Trois dimensions d'analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser l’expression et la localisation cellulaire des marqueurs phénotypiques microgliaux des macrophages après une ischémie cérébrale. Tout d’abord, des coupes cryogéniques de cerveaux de souris ischémiques sont colorées pour identifier les marqueurs de l’activation des macrophages microgliaux. Les sections colorées sont soumises à une imagerie confocale tridimensionnelle.

Les images résultantes sont ensuite traitées pour générer des rendus tridimensionnels, et une analyse d’image est effectuée pour localiser l’expression des marqueurs dans des grappes de cellules. Les données qui en résultent démontrent l’efficacité de l’analyse confocale tridimensionnelle pour attribuer correctement l’expression des marqueurs à un corps cellulaire spécifique Lorsque deux marqueurs sont exprimés par la même cellule, mais dans des compartiments subcellulaires différents, la colocalisation seule peut ne pas être très informative. L’utilisation de l’analyse tridimensionnelle, comme nous allons le démontrer ici, permet une meilleure résolution et une meilleure précision.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la complexité de la réponse cérébrale aux lésions ischémiques, elle peut également être appliquée à d’autres affections aiguës ou chroniques où un double rôle des macrophages microgliaux dans les lésions et la réparation a été proposé. Ou dans les cas où les signaux doivent être localisés de manière sélective dans différents plans spéciaux, Carlo Perigo et Stefan de Magali vous guideront à travers les différentes étapes de la procédure. Le protocole suivant utilise du tissu cérébral de souris dans lequel l’ischémie a été induite par l’occlusion permanente de l’artère cérébrale moyenne.

Utilisez un cryostat pour collecter des sections coronales en série de 20 microns du cerveau sur de la gélatine. Les lames couvertes amènent tous les réactifs et échantillons à température ambiante avant utilisation. Veuillez noter que la dilution de travail des anticorps et du sérum indiquée dans le document d’accompagnement résulte d’essais effectués afin d’obtenir les meilleures performances lorsque différents anticorps et sérum sont utilisés.

Le protocole doit être validé. Commencez par entourer les sections de la lame à l’aide d’un stylo bloqueur de liquide pour minimiser la quantité de réactifs nécessaires. Ensuite, placez les sections de cerveau dans une chambre humide à l’aide d’une pipette d’un millilitre.

Ajoutez du PBS à température ambiante dans les sections et incubez pendant cinq minutes pour les laver. Ensuite, à l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre avec une aiguille, retirez la solution et répétez le lavage une fois de plus Après avoir retiré le deuxième lavage, procédez à la coloration des échantillons à l’aide d’une pipette d’un millilitre et d’une seringue jetable pour tous les échanges de solution. La procédure de coloration doit être effectuée telle que résumée. Ici.

Veuillez consulter le texte d’accompagnement pour plus de détails, y compris les étapes de lavage. Tout d’abord, les cellules sont incubées avec 1 % de peroxyde d’hydrogène après avoir été bloquées avec du sérum de chèvre normal. Ensuite, les lames sont incubées avec un anticorps secondaire approprié suivi d’un triss, d’un tampon d’entrejambe NACL ou de TNT, puis de triss, de H-C-L-N-A-C-L, d’un tampon de blocage ou de TNB après l’incubation avec TNB.

Les lames sont incubées avec de la streptavidine HRP suivie d’un diluant d’amplification contenant du cyanure cinq tyrom, qui amplifiera le signal immunofluorescent. Ensuite, les lames sont incubées avec NGS pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, ils sont incubés avec un anticorps primaire contre le CD 68.

Après l’incubation avec l’anticorps primaire, les cellules sont ensuite incubées dans l’anticorps secondaire conjugué au fluor approprié, suivi d’un microgramme par millilitre de crochets pour marquer l’ADN. Une fois la coloration terminée, montez les sections cryo en utilisant de l’or prolongé lors du montage des sections, évitez de générer des bulles d’air. Stockez les sections à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient analysées.

L’acquisition du signal fluorescent doit être effectuée dans un délai d’une semaine. Ce protocole utilise un microscope IX 81 équipé d’une unité de balayage confocal FV 500 avec trois lignes laser : l’argon, le krypton à 488 nanomètres, l’hélium, le rouge néon à 646 nanomètres et l’hélium vert néon à 532 nanomètres, ainsi qu’une diode UV dans le logiciel flu of U 500. Sélectionnez les lasers d’excitation et les miroirs dichroïques appropriés.

Configurez également la résolution de l’image à un minimum de 800 x 600 pixels. Ensuite, placez la lame sur la platine du microscope et, à l’aide de l’épifluorescence, identifiez une zone d’intérêt, augmentez progressivement le grossissement jusqu’à l’objectif 40x. Passez ensuite à la méthode de microscopie à balayage laser et exécutez des balayages répétitifs tout en ajustant le niveau de puissance du photomultiplicateur et le gain pour chaque canal.

Cela réduira le chevauchement du signal causé par l’excitation contemporaine à différentes longueurs d’onde. Gardez le gain aussi bas que possible pour éviter les signaux non spécifiques indésirables. En continuant le balayage répétitif, ajustez la mise au point et définissez les extrémités inférieure et supérieure de l’axe Z avec une longueur totale de l’axe Z de 10 microns.

Arrêtez ensuite le balayage répétitif. Ensuite, entrez la taille du pas. Il doit être aussi proche que possible de la taille du pixel, qui est de 0,225 micron.

Cela donnera un rapport de taille standard de un à un sur l’axe Z dans le logiciel Activate kalman filter au moins deux fois. L’algorithme de Kalman est une fonction itérative qui élimine les signaux aléatoires, tels que les voxels positifs uniques appartenant au bruit de fond, améliorant ainsi le rapport signal/bruit. Activez maintenant le mode de balayage séquentiel pour éviter les effets de saignement

Déplacez-vous vers le milieu de l’axe Z et exécutez un balayage séquentiel XY. Vérifiez la configuration du PMT et du gain pour garantir un rapport signal/bruit satisfaisant. Exécutez l’acquisition XY, Z après l’acquisition.

Exportez les données sous forme de fichier multi-TIF. Chaque fichier multi-TIF contient généralement trois canaux de couleur et 44 plans focaux pour le traitement. Commencez par ouvrir le logiciel imas.

Tout d’abord, sélectionnez la vue surpass, puis téléchargez le fichier multi TIF. Ensuite, sur le panneau de réglage de l’affichage, sélectionnez la couleur souhaitée pour chaque canal ici. Le rouge représente le CD 11 B.Le vert représente le CD 68 et le bleu représente la tache d’ADN des crochets pour supprimer le bruit de fond, augmentez la valeur minimale sur le panneau de réglage de l’affichage pour chaque canal.

Allez ensuite dans la vue en coupe pour visualiser un seul plan focal XY avec des projections orthogonales des axes x, Z et YZ. Déplacez-vous le long de l’axe Z à la recherche de la colocalisation, qui apparaît sous forme de pixels jaunes. Cliquez sur une zone jaune pour voir si la colocalisation est présente le long de l’axe Z, ce qui indique qu’elle appartient à un objet solide de l’axe Z.

Des projections sont visibles dans la partie droite et inférieure de la figure. Prenez un instantané, puis revenez à la vue surpasse. Ensuite, dans le menu déroulant d’édition, sélectionnez Recadrer 3D et tracez un contour de région d’intérêt pour isoler une cellule ou un groupe de cellules.

Ensuite, sur le panneau de réglage de l’affichage, sélectionnez un canal. Sélectionnez le générateur d’algorithmes de surfaces de dépassement. Ensuite, pour configurer l’algorithme, sélectionnez d’abord un canal.

Définissez ensuite le seuil comme la même valeur minimale que celle définie dans le panneau de réglage de l’affichage et définissez le redimensionnement si nécessaire. Ensuite, définissez le lissage à 0,200. Sélectionnez le panneau de couleurs et modifiez l’apparence si nécessaire.

Répétez la configuration du générateur d’algorithmes de surfaces de surpassement pour chaque canal. Ensuite, sur le panneau de réglage de l’affichage, désélectionnez les canaux de fluorescence et sélectionnez les trois surfaces. Enfin, déplacez le volume pour trouver la meilleure vue et prenez un instantané pour déterminer le modèle de co-expression des marqueurs MM.

Les protocoles d’immunofluorescence et d’acquisition confocale décrits dans cette vidéo ont été réalisés dans un modèle murin d’ischémie focale induite par l’occlusion permanente de l’artère cérébrale moyenne. Une vue bidimensionnelle des images acquises montre qu’à 24 heures après l’ischémie, les marqueurs lysosomales CD 68, qui sont représentés en vert, sont exprimés dans les cellules hypertrophiques parmi les cellules B B CD 11, qui sont visibles en rouge présentes dans le noyau ischémique. La projection de l’axe Z illustrée en bas à droite montre que la distribution des marqueurs documentée dans la vue à plan unique est également présente le long de l’axe Z dans la zone de bordure.

Les cellules B positives pour CD 11 présentent des corps cellulaires hypertrophiques avec des processus très positifs pour CD 68, ce qui suggère que les phagosomes sont liés à la membrane cellulaire. Cela indique le comportement acide actif des cellules microgliales pour évaluer la co-expression de CD 68 et YM one, un marqueur de M two polarisé. Les images fluorescentes ont subi un rendu tridimensionnel.

La vue tridimensionnelle des images acquises montrées ici indique la présence de cellules positives pour le CD 68 en vert et de cellules positives pour le YM en voxels fluorescents rouges. En parallèle, la vue de l’observateur peut produire un signal colocalisé vu en jaune, qui peut ne pas être lié à la distance réelle entre les marqueurs. Définir la colocalisation.

Une vue plane unique avec des projections de l’axe Z doit être générée en se déplaçant le long de l’axe Z. À la recherche de colocalisation. La projection de l’axe Z est obtenue comme on le voit dans la partie droite et inférieure de cette image.

Les voxels fluorescents peuvent être transformés en objets solides par rendu tridimensionnel avec attribution d’une expression de marqueur à un corps cellulaire spécifique. Après un fort grossissement et un rendu 3D, les deux marqueurs semblent appartenir à des cellules différentes qui sont à proximité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test d’immunofluorescence avec plusieurs marqueurs et colorants, et comment acquérir et visualiser correctement des images tridimensionnelles par microscopie confocale.

De plus, l’analyse de post-traitement décrite peut être exploitée avec succès pour analyser toute co-expression ou colocalisation au niveau cellulaire, ou dans les cas où les signaux doivent être localisés sélectivement dans différents plans spatiaux.