Name: Trois dimensions danalyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Découvrez l'analyse confocale 3D des marqueurs de polarisation microglie/macrophage dans un modèle murin d'ischémie cérébrale. Cette méthode améliore la résolution de l'expression cellulaire pour l'étude de l'inflammation cérébrale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stefano Fumagalli est membre de la Fondation Monzino.

1. Immunofluorescence
Le protocole suivant est réalisé sur des cryosections cérébrales coronales obtenues à partir de souris perfusées par voie transcardiale (20 ml de PBS, 0,1 mol/litre, pH 7,4, suivi de 50 ml de paraformaldéhyde réfrigéré à 4 % dans du PBS). Après la perfusion, les cerveaux sont soigneusement retirés et transférés à 30 % de saccharose dans du PBS à 4 °C pendant la nuit pour la cryoprotection. Les cerveaux sont ensuite rapidement congelés par immersion dans de l’isopentane à -45 °C pendant 3 minutes avant d’être scellés dans des flacons et stockés à -70 °C jusqu’à l’utilisation. Les cryosections cérébrales coronales (20 μm) sont coupées en série et soumises au protocole d’immunofluorescence 11, 6.
Amenez tous les réactifs et échantillons à température ambiante avant utilisation. Veuillez noter que les dilutions de travail présentées des anticorps et du sérum résultent d’essais effectués afin d’obtenir les meilleures performances. Lorsque différents anticorps et sérum sont utilisés, le protocole doit être validé.
Notez que parce que les anticorps primaires anti-CD11b et anti-CD68 sont fabriqués chez le rat, pour éviter le signal croisé par l’anti-rat Alexa 546, nous avons utilisé une forte dilution d’anti-CD11b suivie d’une amplification du signal fluorescent avec le kit TSA (Cy5 Tyramide). Nous avons mis en place la dilution de travail optimale pour l’anti-CD11b en exécutant le protocole décrit à l’exception de l’étape 1.17 et en utilisant au moins 7 dilutions différentes d’anti-CD11b comme indiqué dans le tableau 1. En conséquence, 1:30 000 a été choisi étant la seule dilution permettant d’obtenir : 1) un signal visible avec Cy5 à la longueur d’onde d’excitation 646 nm ; 2) pas de signal avec Alexa 546 à la longueur d’onde d’excitation 532 nm. De cette façon, le signal fluorescent Alexa 546 est associé de manière sélective à l’expression de CD68.
Les dilutions optimales pour les anticorps anti-CD11b et anti-CD68 peuvent varier en fonction du type de tissu et doivent être définies avant de commencer le protocole de co-marquage.
<ol>
	<li>Lavez les cryosections cérébrales deux fois avec PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 5 min dans du PBS contenant 1 %de H 2O2 (étape nécessaire car l’amplification fluorescente nécessite une incubation avec de la peroxydase de raifort, de la streptavidine-HRP, voir étape 1.12).</li>
	<li>Laver les cryosections 2 fois avec du PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant 10 % de NGS et 0,3 % de Triton.</li>
	<li>Incuber des cryosections à 4 °C pendant la nuit dans du PBS contenant de l’anticorps primaire anti-CD11b de rat Ab [1:30 000], 10 % de NGS et 0,3 % de Triton.</li>
	<li>Laver les cryosections 2x (5 min) avec du PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant du sérum anti-rat secondaire biotinylé Ab [1:200] et 1 % de NGS.</li>
	<li>Laver les cryosections 2 fois avec du PBS.</li>
	<li>Lavage des cryosections avec du TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween : 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20).</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 1,5 h dans du TNB (tampon bloquant Tris-HCl-NaCl : 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5 % réactif bloquant du kit approprié (voir tableau des réactifs)).</li>
	<li>Lavez les cryosections 3 fois avec du TNT.</li>
	<li>Incuber des cryosections dans du TNB contenant de la streptavidine-HRP [1:100].</li>
	<li>Laver les cryosections 3x avec du TNT.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 8 min dans un diluant d’amplification contenant de la cyanine 5 tyramide [1:300].</li>
	<li>Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant 10 % de NGS et 0,1 % de Triton.</li>
	<li>Incuber des cryosections à 4 °C pendant la nuit dans du PBS contenant de l’anticorps primaire anti-CD68 [1:200], 3 % de NGS et 0,3 % de Triton.</li>
	<li>Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant de l’anticorps secondaire fluorconjugué Ab Alexa 546 anti-rat [1:500] et 1 % de NGS.</li>
	<li>Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Incuber des cryosections pendant 10 min dans du PBS contenant Hoechst 1 μg/ml.</li>
	<li>Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Montez les cryosections dans Prolong Gold.</li>
</ol>
2. Acquisition d’images tridimensionnelles par microscopie confocale
Le microscope utilisé ici était un microscope IX81 équipé d’une unité de balayage confocal FV500 avec 3 raies laser : Ar-Kr (488nm), He-Ne rouge (646nm) et He-Ne vert (532nm) et une diode UV.
<ol>
	<li>Sélectionnez les lasers d’excitation en fonction des longueurs d’onde des colorants fluorescents à exciter (He-Ne rouge pour Cy5, CD11b ; He-Ne vert pour Alexa546, CD68 et la diode UV pour Hoechst, noyaux).</li>
	<li>Sélectionnez la meilleure combinaison de miroirs dichroïques pour la collecte des signaux lumineux.</li>
	<li>Réglez la résolution de l’image à un minimum de 800 x 600 pixels.</li>
	<li>Identifiez une zone d’intérêt à l’aide de l’épifluorescence et augmentez progressivement le grossissement jusqu’à l’objectif 40X.</li>
	<li>Passez à la méthode de microscopie à balayage laser (LSM).</li>
	<li>Exécutez des balayages répétitifs pour ajuster le photomultiplicateur (PMT) et le gain pour chaque canal. Les lasers peuvent être allumés individuellement pour faciliter la configuration. Gardez le gain aussi bas que possible pour éviter les signaux indésirables non spécifiques.</li>
	<li>Avec le balayage répétitif en cours, déplacez la commande de mise au point pour définir les extrêmes inférieur et supérieur de l’axe z (longueur totale de l’axe z = 10 μm).</li>
	<li>Arrêtez l’analyse répétitive.</li>
	<li>Définissez la taille du pas. Il doit être aussi proche que possible de la taille des pixels (0,225 μm) pour obtenir un rapport de taille standard de 1:1 sur l’axe z.</li>
	<li>Activez le filtre de Kalman au moins 2 fois.</li>
	<li>Activez le mode de balayage séquentiel pour éviter les effets de débordement.</li>
	<li>Allez à mi-chemin le long de l’axe z et lancez un balayage séquentiel xy. Vérifiez la configuration du PMT et du gain (bon rapport signal/bruit). Si la solution n’est pas satisfaisante, répétez l’étape 2.6.</li>
	<li>Exécutez l’acquisition xyz.</li>
	<li>Exporter les données sous forme de fichier multitiff. Chaque fichier multitiff contient généralement 3 canaux de couleur (bleu, vert et rouge) et 44 plans focaux.</li>
</ol>
3. Vue tridimensionnelle des acquisitions confocales et rendu tridimensionnel
Télécharge les fichiers multitiff sur le logiciel Imaris et traite-les comme suit :
<ol>
	<li>Logiciel ouvert.</li>
	<li>Sélectionnez la vue surpasse.</li>
	<li>Téléchargez le fichier multitiff.</li>
	<li>Sélectionnez la couleur souhaitée pour chaque canal.</li>
	<li>Supprimez le bruit de fond en augmentant la valeur minimale sur le panneau de réglage de l’affichage. Ajustez chaque canal individuellement.</li>
	<li>Allez dans la vue en coupe. Déplacez-vous le long de l’axe z à la recherche d’une co-localisation (pixels jaunes).</li>
	<li>Cliquez sur une zone jaune pour voir si la colocalisation est présente le long de l’axe z (c’est-à-dire si elle appartient à un objet solide). Les projections de l’axe Z sont visibles dans la partie droite et inférieure de la figure.</li>
	<li>Prenez un instantané.</li>
	<li>Retournez à la vue surpassée.</li>
	<li>Recadrez la 3D pour isoler une cellule ou un groupe de cellules.</li>
	<li>Sélectionnez un canal sur le panneau de réglage de l’affichage.</li>
	<li>Sélectionnez le générateur d’algorithmes surpass/surfaces. Étapes de l’algorithme :
	<ol>
		<li>Sélectionnez la chaîne.</li>
		<li>Définissez le seuil (utilisez la même valeur minimale dans le panneau de réglage de l’affichage).</li>
		<li>Définissez le redimensionnement.</li>
		<li>Définissez le lissage (meilleur = 0,200).</li>
		<li>Définissez l’apparence des couleurs.</li>
		<li>Fin de l’algorithme.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Répétez l’étape 3.12 pour chaque canal.</li>
	<li>Désélectionnez les canaux de fluorescence sur le panneau de réglage de l’affichage et sélectionnez les trois surfaces.</li>
	<li>Déplacez le volume pour trouver la meilleure vue.</li>
	<li>Prenez un instantané.</li>
</ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici des protocoles basés sur l’immunofluorescence suivis d’une analyse confocale tridimensionnelle comme une approche puissante pour étudier la localisation et la co-expression des marqueurs phénotypiques M/M dans l’aire ischémique (pour une analyse plus détaillée, voir ref 6). Cette méthode combine la coloration spécifique d’un marqueur pertinent de l’activation M/M avec l’imagerie confocale tridimensionnelle. Le réglage fin des anticorps, des dilutions de travail sériques et fluorconjuguées p...

Après une lésion cérébrale aiguë, les microglies s’activent rapidement et subissent des changements morphologiques et phénotypiques spectaculaires1-3. Cette réponse intrinsèque est associée au recrutement de macrophages hématopoïétiques qui migrent dans le parenchyme cérébral lésé4,5. Le rôle de la microglie et des macrophages qui ne sont pas antigéniquement distinguables (ci-après appelés M/M) dans les lésions cérébrales est encore débattu. De plus en plus d’études indiquent que, à l’instar de ce qui est décrit pour les macrophages périphériques, les macrophages microgliaux et les macrophages recrutés par le cerveau peuvent prendre des phénotypes différents dont les extrêmes correspondent au phénotype classique pro-inflammatoire toxique (M1) ou anti-inflammatoire protecteur (M2). Les différents états d’activation, dont la sécrétion de facteurs pro- ou anti-inflammatoires, la libération de molécules neurotrophiques et l’activité lysosomale, sont caractérisés par un schéma spécifique de marqueurs phénotypiques, dont l’expression dépend de l’évolution temporelle du milieu environnant. La caractérisation de ces phénotypes M/M dans le cerveau lésé est encore rare. Nous avons utilisé un modèle murin bien établi de pMCAo pour analyser l’expression et l’évolution de M/M après un AVC. Les protocoles basés sur l’immunofluorescence présentés ici visent à mieux comprendre l’apparition de marqueurs phénotypiques M/M spécifiques, leur localisation et leur co-expression cellulaire dans la zone ischémique. Nous avons étudié quelques molécules associées à différents états d’activation ou phénotypes, à savoir CD11b, un marqueur de surface exprimé par les leucocytes et un marqueur largement utilisé de l’activation/recrutement M/M6-8, CD68 un marqueur des lysosomes6,7 et Ym1 une protéine sécrétoire exprimée par des macrophages alternativement activés (M2) et associée à la récupération et à la restauration de la fonction9-10.	
	Lorsque deux marqueurs sont exprimés par la même cellule, mais dans des compartiments subcellulaires différents, la colocalisation seule peut ne pas être très informative. Dans ce cas, l’analyse de la coexpression peut être effectuée à l’aide d’une vue à plan unique et de rendus tridimensionnels. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir une analyse tridimensionnelle approfondie de la coexpression des marqueurs.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-souris CD11b</td><td>Aimablement fourni par Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-souris CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-souris Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211 ; chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Noyaux Neuronaux (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre biotinilée Anticorps anti-rat</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 Système </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti souris Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-lapin Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Vecteurs de sérum de chèvre normaux</td><td>Laboratoires</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td> Microscope confocal <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 </td><td>Logiciel Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS Logiciel</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progiciels GraphPad Prism version 4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans experimental brain injury

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Après un accident vasculaire cérébral, les microglies/macrophages (M/M) subissent une activation rapide avec des changements morphologiques et phénotypiques spectaculaires qui incluent l’expression de nouveaux antigènes de surface et la production de médiateurs qui construisent et maintiennent la réponse inflammatoire. De nouvelles preuves indiquent que les M/M sont des cellules hautement plastiques qui peuvent supposer une activation pro-inflammatoire classique (M1) ou anti-inflammatoire alternative (M2) après une lésion cérébrale aiguë. Cependant, il manque encore une caractérisation complète de l’expression des marqueurs de phénotype M/M, de leur colocalisation et de leur évolution temporelle dans le cerveau lésé.	
	Des protocoles d’immunofluorescence colorant spécifiquement les marqueurs pertinents de l’activation de M/M peuvent être réalisés dans le cerveau ischémique. Nous présentons ici des protocoles basés sur l’immunofluorescence suivis d’une analyse confocale tridimensionnelle comme une approche puissante pour étudier le modèle de localisation et de co-expression des marqueurs phénotypiques M/M tels que CD11b, CD68, Ym1, dans un modèle murin d’ischémie focale induite par l’occlusion permanente de l’artère cérébrale moyenne (pMCAO). L’analyse bidimensionnelle de la zone colorée révèle que chaque marqueur est associé à une morphologie M/M définie et a une localisation donnée dans la lésion ischémique. Les modèles de co-expression des marqueurs phénotypiques M/M peuvent être évalués par imagerie confocale tridimensionnelle dans l’aire ischémique. Les images peuvent être acquises sur un volume défini (axe z de 10 μm et une taille de pas de 0,23 μm, correspondant à un volume de 180 x 135 x 10 μm) avec un mode de balayage séquentiel pour minimiser les effets de débordement et éviter le chevauchement des longueurs d’onde. Les images sont ensuite traitées pour obtenir des rendus tridimensionnels au moyen du logiciel Imaris. La vue solide des rendus tridimensionnels permet de définir l’expression des marqueurs dans des grappes de cellules. Nous montrons que les M/M ont la capacité de se différencier vers une multitude de phénotypes, en fonction de l’emplacement sur le site de la lésion et du temps après la blessure.

Un exemple des résultats obtenus lorsque les protocoles de marquage et les acquisitions en microscopie confocale sont réalisés dans la région ischémique est illustré dans les Figures 1A et 1B. Une vue en deux dimensions des images acquises montre qu’au bout de vingt-quatre heures après l’ischémie (A), le marqueur lysosomal CD68 (en vert) est exprimé dans des cellules amiboïdes hypertrophiées CD11b (en rouge) présentes dans le noyau ischémique. Dans la zone frontalière <s...

Une façon d’obtenir de nouvelles connaissances sur la complexité de la réponse inflammatoire cérébrale est présentée. Nous décrivons des protocoles basés sur l’immunofluorescence suivis d’une analyse confocale tridimensionnelle pour étudier le modèle de co-expression des marqueurs phénotypiques microglie/macrophage dans un modèle murin d’ischémie focale.

Trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser l'expression et la localisation cellulaire des marqueurs phénotypiques des microglies et des macrophages après une ischémie cérébrale. Dans un premier temps, des coupes cryogéniques provenant de cerveaux de souris ischémiques sont colorées afin d'identifier les marqueurs d'activation des microglies et des macrophages. Les coupes colorées font ensuite l'objet d'une imagerie confocale tridimensionnelle.Les images obtenues sont ensuite traitées pour générer des rendus tridimensionnels, et une analyse d'image est effectuée afin de localiser l'expression des marqueurs dans des groupes de cellules. Les données obtenues démontrent l'efficacité de l'analyse confocale tridimensionnelle pour attribuer correctement l'expression des marqueurs à un corps cellulaire spécifique. Lorsque deux marqueurs sont exprimés par la même cellule, mais dans des compartiments sous-cellulaires différents, la simple colocalisation peut ne pas être très informative. L'utilisation d'une analyse tridimensionnelle, comme nous le démontrerons ici, permet une meilleure résolution et une plus grande précision.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la complexité de la réponse cérébrale à une lésion ischémique, elle peut également être appliquée à d'autres affections aiguës ou chroniques où un rôle double des microglies et des macrophages dans les lésions et la réparation a été proposé. Ou dans les cas où des signaux doivent être localisés sélectivement dans différents plans spatiaux, Carlo Perigo et Stefan de Magali vous guideront à travers les différentes étapes de la procédure. Le protocole suivant utilise un tissu cérébral de souris dans lequel l'ischémie a été induite par une occlusion permanente de l'artère cérébrale moyenne.Utilisez un cryostat pour prélever des coupes coronales sérielles de 20 micromètres du cerveau sur gélatine. Avant utilisation, portez tous les réactifs et échantillons à température ambiante à l’aide de lames recouvertes. Veuillez noter que la dilution de travail des anticorps et du sérum indiquée dans leur document d’accompagnement résulte d’essais effectués afin d’obtenir les meilleures performances lorsque différents anticorps et sérum sont utilisés.Le protocole doit être validé. Commencez par délimiter les sections sur la lame à l’aide d’un stylo hydrophobe afin de réduire la quantité de réactifs nécessaire. Ensuite, placez les sections cérébrales dans une chambre humide à l’aide d’une pipette de un millilitre.Ajouter du PBS à température ambiante sur les sections et incuber pendant cinq minutes pour les laver. Ensuite, à l’aide d’une seringue jetable de un millilitre munie d’une aiguille, éliminer la solution et répéter le lavage une fois de plus. Après avoir retiré le deuxième lavage, passer à la coloration des échantillons en utilisant une pipette de un millilitre et une seringue jetable pour tous les échanges de solution. La procédure de coloration doit être réalisée comme résumé ici.Voir le texte accompagnant pour les détails, y compris les étapes de lavage. Tout d'abord, les cellules sont incubées avec du peroxyde d'hydrogène à 1 % après blocage avec du sérum de chèvre normal. Elles sont ensuite incubées avec un anticorps primaire dirigé contre CD11b. Ensuite, les lames sont incubées avec un anticorps secondaire approprié, suivi d'un tampon triss, NACL tween ou TNT, puis d'un tampon de blocage triss, H-C-L-N-A-C-L ou TNB, après l'incubation avec TNB.Les lames sont incubées avec de la streptavidine HRP, suivie d'un diluant d'amplification contenant du cyanure de tyram, qui amplifiera le signal immunofluorescent. Ensuite, les lames sont incubées avec du NGS afin de bloquer les sites de fixation non spécifiques. Puis, elles sont incubées avec un anticorps primaire dirigé contre CD 68.Après l'incubation avec l'anticorps primaire, les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié, suivie d'un microgramme par millilitre de colorant DAPI pour marquer l'ADN. Une fois la coloration terminée, montez les coupes cryogéniques en utilisant du Prolong Gold ; veillez à éviter la formation de bulles d'air lors du montage. Conservez les coupes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à leur analyse.L'acquisition du signal fluorescent doit être effectuée dans la semaine suivant la préparation. Ce protocole utilise un microscope IX 81 équipé d'une unité de balayage confocal FV 500 avec trois lignes laser : argon-krypton à 488 nanomètres, hélium-néon rouge à 646 nanomètres et hélium-néon vert à 532 nanomètres, ainsi qu'une diode UV dans le flux du logiciel U 500. Sélectionnez les lasers d'excitation appropriés et les miroirs dichroïques correspondants.Réglez également la résolution d'image à un minimum de 800 par 600 pixels. Ensuite, placez la lame sur la platine du microscope et, à l'aide de la fluorescence en épiscopie, identifiez une zone d'intérêt, puis augmentez progressivement le grossissement jusqu'à l'objectif 40 x. Passez ensuite au mode microscopie à balayage laser et effectuez des balayages répétés tout en ajustant le niveau de puissance du photomultiplicateur et le gain pour chaque canal.Cela réduira le chevauchement des signaux causé par l'excitation simultanée à différentes longueurs d'onde. Maintenez le gain aussi bas que possible afin d'éviter les signaux non spécifiques indésirables. En poursuivant la numérisation répétée, ajustez la mise au point et définissez les extrémités inférieure et supérieure de l'axe Z avec une longueur totale de l'axe Z de 10 microns.Ensuite, arrêtez la numérisation répétitive. Puis, saisissez la taille du pas. Elle doit être aussi proche que possible de la taille du pixel, soit 0,225 microns.Cela permettra d'obtenir un rapport de taille standard un-à-un sur l'axe Z dans le logiciel. Activez le filtre de Kalman au moins deux fois. L'algorithme de Kalman est une fonction itérative qui élimine les signaux aléatoires, tels que les voxels positifs isolés appartenant au bruit de fond, améliorant ainsi le rapport signal sur bruit. Activez maintenant le mode de balayage séquentiel afin d'éviter les effets de recouvrement.Déplacez-vous au point médian de l'axe Z et effectuez une analyse séquentielle XY. Vérifiez le réglage du PMT et du gain afin d'assurer un rapport signal sur bruit satisfaisant. Effectuez l'acquisition XY, Z après l'acquisition.Exporter les données sous forme d'un fichier TIF multipage. Chaque fichier TIF multipage contient généralement trois canaux de couleur et 44 plans focaux à traiter. Commencez par ouvrir le logiciel imas.Tout d'abord, sélectionnez la vue surpass, puis téléversez le fichier multi-TIF. Ensuite, sur le panneau de réglage de l'affichage, sélectionnez la couleur souhaitée pour chaque canal ici. Le rouge représente le CD11b, le vert représente le CD68, et le bleu représente la coloration ADN des haptènes. Pour éliminer le bruit de fond, augmentez la valeur minimale sur le panneau de réglage de l'affichage pour chaque canal.Ensuite, rendez-vous dans la vue de section pour visualiser un seul plan focal XY avec les projections orthogonales des axes XZ et YZ. Déplacez-vous le long de l'axe Z à la recherche d'une colocalisation, qui apparaît sous forme de pixels jaunes. Cliquez sur une zone jaune pour vérifier si la colocalisation est présente tout au long de l'axe Z, ce qui indique qu'elle appartient à un objet solide selon l'axe Z.Des projections sont visibles dans la partie droite et inférieure de la figure. Prenez une capture d'écran, puis revenez à la vue surpass. Ensuite, dans le menu déroulant modifier, sélectionnez recadrer en 3D et délimitez une région d'intérêt afin d'isoler une cellule ou un groupe de cellules.Ensuite, sur le panneau de réglage de l'affichage, sélectionnez un canal. Sélectionnez l'outil de création d'algorithme de dépassement de surfaces. Puis, pour configurer l'algorithme, sélectionnez d'abord un canal.Ensuite, définissez le seuil comme la même valeur minimale configurée dans le panneau de réglage de l'affichage et définissez le redimensionnement si nécessaire. Puis, définissez lissage à 0,200. Sélectionnez le panneau de couleurs et modifiez l'apparence selon les besoins.Répétez la configuration du générateur d’algorithmes pour les surfaces supérieures pour chaque canal. Ensuite, sur le panneau de réglage de l'affichage, désélectionnez les canaux de fluorescence et sélectionnez les trois surfaces. Enfin, déplacez le volume pour trouver la meilleure vue et prenez une capture d'écran afin de déterminer le motif de co-expression des marqueurs de MM.Les protocoles d'immunofluorescence et d'acquisition en microscopie confocale décrits dans cette vidéo ont été réalisés sur un modèle murin d'ischémie focale induite par l'occlusion permanente de l'artère cérébrale moyenne. Une vue en deux dimensions des images acquises montre qu'au bout de 24 heures après l'ischémie, les marqueurs lysosomaux CD68, représentés en vert, sont exprimés dans les cellules hypertrophiques positives pour CD11b, visibles en rouge, présentes dans le noyau ischémique. La projection selon l'axe Z, montrée en bas à droite, démontre que la distribution des marqueurs observée dans la vue en un seul plan est également présente le long de l'axe Z dans la zone frontalière.Les cellules positives pour CD11b présentent des corps cellulaires hypertrophiés avec des prolongements fortement positifs pour CD68, suggérant que les phagosomes sont associés à la membrane cellulaire. Cela indique un comportement acide actif des phagosomes dans les cellules microgliales afin d’évaluer la co-expression de CD68 et de YM1, un marqueur de polarisation M2. Les images fluorescentes ont fait l’objet d’un rendu tridimensionnel.La vue tridimensionnelle des images acquises présentée ici indique la présence de cellules positives pour CD 68, montrées en voxels fluorescents verts, et de cellules positives pour YM one, montrées en voxels fluorescents rouges. Lorsqu'elles sont disposées parallèlement, la superposition peut produire un signal de colocalisation apparaissant en jaune, qui ne reflète pas nécessairement la distance réelle entre les marqueurs. Pour définir la colocalisation.Une vue en plan unique avec des projections de l'axe Z doit être générée en se déplaçant le long de l'axe Z. Rechercher une colocalisation. La projection de l'axe Z est obtenue comme indiqué dans la partie droite et inférieure de cette image.Les voxels fluorescents peuvent être transformés en objets solides par un rendu tridimensionnel associant l'expression d'un marqueur à un corps cellulaire spécifique. Après un grossissement élevé et un rendu 3D, les deux marqueurs semblent appartenir à des cellules différentes qui sont en étroite proximité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un dosage d'immunofluorescence avec plusieurs marqueurs et colorants, ainsi que de la façon d'acquérir et de visualiser correctement des images tridimensionnelles par microscopie confocale.En outre, l'analyse post-traitement décrite peut être utilisée de manière fructueuse pour analyser toute co-expression ou colocalisation au niveau cellulaire, ou dans les cas où des signaux doivent être localisés sélectivement dans différents plans spatiaux.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Traumatisme cérébral aigu est une blessure grave qui n'a pas de traitement adéquat à ce jour. La microscopie multiphotonique permet d'étudier longitudinalement le processus de développement du cerveau de traumatisme aigu et stratégies thérapeutiques sondage chez les rongeurs. Deux modèles de traumatisme cérébral aigu étudié avec in vivo à deux photons imagerie cérébrale sont démontrées dans ce protocole.

Aiguë traumatisme cérébral chez la souris Suivi par longitudinale à deux photons imagerie

L’imagerie intravitale à deux photons peut être utilisée pour étudier les interactions entre différents types de cellules de la moelle épinière dans leur environnement tissulaire natif chez un animal chimérique de moelle osseuse présentant une lésion traumatique par écrasement de la moelle épinière de la colonne dorsale.

Imagerie intravitale de axonales Interactions avec microglie et les macrophages de souris dans une colonne dorsale Crush blessures

Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau qui enquête et réagissent à la physiologie du cerveau altéré par des modifications morphologiques qui peuvent être évalués quantitativement. Ce protocole décrit un ImageJ base protocole d’analyse pour représenter la microglie morphologie comme continue des données selon des indicateurs tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme.

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d'IBA1 et de TMEM119, en plus de l'analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l'infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

L’hémorragie intraparenchymateuse et la neuroinflammation accompagnées d’une contusion cérébrale peuvent déclencher de graves lésions cérébrales secondaires. Ce protocole détaille un modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) chez la souris, permettant aux chercheurs d’étudier l’hémorragie, la contusion et les réponses immunitaires post-traumatiques, et d’explorer des thérapies potentielles.

Un modèle préclinique d’impact cortical contrôlé pour l’hémorragie traumatique, la contusion et la neuroinflammation

Ce protocole présente des méthodes pour caractériser la réponse neuro-inflammatoire et hémodynamique à une lésion cérébrale traumatique légère et pour intégrer ces données dans le cadre d’une analyse des systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés.

Analyse systémique de la réponse neuroinflammatoire et hémodynamique aux lésions cérébrales traumatiques

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Le protocole décrit une lésion cérébrale traumatique légère dans un modèle murin. En particulier, un protocole étape par étape pour induire un léger traumatisme crânien fermé de la ligne médiane et la caractérisation du modèle animal est entièrement expliqué.

Modèle à tête fermée contrôlé électromagnétique de lésion cérébrale traumatique légère chez la souris

Il est difficile d’identifier les microglies (MG) et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) dans les moelles épinières lésées. Dans ce protocole, la cytométrie en flux (FCM) a été utilisée pour identifier respectivement la MG de type M1, la MG de type M2, la Mø de type M1 et la Mø de type M2. Cette technologie peut également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux central pour comprendre le rôle de la MG et de la Mø.

Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide de l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Cette méthode permet un examen détaillé des interactions neuro-immunes et peut être adaptée à l’étude d’autres maladies neurodégénératives, améliorant ainsi notre compréhension des réponses immunitaires dans la pathologie de l’AVC.

Isolement et évaluation par cytométrie en flux des interactions neuro-immunes dans un modèle murin de mini-AVC

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial...

Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Découvrez l'analyse confocale 3D des marqueurs de polarisation microglie/macrophage dans un modèle murin d'ischémie cérébrale. Cette méthode améliore la résolution de l'expression cellulaire pour l'étude de l'inflammation cérébrale.

Trois dimensions d'analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

Explorer plus de vidéos