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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Le test ELISA

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The ELISA Method

2.7: Bacterial Transformation: Electroporation

2.9: Plasmid Purification

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

Un dosage d’immunoadsorption par enzyme lié ELISA (de enzyme-linked immunosorbent assay) est typiquement réalisé pour détecter la présence et/ou la quantité d’une protéine d’intérêt cible dans un échantillon expérimental. La détection de la protéine cible est rendue possible par les anticorps, qui font de l’ELISA un dosage immunologique. A travers une série d’étapes d’incubation et de lavages, ces anticorps, qui sont généralement liés, ou conjugués, à un enzyme, détecteront une protéine adsorbée au fond d’un puit de la microplaque. Lorsqu’il est exposé à un substrat, l’enzyme lié à l’anticorps provoque un changement de couleur, indiquant ainsi la présence de la protéiné d’intérêt dans l’échantillon.

Dans cette vidéo, la théorie derrière comment les ELISAs fonctionnent est expliquée, incluant une discussion sur les liaisons de l’anticorps primaire et secondaire et l’importance des étapes de blocage. La théorie est suivie par la pratique, comme la vidéo passe à l’explication de la procédure pas-à-pas. Finalement, des variations de l’ELISA standard telles que l’ELISA en sandwich et l’ELISA par compétition sont introduites, et les utilisations de cette méthode dans la vie de tous les jours , tel que le test de grossesse en vente libre, sont expliqués.

Procedure

L’ELISA, ou dosage d’immunoadsorption par enzyme lié (de enzyme-linked immunosorbent assay), est une méthode largement utilisée pour la détermination de la présence ou absence d’une protéine cible spécifique.

Via une série d’étapes de lavages et d’attaches, un anticorps conjugué ou lié à un enzyme va reconnaitre une protéine cible au fond d’une plaque à 96 puits. Lorsque du substrat est ajouté à l’échantillon, une réaction enzymatique va avoir lieu, causant un changement de couleur qui permet l’identification et la quantification de la protéine cible.

Avant que nous discutions de comment réaliser une ELISA, familiarisons-nous avec l’équipement et les réactifs dont nous aurons besoin.

Le matériel pour une réaction ELISA est typiquement une plaque à 96 puits à fond plat. Les fonds plats des puits vont faciliter une distribution égale de votre échantillon expérimental, ainsi que l’accrochage et la détection des anticorps.

ELISA détecte la présence de protéines cibles spécifiques dans des solutions aqueuses expérimentales. L’urine, le milieu de culture cellulaire, et le sérum sont des échantillons expérimentaux communs.

Dans une ELISA, l’anticorps qui se lie directement à la protéine cible est l’anticorps primaire. Il a une haute affinité, ce qui veut dire, une haute capacité à se lier fermement, à un épitope – une zone spécifique – de la protéine cible. L’anticorps primaire est habituellement non-labellisé, ou non-conjugué.

Comme mentionné, les anticorps se lient généralement à leurs protéines cible par une liaison de haute affinité à un épitope spécifique. Cependant, l’échantillon expérimental peut contenir des morceaux de cellules qui expriment des sites de liaison non-spécifiques, sites qui peuvent se lier au non-épitope spécifique, qui est une zone des anticorps détecteurs.

Donc, l’ajout d’un tampon de blocage est essentiel dans la procédure ELISA pour recouvrir tout site de liaison non-spécifique dans votre échantillon expérimental. Sinon vous pourrez avoir des réactions enzymatiques apparaissant dans les puits qui ne contiennent pas de protéine cible, vous donnant une donnée faussement positive!

L’anticorps secondaire dans une ELISA est l’anticorps utilisé pour reconnaitre l’anticorps primaire. Cet anticorps est habituellement conjugué à un enzyme. Parfois l’anticorps secondaire a un nom cool. Par exemple, si l’anticorps secondaire est fait, ou élevé, dans un âne pour reconnaitre un anticorps primaire élevé dans une chèvre, l’anticorps secondaire serait appelé un anticorps âne anti-chèvre. Lorsqu’il s’agit de nommer les anticorps secondaires, le premier nom indique l’organisme qui a produit l’anticorps secondaire, et le second nom représente l’organisme qui produit l’anticorps primaire.

Un substrat, qui se lie au site actif de l’enzyme lié à l’anticorps secondaire, sera aussi nécessaire. La réaction chimique qui apparait pendant cette réaction provoque un changement de couleur dans le substrat qui sans cela est incolore. Ce bien nommé test colorimétrique permet l’identification et la quantification de la présence de la protéine cible.

La réaction enzymatique va continuer tant qu’il y a du substrat. Donc, après une brève période d’incubation, une solution d’arrêt, qui provoque encore un autre changement de couleur pour indiquer que la réaction a en effet bien été arrêtée, est ajouté aux puits.

Un lecteur de microplaque sera utilisé pour quantifier la concentration de la protéine d’intérêt dans chaque puit par la lecture de l’absorbance, qui est la quantité de produit coloré, dans chaque puit. L’absorbance est proportionnelle à la quantité de protéine cible présente.

Maintenant que vous avez tout votre équipement prêt, réalisons une ELISA!

Pour réaliser une ELISA standard, ou directe, enduisez d’abord les puits de la plaque à 96 puits avec votre protéine d’intérêt cible diluée dans un tampon d’enrobage. Mettez également dans la paque vos contrôles positif et négatif maintenant.

Après l’incubation de la plaque enduite pendant un temps assez long pour que la protéine puisse adsorber complétement, ou attacher, au fond de la plaque, jetez l’excès de solution d’enrobage avec un mouvement brusque du poignet.

Ensuite bloquez toute liaison non-spécifique possible ou signal de fond en incubant chaque puit dans un tampon de blocage.

Maintenant jetez le tampon de blocage et lavez les puits avec une incubation rapide à température ambiante dans un tampon phosphate salin, ou PBS, et 1% de BSA.

Pendant que les puits sont rincés avec du PBS, préparez les dilutions à concentration connue de la protéine cible pour créer une courbe standard. L’absorbance des puits de la courbe standard, qui contient des concentrations connues de la protéine cible, sera utilisée pour calculer la concentration de la protéine cible dans vos puits d’échantillons expérimentaux sur base de la comparaison de l’absorbance des puits d’échantillon à l’absorbance des puits de la courbe standard.

Maintenant il est temps d’ajouter l’anticorps de détection ou anticorps primaire!

La plaque est ensuite incubée, généralement à température ambiante, pour permettre à un nombre suffisant d’anticorps de se lier à la protéine cible pour la détection et quantification en aval de la protéine.

Après l’incubation, l’anticorps en excès est retiré et les puits sont brièvement lavés avec du PBS.

L’anticorps secondaire est alors ajouté à la plaque, et la plaque est incubée encore une fois – typiquement sur une plateforme rotative – pour permettre à l’anticorps secondaire de se lier. Les étapes de lavage sont répétées comme précédemment.

Ensuite, ajoutez le substrat à la plaque pour voir quels puits contiennent la protéine cible. Couvrez la plaque pour protéger la réaction de la lumière, et après une incubation rapide, arrêtez la réaction avec une solution d’arrêt.

Finalement, placez la plaque dans le lecteur de microplaque pour mesurer l’absorbance ou la quantité de solution colorée, dans chaque puit. Vous devrez sélectionner quels puits vous voulez que le lecteur analyse. Lorsque l’instrument a fini de lire la plaque, une mesure de l’absorbance pour chaque puit s’affichera.

Il est important de noter que chaque kit d’ELISA a une limite de détection. C’est-à-dire que seulement les concentrations en protéine au-dessus et en-dessous des limites spécifiques peuvent être déterminées précisément. Des concentrations très faible en protéine sont généralement trop proche du niveau de coloration non spécifique de fond, tandis que des concentrations très élevées peuvent indiquer que l’excès de protéines ou d’anticorps n’a pas été lavé correctement dans cet échantillon de puits.

Alors, pourquoi devriez-vous réaliser une ELISA? Regardons quelques utilisations communes.

Le type d’ELISA probablement le plus commun est l’ELISA en sandwich.

Dans une ELISA en sandwich, une plaque à 96 puits est d’abord enduite avec un anticorps primaire qui reconnait la protéine d’intérêt cible.

Après le lavage des échantillons en excès par PBS, un anticorps secondaire lié à un enzyme est ajouté, suivi par un substrat colorimétrique.

L’absorbance est alors mesurée de la même manière que pour une ELISA typique. Par exemple, dans cette expérimentation, les données de l’ELISA seront utilisées pour déterminer quelles lignées de cellules produisent l’anticorps humain avec la plus haute affinité pour – qui a la plus grande capacité à se lier précisément à – son antigène cible.

Le test de grossesse en vente libre est un type d’ELISA en sandwich.

Lorsque l’urine de la femme potentiellement enceinte est ajoutée au test, les anticorps primaires à enzyme lié attachés au test vont se lier à l’hormone de grossesse hCG si elle est en présence. Si la femme est enceinte, une réaction enzyme-substrat aura lieu lorsque les anticorps primaires seront reconnus au site de test par les anticorps secondaires liés au substrat, et une ligne colorée va apparaitre.

Un autre type d’ELISA est l’ELISA par compétition, qui peut être utilisé pour détecter la présence d’anticorps.

Si les anticorps d’intérêt sont présents dans l’échantillon, ils vont se lier à la protéine cible attachée au fond de la plaque. Après, lorsque les anticorps détecteurs à enzyme liés sont ajoutés à la plaque, ils vont trouver peu à aucunes protéines pour se lier; ils sont mis “hors compétition” par les anticorps d’intérêt dans l’échantillon expérimental.

Dans une ELISA par compétition, de ce fait, les puits colorés indiquent les échantillons qui ne contiennent pas l’anticorps d’intérêt. Les échantillons de plasma de patients sont typiquement analysés par ELISA par compétition en vue de déterminer si les anticorps pour certains pathogènes, comme le virus VIH, sont présents dans l’échantillon.

Vous venez de visionner l’introduction de JoVE à la réalisation d’une ELISA. Dans cette vidéo nous avons vu: ce qu’est une ELISA et comment elle fonctionne; quels équipement et réactifs vous avez besoin pour réaliser une ELISA; et quelques utilisations différentes de cette analyse. Merci de nous avoir regardé, et souvenez-vous de ne pas laisser votre substrat se surdévelopper!

Transcript

The ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a widely used method for determining the presence or absence of a specific target protein.

Via a series of washing and binding steps, an antibody conjugated, or linked, to an enzyme will recognize a target protein at the bottom of a 96-well plate. When substrate is added to the sample, an enzymatic reaction will occur, causing a color change that allows the identification and quantification of the target protein.

Before we discuss how to perform an ELISA, let’s get familiar with the equipment and reagents that you will need.

The setting for an ELISA reaction is typically a 96-well flat bottom plate. The flat bottoms of the wells will help facilitate an even distribution of your experimental sample, as well as your capture and detection antibodies.

ELISAs detect the presence of specific target proteins in experimental aqueous solutions. Urine, cell culture media, and serum are common experimental samples.

In an ELISA, the antibody that directly binds to the target protein is the primary antibody. It has high affinity, that is, a high ability to bind tightly, for an epitope – a specific region – of the target protein. The primary antibody is usually unlabeled, or un-conjugated.

As mentioned, antibodies mostly bind to their target proteins through high affinity binding to a specific epitope. However, the experimental sample may contain pieces of cells that express nonspecific binding sites, sites that can bind the constant, or non-epitope specific, region of your detector antibodies.

Therefore, addition of a blocking buffer is essential in an ELISA to cover any nonspecific binding sites in your experimental samples. Otherwise you may have enzymatic reactions occurring in wells that do not contain target protein, giving you false positive data!

The secondary antibody in an ELISA is the antibody used to recognize the primary antibody. This antibody is usually conjugated to an enzyme. Sometimes the secondary antibody has a funky name. For example, if the secondary antibody made, or raised, in a donkey to recognize a primary antibody raised in a goat, the secondary antibody would be called a donkey anti-goat antibody. When it comes to naming secondary antibodies, the first name indicates the organism that produced the secondary antibody, and the second name represents the organism that produces the primary antibody.

A substrate, which binds to the active site of the enzyme linked to the secondary antibody, will also be needed. The chemical reaction that occurs during this reaction causes a color change in the otherwise-colorless substrate. This so-called colorimetric assay allows the identification and quantification of the presence of the target protein.

The enzymatic reaction will continue as long as there is available substrate. Therefore, after a brief incubation period, a stop solution, which causes yet another color change to indicate the reaction has in fact been halted, is added to the wells.

A microplate reader will be used to quantify the concentration of the protein of interest in each well by reading the absorbance, that is, the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the amount of target protein present.

Now that you have all your equipment ready, let’s run an ELISA!

To perform a standard, or direct, ELISA, first coat the wells of the 96-well plate with your target protein of interest diluted in coating buffer. Plate your positive and negative controls at this time as well.

After incubating the coated plate long enough to give the protein time to completely adsorb, or attach, to the bottom of the plate, dump off the excess coating solution with a quick flick of your wrist.

Then block any possible non-specific binding or background signal by incubating each well in blocking buffer.

Now dump off the blocking buffer and wash the wells with a brief room temperature incubation in phosphate buffered saline, or PBS, and 1% BSA.

While the wells are being rinsed with PBS, prepare dilutions of a known concentration of the target protein to create a standard curve. The absorbance of the standard curve wells, which contain known concentrations of the target protein, will be used to calculate the concentration of target protein in your experimental sample wells based on a comparison of the absorbance of the sample wells to the absorbance of the standard curve wells.

Now it’s time to add the detection or primary antibody!

The plate is then incubated, usually at room temperature, to allow a sufficient amount of antibody to bind to the target protein for later detection and quantification of the protein.

After this incubation, excess antibody is removed and the wells are briefly washed with PBS.

Secondary antibody is then added to the plate, and the plate is once again incubated – typically on a rotating platform – to allow secondary antibody to bind. Washing steps are repeated as before.

Next, add the substrate to the plate to see which wells contain your target protein. Cover the plate to protect the reaction from light, and then after a brief incubation, halt the reaction with stop solution.

Finally, place your plate in the microplate reader to measure the absorbance or amount of colored solution, in each well. You will need to select which wells you want the reader to analyze. When the instrument is finished reading the plate, a readout of the absorbance for each well will be displayed.

It is important to note that each ELISA kit has a detection limit. That is, only protein concentrations above and below specific limits can be accurately determined. Very small concentrations of protein are usually too close to the background levels of non-specific staining, while very high concentrations may indicate that excess protein or antibody was not properly washed away in that sample well.

So why might you perform an ELISA? Let’s take a look at a few common applications.

Probably the most common type of ELISA performed is the sandwich ELISA.

In a sandwich ELISA, a 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein of interest.

In this experiment, cell culture media harvested from human antibody-producing cell lines, were plated by an automated system onto 96-well plates pre-coated with a primary antibody that recognizes human antibodies.

After washing away the excess sample with PBS, an enzyme-linked secondary antibody is added, followed by a colorimetric substrate.

The absorbance is then measured in the same way as for a typical ELISA. For example, in this experiment, this ELISA data will be used to determine which cell lines produce the human antibody with the highest affinity for – that is best ability to bind accurately to – its target antigen.

The over-the-counter pregnancy test is one type of sandwich ELISA.

When the potentially pregnant woman’s urine is added to the test, enzyme-linked primary antibodies attached to the test will bind the pregnancy hormone hCG if it is present. If the woman is pregnant, a substrate-enyzme reaction will occur when the primary antibodies are recognized by substrate-bound secondary antibodies at the test site, and a colored line will appear.

Another type of ELISA is the competitive ELISA, which can be used to detect the presence of antibodies.

If the antibodies of interest are present in the sample, they will bind to the target protein attached to the bottom of the plate. Later, when enzyme-linked detection antibodies are added to the plate, the enzyme-linked antibodies will find few to no proteins to bind; they will have been “out-competed” by the antibodies of interest in the experimental sample.

In a competitive ELISA, then, the colored wells indicate the samples that actually do not contain the antibody of interest! Patient plasma samples are typically run in a competitive ELISA in order to determine if antibodies for certain pathogens, like the HIV virus, are present in the sample.

You’ve just watched JoVE introduction to performing an ELISA. In this video we reviewed: what an ELISA is and how it works; what equipment and reagents you will need to perform and ELISA; and some different applications of the assay. Thanks for watching, and remember not to let your substrate overdevelop!