Utilisation de la cytométrie d'image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les levures pathogènes en association avec les cellules hôtes sans mettre en plaques les unités formant des colonies. Tout d’abord, infectez les cellules macrophages avec une capsulation H ou les cellules de levure C albicans colorez les cellules macrophages infectées avec de l’orange aïne et de l’iodure de propidium pour mettre en évidence les cellules de levure viables. Ensuite, à l’aide d’un cytomètre d’imagerie, capturez une série d’images et analysez les paramètres de taille et de forme pour dénombrer avec précision les cellules de levure.

Les résultats de la cytométrie d’image peuvent être utilisés efficacement pour quantifier les levures pathogènes en association avec les cellules hôtes. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lors de recherches dans le domaine de la pathogenèse fongique, dans laquelle je devais à plusieurs reprises plaquer et compter les unités formant des colonies pour quantifier la capsule du champignon pathogène Histoplasma. Le principal avantage de la cytométrie d’image par rapport à la méthode standard de dénombrement des UFC est sa vitesse accrue car elle élimine les étapes fastidieuses de placage, d’incubation et de comptage de plusieurs dilutions en série d’UFC lors de la comparaison de la croissance de souches de type sauvage et mutantes dans les cellules hôtes.

Cette méthode élimine le biais potentiel introduit par les différentes capacités à initier une croissance de qualité sur des supports solides. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent être mises au défi par la cytométrie d’image. Instrumentation et logiciels.

Commencez la procédure en cultivant les macrophages à la densité souhaitée. Dans des plaques de 24 puits, ajoutez les cellules fongiques en phase de croissance logarithmique, puis incubez pendant 90 minutes pour permettre la phagocytose. Ensuite, lavez les macrophages trois fois avec du PBS pour éliminer les champignons extracellulaires qui incubent pendant les points temporels définis expérimentalement avant l’analyse des échantillons à faible multiplicité d’infection, les cellules macrophages infectées restent viables pendant plusieurs jours et les échantillons peuvent être analysés environ toutes les 12 à 24 heures.

Après trois lavages avec du PBS, ajoutez 0,5 millilitre d’eau stérile aux cellules macrophages infectées. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour libérer les champignons des cellules macrophages. Ensuite, récoltez le lysat dans un tube stérile et conservez-le sur de la glace.

Transférez 20 microlitres de lysat dans un tube séparé. Ajouter 20 microlitres de solution d’iodure de propidium à l’orange aïne pour une analyse cytométrique d’image immédiate. Effectuer une dilution décuplée des lysats dans les milieux.

Plaquez ensuite 100 microlitres de chaque dilution en double. Sur plaques HMM aros. Incuber les plaques dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant sept à huit jours.

Comptez manuellement les colonies sur les plaques, en affichant un minimum de 100 et un maximum de 1000 colonies distinctes. Pour collecter les macrophages vivants, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de PBS et incubez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez les macrophages des puits de culture tissulaire par pipetage doux. Transférez le liquide dans un tube stérile et conservez-le sur de la glace. Pour configurer l’accéléromètre, insérez les modules optiques de fluorescence dans le système et assurez-vous qu’ils sont verrouillés en place.

Activez le cytomètre d’image dans le menu déroulant des tests du logiciel. Sélectionnez le type de test prédéfini et le type de cellule pour la viabilité. Le test est optimisé pour la détection de l’orange aïne et de l’iodure de propidium pour la détection de l’infection à Candida albicans.

Le test est optimisé pour la détection de la GFP. Ouvrez maintenant l’onglet des options et cliquez sur prendre une image d’arrière-plan Une fois l’opération terminée, cliquez sur l’aperçu de l’image en fond clair pour la mesure de la viabilité A OPI. Mélangez 20 microlitres d’échantillon avec 20 microlitres d’OPI A et pipetez dans la chambre de comptabilité pour le taux d’infection à candida albicans.

Mélangez bien l’échantillon et pipetez-le directement dans la chambre de comptage. Une fois que les cellules se sont installées dans la chambre, insérez la chambre de comptage dans le cytomètre d’image pour l’acquisition d’image. Mettez l’échantillon au point, puis cliquez sur compter.

Une fois l’opération d’acquisition d’image terminée, retirez la chambre de comptage jetable et jetez-la correctement. Pour une mesure OPI A, les résultats de concentration et de viabilité sont affichés sur la page des résultats de comptage afin de déterminer le taux d’infection à Candida albicans. Après avoir obtenu les résultats du comptage, cliquez sur exporter.

Envoyez ensuite les données à FCS express quatre pour l’analyse de la population cellulaire de la GFP. Dans FCS express, importez le fichier de données et tracez les résultats dans un histogramme de fluorescence. Ensuite, appliquez une porte de population cellulaire à l’histogramme pour déterminer les pourcentages de population de cellules infectées par Candida albicans.

Cette expérience surveille la croissance des cellules macrophages infectées par la levure hcaps Lotum à des moments définis. Les échantillons sont colorés et analysés par cytométrie basée sur l’image. Les cellules de levure libérées des macrophages lacés sont identifiées par le logiciel de vision Soter.

Ici, le nombre absolu de levures vivantes détectées est supérieur à celui des levures capables de former des colonies sur un milieu solide. Ces données mettent en évidence la présence d’un nombre important de cellules viables, mais non cultivables. Ces macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été infectés par des cellules de levure C albican exprimant une protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur A DH one.

Des multiplicités d’infection allant de 0,1 à 10 ont entraîné des augmentations progressives de l’intensité de la GFP dans les macrophages infectés, ainsi que du pourcentage total de macrophages infectés une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en seulement quelques minutes par échantillon si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de définir les paramètres de sorte que seules les cellules fongiques et non les cellules hôtes soient comptées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la cytométrie d’image pour quantifier les levures pathogènes en association avec les cellules hôtes. N’oubliez pas que travailler avec des champignons pathogènes peut être extrêmement dangereux, alors portez un équipement de protection individuelle et suivez les procédures appropriées d’élimination des déchets biologiques.