de la teneur en peptides des digestats protéiques peut être effectuée dans un tampon dilué, car les résidus de tryptophane sont bien accessibles au solvant. Pour quantifier les peptides, pipeter d'abord 0,2 millilitre de tampon d'essai DB dans la cuvette en quartz Q.Ensuite, placer la Q vet dans le support de l'instrument qve et enregistrer le spectre d'émission du blanc. Préparer une courbe d'étalonnage par paliers de 0,1 microgramme en ajoutant des aliquotes d'un microlitre de la solution standard de tryptophane dans la Q vet et en mélangeant délicatement avec le tampon db. Après nettoyage de la Q vet, prélever l'échantillon à la pipette et enregistrer le spectre de l'échantillon.Passez au calcul de la concentration en protéines et en peptides comme décrit dans le protocole écrit avant la fractionnation. Préparez la colonne SAX en empilant six couches de membrane à ions EM.Import dans une pointe de pipette standard de 0,2 millilitre. Préparez deux colonnes SAX par échantillon.Ensuite, préparez la pointe de colonne en empilant trois couches de M quatre C 18. Dans une pointe de pipette de 0,2 millilitre, fabriquez six pointes de colonne pour chaque échantillon. Pour commencer.Effectuez la fractionnement en diluant les solutions peptidiques obtenues par digestion avec la ly C à l'aide de 0,2 millilitre de tampon universel BRI et Robinson. pH 11 diluez de la même manière les solutions peptidiques obtenues par digestion avec la trypsine à l'aide de 0,2 millilitre de tampon universel BRI et Robinson. pH 5 assemblez la colonne SAX en embout dans le bouchon d'adaptateur de tube centrifuge avant de laver et d'équilibrer la colonne SAX en embout ainsi que les embouts C18, comme décrit dans le protocole écrit.Ensuite, assemblez la colonne SAX sur embout dans l'embout de type C18. Chargez les solutions d'échantillon dans les colonnes SAX équilibrées et centrifugez les colonnes à 5 000 G pendant trois minutes. Lavez les colonnes d'embout avec 0,1 millilitre des échantillons dilués.Facilitez l’écoulement par centrifugation à 5 000 G. Transférez la colonne SAX sur l’étape suivante du tip C18 et continuez à éluer les peptides comme décrit dans le protocole. Après avoir lavé les tips C18 avec 0,05 millilitre de tampon A, éluez les fractions avec 0,05 millilitre de tampon B dans des vials, utilisés ultérieurement pour l’injection des échantillons dans un système de chromatographie liquide couplé à un spectromètre de masse représentatif. Les résultats de l’extraction protéique et de la digestion sont présentés ici.La lyse de 250 nanolitres de tissu, correspondant à une zone microdisséquée de 25 millimètres carrés provenant d'une coupe de 10 micromètres, donne environ 45 microgrammes de protéines totales après la digestion consécutive en deux étapes dans le format fasts avec l'endoprotéase slice C et la trypsine, ce qui conduit à des rendements supérieurs à 50 % des protéines totales. On observe ici une mesure représentative de la teneur en peptides par fluorescence ; les spectres du standard de tryptophane et de l'échantillon présentent des maxima entre 350 et 360 nanomètres. L'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la teneur en tryptophane.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons à partir de tissus riches en protéines pour une analyse protéomique en utilisant la technique de microdissection, le traitement des échantillons et la fractionnement des peptides. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures, auquel s'ajoute le temps nécessaire à la digestion des protéines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser des tranches de tissu fraîchement préparées après leur obtention. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer les protéomes des tissus et des cellules ainsi que les anomalies chez l'humain, à l'aide de matériel fixé et inclus en paraffine.

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