2.8: Le test ELISA

L’ELISA, ou test immuno-enzymatique, est une méthode largement utilisée pour déterminer la présence ou l’absence d’une protéine cible spécifique.

Via une série d’étapes de lavage et de liaison, un anticorps conjugué, ou lié, à une enzyme reconnaîtra une protéine cible au fond d’une plaque à 96 puits. Lorsque le substrat est ajouté à l’échantillon, une réaction enzymatique se produit, provoquant un changement de couleur qui permet l’identification et la quantification de la protéine cible.

Avant de discuter de la réalisation d’un ELISA, familiarisons-nous avec l’équipement et les réactifs dont vous aurez besoin.

Le réglage d’une réaction ELISA est généralement une plaque à fond plat de 96 puits. Le fond plat des puits facilitera une distribution uniforme de votre échantillon expérimental, ainsi que de vos anticorps de capture et de détection.

Les tests ELISA détectent la présence de protéines cibles spécifiques dans des solutions aqueuses expérimentales. L’urine, les milieux de culture cellulaire et le sérum sont des échantillons expérimentaux courants.

Dans un ELISA, l’anticorps qui se lie directement à la protéine cible est l’anticorps primaire. Il a une affinité élevée, c’est-à-dire une grande capacité à se lier étroitement, pour un épitope - une région spécifique - de la protéine cible. L’anticorps primaire est généralement non marqué ou non conjugué.

Comme nous l’avons mentionné, les anticorps se lient principalement à leurs protéines cibles par le biais d’une liaison à haute affinité à un épitope spécifique. Cependant, l’échantillon expérimental peut contenir des morceaux de cellules qui expriment des sites de liaison non spécifiques, des sites qui peuvent se lier à la région constante ou non spécifique à l’épitope de vos anticorps de détection.

Par conséquent, l’ajout d’un tampon de blocage est essentiel dans un ELISA pour couvrir tous les sites de liaison non spécifiques dans vos échantillons expérimentaux. Sinon, vous risquez d’avoir des réactions enzymatiques se produisant dans des puits qui ne contiennent pas de protéine cible, ce qui vous donne des données faussement positives !

L’anticorps secondaire d’un ELISA est l’anticorps utilisé pour reconnaître l’anticorps primaire. Cet anticorps est généralement conjugué à une enzyme. Parfois, l’anticorps secondaire a un nom funky. Par exemple, si l’anticorps secondaire produit ou est élevé chez un âne pour reconnaître un anticorps primaire élevé chez une chèvre, l’anticorps secondaire serait appelé anticorps anti-chèvre d’âne. Lorsqu’il s’agit de nommer des anticorps secondaires, le premier nom indique l’organisme qui a produit l’anticorps secondaire, et le deuxième nom représente l’organisme qui produit l’anticorps primaire.

Un substrat, qui se lie au site actif de l’enzyme liée à l’anticorps secondaire, sera également nécessaire. La réaction chimique qui se produit au cours de cette réaction provoque un changement de couleur dans le substrat autrement incolore. Ce dosage dit colorimétrique permet d’identifier et de quantifier la présence de la protéine cible.

La réaction enzymatique se poursuivra tant qu’il y aura du substrat disponible. Par conséquent, après une brève période d’incubation, une solution d’arrêt, qui provoque encore un autre changement de couleur pour indiquer que la réaction a en fait été arrêtée, est ajoutée aux puits.

Un lecteur de microplaques sera utilisé pour quantifier la concentration de la protéine d’intérêt dans chaque puits en lisant l’absorbance, c’est-à-dire la quantité de produit coloré, dans chaque puits. L’absorbance est proportionnelle à la quantité de protéine cible présente.

Maintenant que tout votre équipement est prêt, lançons un ELISA !

Pour effectuer un ELISA standard ou direct, enduisez d’abord les puits de la plaque de 96 puits avec la protéine d’intérêt cible diluée dans un tampon d’enrobage. Placez également vos contrôles positifs et négatifs à ce moment-là.

Après avoir incubé la plaque revêtue suffisamment longtemps pour donner à la protéine le temps de s’adsorber complètement, ou de se fixer au bas de la plaque, videz l’excès de solution de revêtement d’un simple mouvement du poignet.

Bloquez ensuite tout signal de liaison ou d’arrière-plan non spécifique en incubant chaque puits dans un tampon de blocage.

Maintenant, videz le tampon de blocage et lavez les puits avec une brève incubation à température ambiante dans une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, et 1 % de BSA.

Pendant que les puits sont rincés avec du PBS, préparez des dilutions d’une concentration connue de la protéine cible pour créer une courbe standard. L’absorbance des puits de courbe standard, qui contiennent des concentrations connues de la protéine cible, sera utilisée pour calculer la concentration de protéine cible dans vos puits d’échantillon expérimentaux en fonction d’une comparaison de l’absorbance des puits d’échantillon à l’absorbance des puits de courbe standard.

Il est maintenant temps d’ajouter la détection ou l’anticorps primaire !

La plaque est ensuite incubée, généralement à température ambiante, pour permettre à une quantité suffisante d’anticorps de se lier à la protéine cible pour une détection et une quantification ultérieures de la protéine.

Après cette incubation, l’excès d’anticorps est éliminé et les puits sont brièvement lavés avec du PBS.

L’anticorps secondaire est ensuite ajouté à la plaque, et la plaque est à nouveau incubée ? Typiquement sur une plate-forme tournante ? pour permettre à l’anticorps secondaire de se lier. Les étapes de lavage sont répétées comme auparavant.

Ensuite, ajoutez le substrat à la plaque pour voir quels puits contiennent votre protéine cible. Couvrez la plaque pour protéger la réaction de la lumière, puis après une brève incubation, arrêtez la réaction avec une solution d’arrêt.

Enfin, placez votre plaque dans le lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance ou la quantité de solution colorée, dans chaque puits. Vous devrez sélectionner les puits que vous souhaitez que le lecteur analyse. Lorsque l’instrument a terminé de lire la plaque, une lecture de l’absorbance de chaque puits s’affiche.

Il est important de noter que chaque kit ELISA a une limite de détection. C’est-à-dire que seules les concentrations de protéines supérieures et inférieures à des limites spécifiques peuvent être déterminées avec précision. De très faibles concentrations de protéines sont généralement trop proches des niveaux de fond de coloration non spécifique, tandis que des concentrations très élevées peuvent indiquer que l’excès de protéines ou d’anticorps n’a pas été correctement éliminé dans cet échantillon.

Alors, pourquoi pourriez-vous effectuer un ELISA ? Jetons un coup d’œil à quelques applications courantes.

Le type d’ELISA le plus courant est probablement l’ELISA sandwich.

Dans un ELISA sandwich, une plaque de 96 puits est d’abord recouverte d’un anticorps primaire qui reconnaît la protéine cible d’intérêt.

Dans cette expérience, des milieux de culture cellulaire récoltés à partir de lignées cellulaires productrices d’anticorps humains ont été plaqués par un système automatisé sur des plaques de 96 puits pré-recouvertes d’un anticorps primaire qui reconnaît les anticorps humains.

Après avoir lavé l’échantillon en excès avec du PBS, un anticorps secondaire lié à une enzyme est ajouté, suivi d’un substrat colorimétrique.

L’absorbance est alors mesurée de la même manière que pour un ELISA typique. Par exemple, dans cette expérience, ces données ELISA seront utilisées pour déterminer quelles lignées cellulaires produisent l’anticorps humain ayant la plus grande affinité pour ? qui est la meilleure capacité à se lier avec précision à ? son antigène cible.

Le test de grossesse en vente libre est un type de sandwich ELISA.

Lorsque l’urine de la femme potentiellement enceinte est ajoutée au test, des anticorps primaires liés à des enzymes attachés au test se lient à l’hormone de grossesse hCG si elle est présente. Si la femme est enceinte, une réaction substrat-enyzme se produira lorsque les anticorps primaires seront reconnus par des anticorps secondaires liés au substrat sur le site d’essai, et une ligne colorée apparaîtra.

Un autre type d’ELISA est l’ELISA compétitif, qui peut être utilisé pour détecter la présence d’anticorps.

Si les anticorps d’intérêt sont présents dans l’échantillon, ils vont se lier à la protéine cible fixée au fond de la plaque. Plus tard, lorsque des anticorps de détection liés à des enzymes sont ajoutés à la plaque, les anticorps liés à des enzymes trouveront peu ou pas de protéines à lier ; Ils auront été « surpassés » par les anticorps d’intérêt dans l’échantillon expérimental.

Dans un ELISA compétitif, les puits colorés indiquent donc les échantillons qui ne contiennent en réalité pas l’anticorps d’intérêt ! Les échantillons de plasma de patients sont généralement analysés dans le cadre d’un test ELISA compétitif afin de déterminer si des anticorps contre certains agents pathogènes, comme le virus VIH, sont présents dans l’échantillon.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la réalisation d’un ELISA. Dans cette vidéo, nous avons examiné : ce qu’est un ELISA et comment il fonctionne ; l’équipement et les réactifs dont vous aurez besoin pour effectuer l’ELISA ; et certaines applications différentes du test. Merci d’avoir regardé, et n’oubliez pas de ne pas laisser votre substrat se surdévelopper !