2.6: Transformation bactérienne : la méthode du choc thermique

La transformation bactérienne est une méthode largement utilisée où de l’ADN étranger est introduit dans une bactérie, qui peut ensuite amplifier ou cloner l’ADN. Les cellules qui ont la capacité d’absorber facilement cet ADN sont appelées cellules compétentes. Bien que la transformation se produise naturellement dans de nombreux types de bactéries, les scientifiques ont trouvé des moyens d’induire et d’améliorer artificiellement la compétence d’une cellule bactérienne. Dans cette vidéo, nous allons parler de l’une de ces façons, la transformation par choc thermique.

Avant de parler de la technique du choc thermique, discutons d’abord du type d’ADN le plus couramment utilisé dans la transformation bactérienne : le plasmide. Un plasmide est un petit ADN double brin circulaire qui peut réduire sa taille par superenroulement, de sorte qu’il peut facilement traverser les pores d’une membrane cellulaire.

Un plasmide contient quelques régions importantes qui méritent d’être mentionnées. Les plasmides disponibles dans le commerce contiennent un site de clonage multiple ou MCS. Cette région contient des séquences spécifiques reconnues par des endonucléases de restriction ou des enzymes de restriction, qui clivent l’ADN. Les fragments d’ADN d’intérêt pour le chercheur peuvent être insérés dans le site de clonage multiple lorsque le plasmide et le fragment d’ADN sont coupés avec les mêmes endonucléases.

Les plasmides contiennent également une origine de réplication, ou ORI, qui fournit des informations à la cellule sur l’endroit où la réplication du plasmide doit commencer.

En plus de l’origine de la réplication et du site de clonage multiple, la plupart des plasmides comprendront un gène de résistance aux antibiotiques. Ce gène confère une résistance aux antibiotiques à toutes les cellules qui contiennent le plasmide, ce qui permet à ces cellules de survivre dans des milieux contenant des antibiotiques.

Maintenant que nous avons parlé des plasmides, parlons des cellules dans lesquelles ils seront introduits : les cellules compétentes. Le type de bactérie le plus couramment utilisé dans la recherche et la transformation en biologie moléculaire est E. coli, qui habite également votre intestin inférieur. Les cellules sont généralement rendues compétentes par l’exposition à un environnement riche en calcium.

Les charges positives des ions calcium neutralisent les charges négatives du plasmide et de la paroi cellulaire bactérienne, dissipant la répulsion électrostatique et affaiblissant la paroi cellulaire.

En exposant les cellules à une augmentation soudaine de la température, ou à un choc thermique, une différence de pression entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule est créée, ce qui induit la formation de pores, à travers lesquels l’ADN plasmidique superenroulé peut entrer. Après avoir ramené les cellules à une température plus normale, la paroi cellulaire s’auto-guérit.

Une fois que les cellules ont absorbé le plasmide, elles pourront se développer sur des plaques de gélose mélangées à un antibiotique.

Avant de commencer la transformation par choc thermique, nettoyez la zone de travail et assurez-vous que tout l’équipement est stérilisé.

Assurez-vous d’avoir suffisamment de milieux et de gélose préparés, qui fournissent la nutrition aux bactéries que vous rendrez compétentes. Assurez-vous également de stériliser toutes les solutions par autoclavage. Laisser refroidir le fluide liquide à température ambiante avant utilisation et laisser refroidir la gélose à 50-55 ? C, la température à laquelle l’antibiotique peut être ajouté et les assiettes versées. Laisser les plaques refroidir à température ambiante pour se solidifier.

Lorsque l’on travaille avec des bactéries, il faut toujours utiliser une technique aseptique pour maintenir la stérilité. La technique aseptique implique généralement l’utilisation d’un bec Bunsen pour stériliser les instruments et les réactifs et créer un courant de convection ? ce qui empêche les contaminants en suspension dans l’air de pénétrer dans l’espace de travail.

Immédiatement avant la réaction de choc thermique, préchauffez votre milieu à température ambiante et les plaques de gélose LB contenant des antibiotiques à 37 °C. Assurez-vous également que votre bain d’eau est à 42°C.

Ensuite, décongelez les cellules chimiquement compétentes sur de la glace.

Ajouter, 1-5uL de 1ng/ ? L refroidissez le plasmide sur les cellules bactériennes, mélangez doucement et remettez le mélange de cellules et de plasmides dans la glace pendant 30 minutes.

Lorsque le temps est écoulé, la chaleur choque le mélange de cellules et de plasmides en le plaçant dans un bain d’eau à 42 ? C pendant 30 secondes.

Immédiatement après avoir sorti le tube du bain-marie, mettez-le sur de la glace et ajoutez-en 450 ? L des médias. Le placer dans un incubateur à secouer pour 37 ? C pendant 1 heure à plus de 225 tr/min pour que les cellules puissent récupérer.

En utilisant une technique d’asepsie appropriée, ajoutez 20 à 200 μL de bactéries dans une plaque de gélose LB et étalez le milieu avec un épandeur de bactéries. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 ? C à l’envers pour éviter l’exposition des bactéries à la condensation.

Le lendemain, les bactéries qui ont absorbé le plasmide forment des colonies.

Ensuite, comptez les colonies pour calculer l’efficacité de la transformation, c’est-à-dire le nombre de transformants réussis divisé par la quantité totale d’ADN plaquée.

Maintenant, les colonies peuvent être sélectionnées pour d’autres expériences.

Avant d’être rendues aptes, les bactéries utilisées dans la transformation sont stockées dans le congélateur. Ils doivent être décongelés sur de la glace, étalés sur une plaque d’agar ? sans antibiotiques, et laissé croître pendant la nuit à 37°C.

À l’aide d’une technique aseptique, sélectionner une colonie bactérienne dans la plaque de gélose et la faire croître dans une grande culture de 500 ml pendant la nuit à 37° ? C dans un incubateur à secousses ? Un instrument qui empêche la sédimentation des bactéries et même la dispersion des nutriments dans le milieu.

Pendant que les cellules se développent, faites 0,1 molaire de chlorure de calcium et 0,1 molaire de chlorure de calcium plus 15 % de solutions de glycérol, autoclave et laissez refroidir.

Les mesures d’absorbance sont utilisées pour déterminer si les bactéries sont ou non dans leur phase de croissance mi-logarithmique, ce qui signifie qu’elles absorberont facilement l’ADN. Une fois que les cellules ont atteint cette phase, placez-les sur de la glace et conservez-les là tout au long de la procédure.

Ensuite, séparez les cellules bactériennes en deux grands tubes à centrifuger et tournez à 4°C. Videz le surnageant et remettez en suspension dans environ 100 ml 0,1 molaire de chlorure de calcium froid. Ensuite, incubez des cellules sur de la glace pendant 30 minutes. Cette étape est répétée au moins une fois de plus. Les cycles de rotation et de remise en suspension des cellules sont souvent appelés lavage de vos cellules.

Après le lavage final, remettre les cellules en suspension dans une solution froide de chlorure de calcium à 0,1 molaire de 50 ml et de glycérol à 15 %. Ces cellules sont maintenant chimiquement compétentes.

Distribuer 50 ? L de bactéries dans plusieurs tubes microfuges et stockés à -80 ? C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le choc thermique.

Il existe de nombreuses applications et variantes de la transformation bactérienne.

En plus du choc thermique, l’élétroporation est une autre technique courante de transformation. Comme son nom l’indique, l’électroporation consiste à utiliser l’électricité pour créer des pores dans la membrane cellulaire bactérienne à travers lesquels l’ADN peut passer.

En ce qui concerne le dépistage des bactéries transformées, les plasmides contiennent souvent un gène codant pour l’enzyme bêta-galactosidase pour faciliter le dépistage. Lorsque le substrat de cette enzyme est inclus dans des plaques de gélose, les bactéries qui ont été transformées avec des plasmides contenant un insert produisent des colonies blanches, tandis que celles qui ne le font pas produisent des colonies bleues. Cette méthode est appelée criblage bleu et blanc.

Dans la plupart des expériences de transformation, l’objectif est d’amener les bactéries à se diviser rapidement pour fabriquer de grandes quantités de votre plasmide, qui inclut votre gène cible. Après la transformation bactérienne, l’étape suivante consiste à faire pousser de grandes quantités de bactéries dans un milieu liquide contenant des antibiotiques et à effectuer une purification des plasmides, qui, comme son nom l’indique, consiste à purifier les plasmides des bactéries. De nombreux kits commerciaux sont disponibles à cet effet.

Parfois, le but de la transformation est de faire en sorte que les bactéries génèrent de grandes quantités de protéines codées par le plasmide. Ici, vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées avant qu’une technique appelée purification d’affinité puisse être effectuée pour isoler la protéine cible. Après avoir purifié de grandes quantités de la protéine, celle-ci peut ensuite être cristallisée et la structure de la protéine d’intérêt peut être identifiée.

Vous venez de regarder JoVE Introduction to Heat Shock Transformations. Dans cette vidéo, nous avons passé en revue : ce qu’est la transformation par choc thermique et comment elle fonctionne, le principe qui la sous-tend et comment réussir à transformer les bactéries. Merci d’avoir regardé !