Name: La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez la micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles dans la préférence de place conditionnée chez la souris. Cette méthode permet d'analyser les phases d'acquisition, d'extinction et de réinstatement.

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Les auteurs tiennent à remercier Anni Lee et Maureen Byrne pour leur aide dans l&#39;établissement du protocole de préférence de place conditionnée prolongée.

Toutes les procédures sont menées en conformité avec le Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care et les règles du Comité d&#39;utilisation. 1. Préparation et installation de livraison stéréotaxique de vecteurs viraux <ol><li> Si un instrument, écouvillon stérile, ou porter des gants stériles main est contaminée en entrant en contact avec une surface non stérile, jeter ou re-stériliser l&#39;instrument en utilisant un stérilisateur à billes chaud, jeter l&#39;écouvillon ou changer pour de nouveaux gants stériles. </li><li> Placez une cage de la souris avec la literie sur un bloc de chaleur pour réchauffer pour la récupération post-opératoire. </li><li> Mettre en place un rasoir électrique pour tête de rasage et de l&#39;éthanol et de l&#39;iode pour stériliser le cuir chevelu. </li><li> Essuyez barres d&#39;oreilles et la bouche maintien de la stereotax avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 5 pi seringue Hamilton, dresser 5 pi du vecteur viral (1 x 10 6 particules virales / pl) et mis en place dans le porte-seringue sur stereotax. </li><li> Coussin chauffant à micro-onde ou de tourner sur un bloc électriqueème place sur stereotax. Couvrir avec un tampon absorbant propre pour réduire le risque de brûlures. Surveillez la température du corps de la souris (entre 97 à 99,5 ° F) fréquemment tout au long de la procédure. </li><li> Injecter souris (pesant entre 22-35 g) avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (20 mg / kg). Une fois que la souris est anesthésiée, extrémité de la queue de pincement pour vérifier les réflexes de la souris et notez tout mouvement ou une réponse à ce que la souris est correctement anesthésié. </li><li> Raser la tête entre les oreilles et les yeux. </li><li> Nettoyez la tête rasée avec de l&#39;éthanol et de l&#39;iode applicateurs de coton stériles alternatif. </li><li> Transfert souris pour coussin chauffant sur stereotax. </li></ol> 2. La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux <ol><li> Porter des gants stériles tout au long de l&#39;opération. Si les gants sont contaminés à tout moment en touchant des surfaces non stériles, changer de gants. </li><li> Zéro barre des dents et des écailles de la barre de l&#39;oreille. </li><li> Réglez les dents dans la barre de dent. </li><li> Visser museau. Si tortillant ou moustache mouvementment est à noter, à tout moment, d&#39;administrer une dose de rappel ip (~ 0,05 cm) d&#39;un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (20 mg / kg). </li><li> Visser dans les bars de l&#39;oreille. </li><li> Lubrifier les yeux avec PuraLube. </li><li> Couper le cuir chevelu ouvert à tout juste derrière les oreilles avec un scalpel. </li><li> Placez les clips de bouledogue sur les coins du cuir chevelu à peler la peau loin de crâne. Bregma et lambda doit être facilement visible. </li><li> Assurez-vous de suture bregma au lambda est aligné droite. Si la suture est le positionnement réajuster tordu de la tête. </li><li> Assurez-vous que tous les paramètres de la stereotax sont mis à zéro. </li><li> Mettez pointe de l&#39;aiguille en place au bregma. </li><li> Mesurez toutes les coordonnées pour les deux bregma et lambda. Cela comprend les coordonnées dorsale / ventrale, interne / externe et antérieur / postérieure. </li><li> Ajuster la tête jusqu&#39;à ce que les coordonnées ventrales pour bregma et lambda est inférieur à 0,02 mm les uns des autres. </li><li> Une fois aligné, à partir de bregma aller dedans sur les coordonnées interne / externe (M / L). S&#39;assurerles côtés gauche et droit sont alignées à l&#39;intérieur de 0,02 mm les uns des autres. </li><li> Extrémité de l&#39;aiguille Re-centre sur bregma et de là déplacer dans la direction antérieure / postérieure (P / A) pour la coordonnée antérieure / postérieure désirée. </li><li> Si nécessaire, aiguille angle dans un sens et s&#39;assurer que le stereotax est verrouillé. Allez vers la gauche M / L de coordonnées (+ / - 1,52) </li><li> Mesurer la position ventrale de la partie supérieure du crâne à utiliser comme référence après le trou de forage est foré. </li><li> Forer un trou de forage utilisant un trépan de forage stérile à la coordonnée désirée. Vérifiez que l&#39;aiguille ne peut entrer sans interruption à travers le crâne. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille à la coordonnée ventral souhaité. </li><li> Une fois la coordonnée est atteinte, trempette 0.015 mm en dessous de ~ 10 sec pour créer une petite poche pour le vecteur viral. </li><li> Injecter le volume désiré de vecteur viral à un taux d&#39;environ 0,1 ul / min. Attendre 3 minutes pour vecteur viral pour diffuser complètement. Soulever le nez aiguille 0,015 mm et d&#39;attendre 2 min de plus. </li><li>Plonger l&#39;aiguille (si cela injections inclinées) dans la direction opposée. Encore une fois, enregistrer la position ventrale comme une référence pour le sommet du crâne. </li><li> Répétez les mêmes étapes que sur la première face à injecter vecteur viral sur le côté opposé (si cela injections bilatérales). </li><li> Appliquer de la cire d&#39;os pour les deux trous de les sceller avec l&#39;extrémité en bois d&#39;une pointe d&#39;applicateur de coton stérile. </li><li> Suturer le cuir chevelu. </li><li> Appliquer bloc du nerf de la zone blessée. </li><li> Retirer souris de stereotax et le placer dans la cage réchauffé sur le bloc thermique pour récupérer pendant 45 min. </li><li> Surveiller les signes de la douleur, y compris: diminution de l&#39;activité globale ou agitation, diminution de la nourriture et la consommation d&#39;eau ou d&#39;augmentation de vocalisation. La buprénorphine (0,05 à 0,2 mg / kg) peut être administré deux fois par jour pendant une semaine si nécessaire pour la douleur. Alternatives acceptables: la mépéridine (20-60 mg / kg), la pentazocine (10 mg / kg), nalbuphine (4-8 mg / kg). </li></ol> 3. Préférence de place conditionnée: Acquisition, Extinction, et Rétablissement <ol><li> Placez la souris dans la chambre centrale d&#39;un appareil de préférence lieu à trois chambres (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) pour une période d&#39;habituation 60 sec de portes à guillotine fermés. </li><li> Après accoutumance, portes à guillotine ouverts et permettre souris exploration libre des 3 chambres pour 1.200 sec, le temps passé dans chaque chambre étant enregistrées en utilisant le logiciel MedPC IV (Med Associates, Inc.). </li><li> Attribuer des souris à des chambres de conditionnement en fonction de leur performance lors du pré-test. En utilisant une conception, l&#39;administration de médicaments paire biaisée pendant les suivantes 3 jours avec le compartiment qui était moins pratique au cours de la pré-test de référence. </li><li> Durant les 3 prochains jours de conditionnement, d&#39;injecter des souris avec de la cocaïne (10 mg / kg; ip) au cours de la séance du matin et les enfermer dans leur chambre attribué à 1,200 sec immédiatement après l&#39;injection. Retour souris dans leur cage d&#39;origine après la séance. Après 4 h, injecter des souris avec une solution saline (0,01 ml / gpoids corporel) et les confiner dans la chambre opposée à la session de 1200 sec l&#39;après-midi. </li><li> Pour tester l&#39;acquisition, placez la souris dans la chambre centrale de portes à guillotine fermées pour une période d&#39;habituation 60 sec. Portes à guillotine s&#39;ouvrir et laisser le libre exploration pour 1200 sec, le temps passé dans toutes les chambres enregistrées par le logiciel MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calculer préférence en soustrayant la quantité de temps passé dans la chambre saline apparié à partir de la quantité de temps passé dans la chambre de cocaïne appariés. </li><li> Pour éteindre la préférence de place, exposer des souris à deux séances de 20 min de l&#39;exploration libre tous les jours dans le même appareil, séparés par au moins 2 heures, en commençant 24 heures après le test d&#39;acquisition. Le temps passé dans toutes les chambres devrait à nouveau être enregistrée et l&#39;ampleur de l&#39;initiale du RPC devrait être comparée à celle de chaque séance d&#39;extinction. </li><li> Déterminer si les souris ont éteint la préférence induite par le médicament en évaluant si la préférence pour un pied d&#39;égalitéchambre particulière sur deux jours consécutifs extinction est nettement inférieur à celui du score de préférence d&#39;acquisition. </li><li> Rétablir souris avec une dose d&#39;amorçage de la cocaïne (5 ou 10 mg / kg; ip) et ré-exposer à l&#39;appareil permettant la libre exploration et d&#39;enregistrer le temps passé dans chaque compartiment. </li><li> Administrer la solution de l&#39;euthanasie Euthasol (150 mg / kg). Transcardiaque perfuser des souris avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) et d&#39;effectuer un examen histologique de valider le placement de micro-injection correcte. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Régional et l&#39;ablation d&#39;un gène spécifique temporellement par micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux associés avec le RPC qui comporte des phases de remise en extinction et de permettre de retrouver les contributions spécifiques des gènes à trois phases distinctes de comportement addictif-like. Alors KO conditionnel qui est réalisé en utilisant le système Cre-loxP traditionnelle prévoit spatio-temporellement ablation génique limité, micro-injection stéréotaxique Cre-recombinase dans des zones discrète...

La cocaïne est un psychostimulant très renfort. Après une exposition répétée, plusieurs adaptations moléculaires et cellulaires se produisent en récompense pertinente circuits du cerveau qui sont censés entraîner compulsif comportement cherchant le médicament, ce qui incite les taux élevés de rechute qui posent un sérieux problème clinique 1. La cocaïne exerce ces effets comportementaux durables en régulant l&#39;expression des gènes. Pour étudier les adaptations qui découlent de l&#39;utilisation chronique de la cocaïne, des modèles de rongeurs précliniques ont été utilisés. Un tel modèle est la préférence lieu (RPC) paradigme conditionné. Ce modèle implique le développement d&#39;une association entre un environnement appris précédemment neutre et les propriétés gratifiantes de cocaïne. Après plusieurs paires de cocaïne d&#39;une chambre particulière, les animaux sont autorisés à explorer librement les environnements de cocaïne appariés et non appariés cocaïne et s&#39;ils préfèrent le compartiment drogue jumelés, ils auraient acquis une plac induite par la cocaïnee préférence. Par ailleurs, après une période de formation d&#39;extinction, ce paradigme peut être utilisé pour étudier la réintégration du contexte spécifique de cocaïne comportement de recherche. Par rapport à d&#39;autres modèles de comportement des conduites addictives-like, comme la sensibilisation psychomoteur, qui est utilisé pour étudier à long terme induite par la cocaïne et de la plasticité comportementale moléculaire 2,3 et l&#39;auto-administration (SA), qui est pensé pour plus de précision imiter dépendance -comme le comportement constaté chez les humains, le paradigme du RPC est une procédure simple pour étudier la cocaïne apprentissage contextuel 4. Protocoles RPC peuvent être facilement étendus pour inclure les phases de remise en extinction et, de manière similaire à SA, qui permettent d&#39;enquête sur les mécanismes qui sous-tendent le besoin de drogue et la rechute 5-7 et qui sont soupçonnés de récapituler les aspects de ce qui se passe chez l&#39;homme comportement cherchant le médicament et médicament - et cue-induite rechute 8-10. Un mécanisme qui sous-tend l&#39;induite par la cocaïne plasticité comportementale qui est caractéristique de chacune des phases distinctes du RPC, y compris l&#39;acquisition, extinction, et la réintégration, est l&#39;activation des signatures uniques de l&#39;expression des gènes dans les différentes régions du cerveau. Pour tester directement les gènes dans les régions du cerveau récompense pertinents médiation cocaïne induit des changements de comportement, il est utile d&#39;être capable de manipuler de manière sélective d&#39;une manière spécifique à chaque région. Une façon d&#39;y parvenir est de micro-injection des vecteurs recombinants ADENOASSOCIE virales (rAAV) qui expriment la recombinase Cre en utilisant la chirurgie stéréotaxique, dans des zones distinctes du cerveau de souris qui ont des gènes cibles flanqué par des sites loxP (souris floxés). Cette méthode permet un contrôle temporel et régional très précise où et quand les gènes sont ablation, dans les deux neurones division et non de division, sans induire des réponses immunitaires 11-13. Ce niveau de contrôle représente un avantage important sur la technologie Cre-loxP traditionnelle de la reproduction des souris floxés wvec des souris exprimant la recombinase Cre sous le contrôle d&#39;un promoteur du gène endogène, en ce que le timing et la distribution de délétion du gène peuvent être plus étroitement réglementés. En outre, viral knock-out du gène vecteur médiée contourne effets compensatoires de développement potentiels qui peuvent survenir en utilisant des stratégies de finale traditionnels. En plus de la cocaïne RPC, qui est décrit ici, la micro-injection de rAAV-Cre dans le cerveau de souris floxés d&#39;évaluer le rôle des gènes spécifiques peuvent être appliquées ubiquitaire de paradigmes comportementaux qui impliquent des phases distinctes, y compris l&#39;auto-administration et de sensibilisation psychomoteur. Par exemple, notre laboratoire a utilisé la technologie rAAV-Cre pour étudier le rôle de Ca v 1.2 L de type canaux Ca 2 + de la cocaïne psychomoteur sensibilisation 14. Plus précisément, VAAr-Cre a été micro dans le noyau accumbens (NAC) de souris avec le gène codant Ca v 1.2 floxé, pour démontrer que Ca v </sub&gt; 1.2 agissant dans cette région médiateur de la phase d&#39;expression de la sensibilisation psychomoteur 14,15. Cependant, la stratégie VAAr-Cre ne peut pas être utilisé si des souris avec un gène floxé d&#39;intérêt n&#39;existent pas, comme cela a été notre expérience lors de l&#39;évaluation du rôle de Ca v 1.3 L de type canaux Ca 2 + dans la sensibilisation psychomoteur. Par conséquent, une limitation de l&#39;utilisation de rAAV-Cre se présente si les souris conditionnelles n&#39;existent pas pour un gène d&#39;intérêt particulier. Cependant, rAAVs qui siRNA Express peut être utilisé à des gènes cibles de knockdown, comme nous l&#39;avons fait pour examiner le rôle de Ca v 1.3 canaux 14,15. Microinjection VAAr-Cre dans des régions discrètes du cerveau de souris floxés puis de les tester dans le paradigme du RPC permet d&#39;enquête sur les gènes spécifiques qui interviennent dans les différentes phases du comportement addictif-comme et où ils agissent. L&#39;utilisation de ce paradigme a contribué à notre compréhension de la façon dont l&#39;administration répétée de cocaïne en essence détourne le brains circuit de la récompense provoquant des changements inadaptés dans les voies de transduction du signal moléculaire et l&#39;expression des gènes qui conduisent à l&#39;état de dépendance 1,16,17.

<table><tbody><tr><td></td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, États-Unis Med-CPP-MS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’alignement stéréotaxique pour souris</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, États-Unis</td><td>modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Hamilton</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada,</td><td>États-Unis 7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphie, PA, États-Unis</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphie, Pennsylvanie, États-Unis</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

la micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjection viraux adéno-associé vecteurs recombinants (rAAV) exprimant la recombinase Cre dans les régions du cerveau de souris distinctes sélectivement les gènes de finale de l&#39;intérêt permettent une régulation temporelle et régionale spécifique de délétion du gène, par rapport aux méthodes existantes. Alors que la suppression conditionnelle peut également être obtenue par des souris d&#39;accouplement qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle de promoteurs de gènes spécifiques avec des souris porteuses d&#39;un gène floxé, la micro-injection stéréotaxique permet de cibler des zones discrètes du cerveau à des moments déterminés expérimentateur d&#39;intérêt. Dans le cadre de la cocaïne préférence de place conditionnée, et d&#39;autres paradigmes comportementaux de la cocaïne comme l&#39;auto-administration ou de sensibilisation psychomoteur qui peuvent impliquer phases de réintégration retrait, l&#39;extinction et / ou, cette technique est particulièrement utile pour explorer la contribution unique de gènes cibles de ces distinct phases de modèles comportementaux de la plasticité induite par la cocaïne. Plus précisément,cette technique permet l&#39;ablation sélective des gènes cibles lors des phases distinctes d&#39;un comportement à tester leur contribution au comportement dans le temps. En fin de compte, cette compréhension permet de thérapies plus ciblées qui sont mieux à même de s&#39;attaquer aux facteurs de risque les plus puissants qui se présentent au cours de chaque phase du comportement addictif.

RPC Après l&#39;exécution RPC sur des souris microinjectés, il faut vérifier que la cohorte de contrôle-injecté (rAAV-GFP) chez la souris ont normalement acquis préférence pour la chambre drogue apparié (Figure 1A, 1B). Les souris sont considérés comme ayant acquis préférence pour une chambre particulière lorsque préférence de cocaïne (temps passé dans la chambre de la cocaïne-appareillé moins de temps passé dans la chambre saline-apparié) est significativement plus élevée par ...

Cet article décrit comment micro-injection de vecteurs viraux dans le cerveau de la souris, puis tester dans un endroit paradigme de préférence conditionné qui comprend une phase d&#39;acquisition, l&#39;extinction et la réintégration.

La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

L'objectif général de cette procédure est d'ablationner de manière sélective des gènes cibles durant des phases précises du paradigme de préférence pour un lieu conditionné afin d'évaluer leur contribution à ce comportement au fil du temps. Cela est réalisé en injectant d'abord de manière stéréotaxique un vecteur viral associé à l'eno recombinant exprimant la recombinase Cre. Ensuite, les souris sont laissées en récupération dans leur cage d'origine pendant 10 à 14 jours afin d'obtenir une réactivation maximale de Cre.La troisième étape de la procédure consiste à tester les souris dans un test de préférence conditionnée pour un lieu, incluant les phases d'acquisition, d'extinction et de recrudescence. La dernière étape de la procédure est de réaliser un examen histologique des souris microinjectées afin de valider le placement correct de la microinjection. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des modifications du comportement d'acquisition, d'extinction et/ou de recrudescence en réponse à un gène désactivé, grâce à des tests comportementaux de préférence conditionnée pour un lieu.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le système d'accouplement CRE lock P est qu'elle permet un ciblage temporel et anatomique plus précis de l'inactivation génique de manière discrète, permettant ainsi d'étudier la perte de fonction du gène à chaque phase du comportement. Les implications de cette technique s'étendent à des traitements pour les comportements addictifs, car elles impliquent une meilleure compréhension de la base génétique qui pourrait sous-tendre la manière dont l'exposition à des indices contextuels peut déclencher des souvenirs liés à la cocaïne, susceptibles d'induire des envies et des rechutes chez les personnes dépendantes. Pour commencer, placez une cage à souris contenant de la litière sur un réchauffeur afin de la réchauffer en prévision de la récupération postopératoire.Préparez un rasoir électrique pour raser la tête ainsi que de l'éthanol et de l'iode pour stériliser le cuir chevelu. Utilisez de l'éthanol à 70 % pour nettoyer les barres auriculaires et le support buccal du stéréotaxique à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq microlitres. Aspirez cinq microlitres de vecteur viral et placez-la dans un support de seringue sur le stéréotaxique.Placez un coussin chauffant micro-ondé ou un coussin électrique sur le stéréotaxique après avoir injecté la souris par une injection intrapéritonéale d'un cocktail de kétamine et de xylazine. Selon le protocole décrit, effectuez une pincée de la queue pour vérifier le niveau de sédation. Ensuite, rasez la tête entre les oreilles et les yeux, et utilisez des applicateurs en coton stériles pour nettoyer la zone en alternant des lavages avec de l'éthanol et de l'iode.Ensuite, transférez la souris sur le coussin chauffant du stéréotaxique réglé à zéro. Placez les échelles de la barre dentaire et des barres auriculaires, insérez les dents de la souris dans la barre dentaire, puis vissez fermement la museau et les barres auriculaires. Si un mouvement ou un frémissement des vibrisses est observé.Administrer une dose de rappel du cocktail de kétamine et de xylazine. Ensuite, lubrifier les yeux pour éviter qu'ils ne s'assèchent. Puis, à l'aide d'un scalpel, inciser le cuir chevelu jusqu'au niveau situé juste derrière les oreilles.Placer des pinces crocodile aux coins du cuir chevelu pour détacher la peau du crâne. Veiller à ce que Bgma et Lambda soient clairement visibles. S'assurer que la suture allant de Bgma à Lambda soit bien alignée et repositionner la tête si nécessaire.Après avoir confirmé que les réglages de l'attaque stéréo sont à zéro, placez la pointe de l'aiguille au niveau du bma. Mesurez les coordonnées dorso-ventrales, médio-latérales et antéro-postérieures pour le bma et le lambda. Ajustez ensuite la position de la tête jusqu'à ce que les coordonnées ventrales du bma et du lambda soient à moins de 0,02 millimètre l'une de l'autre.Repositionnez la pointe de l'aiguille sur le bgma, puis déplacez-vous à partir de ce point dans la direction antéro-postérieure jusqu'à la coordonnée souhaitée. Ensuite, percez un trou à la coordonnée désirée. Vérifiez que l'aiguille peut pénétrer sans être entravée par le crâne, puis abaissez l'aiguille jusqu'à la coordonnée ventrale souhaitée.Une fois la coordonnée atteinte, descendre de 0,015 millimètre en dessous pendant environ 10 secondes afin de créer une petite poche pour le vecteur viral à un débit d'environ 0,1 microlitre par minute, injecter le volume souhaité de vecteur viral après avoir attendu trois minutes pour permettre la diffusion du vecteur viral, remonter la pointe de l'aiguille de 0,015 millimètre et attendre deux minutes supplémentaires. Lorsque les injections sont terminées, appliquer de la cire osseuse pour boucher les deux orifices, puis suturer le cuir chevelu. Enfin, appliquer un bloc nerveux sur la zone lésée.Retirer la souris du stéréotaxique et la placer dans une cage chauffée sur un bloc chauffant pour une période de récupération de 45 minutes à une heure. Laisser la souris se remettre pendant au moins 10 jours afin de permettre une réactivation maximale. Donner à l’animal de l’eau et de la nourriture ramollie, ainsi que de la buprénorphine deux fois par jour si nécessaire en cas de douleur après la récupération, puis placer les souris dans la chambre centrale d’un appareil de préférence de lieu à trois compartiments pour une période d’habituation de 62 secondes avec les portes à guillotine fermées.Après l'habituation, ouvrez les portes à guillotine et laissez les souris explorer librement les trois compartiments pendant 1200 secondes. Utilisez le logiciel Med PC four pour enregistrer le temps passé par les animaux dans chaque compartiment, en suivant les directives du protocole écrit. Attribuez aux souris des compartiments de conditionnement en fonction de leurs performances durant le test préliminaire.Pendant les trois jours suivants, injectez 10 milligrammes par kilogramme de cocaïne lors d'une séance matinale et placez immédiatement les souris dans la chambre qui leur est attribuée pendant 1200 secondes. Ramenez les souris dans leurs cages d'origine pendant quatre heures, puis injectez-leur du sérum physiologique et enfermez-les immédiatement dans la chambre opposée pendant 1200 secondes. Pour évaluer l'acquisition, placez les souris dans la chambre centrale avec les portes à guillotine fermées pendant une période d'habituation de 62 secondes.Ouvrez les portes à guillotine et laissez les animaux explorer librement pendant 1200 secondes ou la durée de l'enregistrement. Le temps passé dans toutes les chambres permet de calculer la préférence en soustrayant la durée passée dans la chambre appariée au sérum physiologique de celle passée dans la chambre appariée à la cocaïne. Après avoir réalisé le conditionnement de préférence de place (CPP) sur des souris microinjectées, on considère qu'elles ont acquis une préférence pour une chambre particulière.Lorsque la préférence pour la cocaïne, définie comme le temps passé dans la chambre appariée à la cocaïne moins le temps passé dans la chambre appariée au sérum physiologique, est significativement plus élevée par rapport au score de préférence de base. Si, en tant que témoin de cohorte, les souris injectées ne montrent aucune préférence pour la chambre appariée à la cocaïne ou manifestent une aversion, le placement est vérifié immédiatement par histologie, et les souris présentant un placement incorrect sont exclues de l'étude. Si la préférence est normalement acquise par la cohorte témoin injectée, le paradigme est prolongé en commençant l'extinction.On considère que les souris ont éteint la préférence induite par la drogue pour une chambre particulière. Lorsque la préférence pour la cocaïne au cours de deux jours consécutifs d'extinction est significativement plus faible par rapport au score de préférence d'acquisition à ce moment-là, on peut effectuer une rechute par administration d'une dose de rappel de la drogue. Si le score de préférence après l'administration de la dose de rappel ne diffère pas statistiquement de celui observé lors de l'acquisition, on dit alors que cette cohorte a rétabli la préférence induite par la drogue pour la chambre associée à la drogue à l'aide de la PCR quantitative.Cette figure montre que le gène d'intérêt a effectivement été inactivé chez les souris micro-injectées suite à l'injection intranucléaire de RAAV Cree GFP dans le noyau accumbens présentant l'isoforme du canal calcique de type L, CAV 1.2 flocons de RAAV. Les prélèvements de tissus des souris injectées avec Cree montrent une diminution significative de l'expression génique par rapport aux souris injectées avec A-A-V-G-F-P présentées ici. Une analyse immunohistochimique du noyau accumbens pour la GFP révèle un positionnement bilatéral correct des RAAV Cree micro-injectés après cette procédure.D'autres techniques, telles que la PCR quantitative en temps réel et le Western blotting, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant l'effet de l'extinction d'un gène sur les niveaux d'expression d'autres gènes d'intérêt. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment ablater sélectivement des gènes cibles dans le cerveau de la souris à l'aide de vecteurs viraux injectés par microinjection stéréotaxique, afin de tester de façon sélective le rôle de ces gènes dans l'acquisition, l'extinction et la recrudescence du paradigme de préférence conditionnée pour un lieu.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Behavior

Comportement

Source : Chen, S., et al., Chirurgie stéréotaxique pour la manipulation génétique dans les cellules striales des cerveaux de souris néonatales. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un vecteur viral codant pour la Cre recombinase et la protéine de fluorescence verte ou GFP dans le striatum d’un chiot de souris génétiquement modifié pour réaliser une manipulation génique en excisant une cassette STOP flanquée de loxP, activant la protéine de fluorescence rouge ou...

Micro-injection stéréotaxique d’un vecteur viral pour la manipulation de gènes chez un striatum de bébé souris

Source : Pereira, M. et. al., In vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un virus adéno-associé dans le cortex cérébral d’une souris transgénique pour délivrer des gènes de reprogrammation neuronale et de rapporteur fluorescent dépendants de Cre dans les cellules gliales.

Injection stéréotaxique de vecteurs viraux pour la reprogrammation des cellules gliales dans un modèle murin

Source : Fricano-Kugler, C. J., et al. Conception, emballage et administration de CRISPR retro et de lentivirus à titre élevé par injection stéréotaxique. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’injection virale stéréotaxique pour une édition précise des gènes neuronaux dans le cerveau de la souris. Le protocole garantit une livraison précise du virus au gyrus denté, permettant le marquage fluorescent et l’inactivation de gènes médiée par CRISPR pour étudier les circuits neuronaux, la...

Injection virale stéréotaxique pour l’édition de gènes neuronaux ciblés dans le cerveau de souris

Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer...

Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l'expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).

Application Technique d&#39;injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Les rongeurs sont un modèle approprié pour étudier les substrats moléculaires du comportement et des troubles psychiatriques complexes. La micro-injection cérébrale chez les rongeurs éveillés peut être utilisée pour élucider les substrats de la maladie. Une méthode de micro-injection cérébrale efficace et personnalisable ainsi que l’exécution d’un paradigme opérant qui quantifie la motivation sont présentées.

Le cerveau de rongeurs microinjection pour l&#39;étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

approches optogénétiques sont largement utilisés pour manipuler l'activité neuronale et d'évaluer les conséquences pour le fonctionnement du cerveau. Ici, une technique est décrit que , lors de l' expression in vivo de l'activateur optique channelrhodopsin, permet une analyse ex vivo des propriétés synaptiques de longue portée spécifique et les connexions locales dans les circuits neuronaux liés à la peur.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Les auteurs décrivent un protocole de chirurgie stéréotaxique avec un dispositif de tête-correction faite maison pour microinjecting réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Cette technique permet des manipulations génétiques dans les cellules neuronales de régions précises du cerveau de souris néonatales.

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Les méthodes décrites ici décrivent une procédure utilisée pour inverser optogénétiquement la plasticité induite par la cocaïne dans un circuit comportementalement pertinent chez le rat. La stimulation optique soutenue à basse fréquence des synapses thalamo-amygdales induit une dépression à long terme (LTD). La DLT optogénétique in vivo induite chez des rats ayant consommé de la cocaïne a entraîné une atténuation subséquente de la recherche de drogue motivée par des signaux.

Utilisation de l’optogénétique pour inverser la neuroplasticité et inhiber la recherche de cocaïne chez le rat

Découvrez la micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles dans la préférence de place conditionnée chez la souris. Cette méthode permet d'analyser les phases d'acquisition, d'extinction et de réinstatement.

La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée (Vidéo) | JoVE Journal

La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée

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