La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

L'objectif général de cette procédure est de présenter un modèle de transplantation cellulaire fondé sur l'utilisation de cellules olfactives et de cellules en gaine dans un modèle de lésion du nerf laryngé. Cela est réalisé en sectionnant d'abord le nerf laryngé récurrent, puis en effectuant une anastomose. Ensuite, les cellules olfactives et les cellules en gaine, obtenues à partir de la muqueuse olfactive ou des bulbes olfactifs, sont transplantées.

Ensuite, deux à trois mois après la chirurgie, les animaux sont évalués par laryngoscopie et électromyographie. Enfin, le nerf laryngé récurrent est isolé pour des études histologiques. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que les cellules olfactives et les cellules de gaine améliorent la régénération axonale du nerf laryngé récurrent ainsi que la récupération fonctionnelle des cordes vocales par laryngoscopie, électromyographie et analyses histologiques.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des lésions des nerfs périphériques, qui concernent la mesure de la croissance axonale et la capacité à quantifier la fonctionnalité de la récupération. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car l'anastomose récurrente des nerfs laryngés exige des compétences microchirurgicales. Après avoir généré des cultures primaires marquées par la GFP à partir des bulbes olfactifs (OB) et de la muqueuse olfactive (OM), comme décrit dans le protocole écrit, préparez la chirurgie en stérilisant tous les instruments par autoclavage.

Une fois que le rat a été anesthésié par injection intrapéritonéale de kétamine et de chlorpromazine, vérifiez le niveau de sédation en effectuant une pincée du orteil. Rasez la zone chirurgicale et placez le rat en décubitus dorsal, désinfectez la peau par des lavages alternés d'alcool et de solution de Bétadine. Ensuite, préparez un environnement chirurgical stérile et maintenez des procédures stériles tout au long de l'intervention chirurgicale.

Utilisez un scalpel pour pratiquer une incision cutanée cervicale médiale de deux centimètres. Ensuite, en suivant la ligne blanche médiane, effectuez une incision verticale des muscles infra-hyoïdiens à l’aide d’un rétracteur orthostatique placé entre les muscles infra-hyoïdiens. Exposez le larynx, puis le nerf laryngé récurrent ou NLR.

Ensuite, sous un microscope chirurgical, utiliser des ciseaux microchirurgicaux pour couper complètement le nerf au niveau du septième anneau trachéal à l’aide d’un point de suture 11 T. Réaliser une anastomose pour désinnervé le larynx juste avant la transplantation. Utiliser une solution de trypsine EDTA à 0,05 % pour détacher les cellules OB et OM des boîtes de culture.

Ensuite, pour arrêter la digestion, ajouter cinq millilitres de milieu tiède après avoir centrifugé les cellules à 432 G pendant cinq minutes. Utiliser un hémocytomètre pour dénombrer les cellules et ajuster la concentration cellulaire dans ce modèle entre 1,2 et 6 × 10⁶ cellules dans 30 microlitres de D-M-E-M-F 12 utilisés dans un tube microfuge. Préparer un rapport de un à deux entre les cellules et le facteur de croissance, la matrigel réduite, et placer le mélange sur de la glace juste avant la transplantation.

Retirez le tube de la glace et tenez-le pour réchauffer le mélange. À l’aide d’une pipette, déposez la solution de Matrigel contenant les cellules sur le site d’anastomose et laissez le mélange s’auto-assembler sur le nerf lésé une fois pris. Utilisez quatre points de suture 4-0 pour fermer les muscles et la peau.

Placer le rat dans une cage individuelle et le maintenir sous une lampe chauffante pendant 24 heures. Administrer des analgésiques pendant les cinq jours suivants, environ deux mois après l'intervention chirurgicale et après anesthésie. Chez les rats comme décrit précédemment dans cette vidéo, utiliser une pression sur l'orteil pour confirmer la sédation.

Placer le rat en décubitus dorsal avant d'insérer un laryngoscope vidéo réglé à 30 degrés. Ajuster le laryngoscope afin d'obtenir la meilleure vue possible de la larynx, en reproduisant exactement la même image pour chaque enregistrement. Identifier les repères anatomiques tels que la commissure postérieure, la corde vocale droite au niveau de son insertion dans l'apophyse vocale de l'OID et la corde vocale gauche au niveau de son insertion dans l'hypothèse vocale de l'OID.

Enregistrer les mouvements des cordes vocales en sélectionnant trois séquences successives d'abduction maximale et d'adduction maximale. Pour analyser la fonction laryngée, déterminer le mouvement angulaire absolu en mesurant la différence entre les mouvements d'abduction maximale et d'adduction maximale des cordes vocales. Déterminer le score dynamique en mesurant l'amplitude du mouvement et le score fonctionnel en mesurant les mouvements de synkinésie et les mouvements paradoxes afin de réaliser une électromyographie.

Placer une électrode sur le muscle ischio-jambier du rat après avoir exposé le larynx et la trachée, comme illustré pour l'anastomose du nerf récurrent. Exposer le cartilage crico-thyroïdien. Ensuite, à l'aide de ciseaux microchirurgicaux, ouvrir le cartilage crico-thyroïdien afin d'exposer le muscle postéro-crico-aryténoïdien ou PCA.

Insérez une électrode aiguille monopolaire dans le muscle chez l'animal sous ventilation spontanée. Utilisez un système d'acquisition pour enregistrer l'activité musculaire électrique du muscle PCA. Analysez l'activité musculaire en termes de richesse et de synchronisation avec la respiration en attribuant un score qualitatif allant de zéro à trois selon l'échelle suivante.

Zéro correspond à un tracé non essayé sans augmentation pendant l'inspiration. Un correspond à un tracé rythmé avec augmentation à l'inspiration, mais un tracé deux correspond à un tracé rythmé avec une activité plus riche, et trois correspond à un tracé rythmé très riche, constituant un motif d'interférence similaire à une activité volontaire maximale.

Ensuite, afin d'éviter d'endommager le NRL en raison de sa petite taille, exposer le nerf vague, puis fixer une électrode et stimuler à ce niveau. Enregistrer la latence et la durée du potentiel dans le muscle CPA. Enfin, après avoir euthanasié l'animal à l'aide d'une surdose de pentobarbital sous microscope, localiser l'anastomose, suturer et retirer le moignon distal du NRL situé entre l'anastomose et le larynx.

Réaliser l'analyse histologique conformément au protocole décrit ici après la transplantation de cellules provenant de cultures primaires de muqueuse olfactive et de bulbes olfactifs, qui sont des exemples d'enregistrements EMG obtenus dans le muscle PCA durant la respiration. Les animaux du groupe témoin présentaient une activité musculaire électrique intense avec une augmentation pendant l'inspiration, activité absente dans le groupe lésé. Sur cette figure, les analyses histologiques du NRL par coloration au bleu de méthylène montrent des profils typiques de fibres provenant d'animaux normalement réinnervés et transplantés.

Cette mesure permet la quantification du nombre de fibres myélinisées, de la taille moyenne des fibres et de l'épaisseur moyenne de la myéline, comme illustré ici. Pour réaliser les analyses histologiques, le suivi des cellules positives pour la GFP a été effectué après transplantation intranerveuse dans le nerf sciatique.

Ce site a été choisi plutôt que le RLN car la petite taille du RLN empêche la transplantation intraneuromatique. Une anastomose de type Hans peut être réalisée en 15 minutes si elle est effectuée correctement après sa mise au point. Ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des lésions des nerfs périphériques pour explorer l'utilisation de la transplantation cellulaire dans un modèle rat.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de transplanter des cellules dans le modèle de lésion récurrente du nerf et d'évaluer la récupération fonctionnelle des cordes vocales par électromyographie, endoscopie en laboratoire et analyses histologiques.