Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des hépatocytes humains à l'aide d'une perfusion au collagénase en deux étapes. Cette opération est réalisée en canulant d'abord les vaisseaux sanguins d'un fragment de foie à l'aide d'une canule d'irrigation. Cette étape est suivie par la perfusion et la digestion du fragment de foie à l'aide de collagénase.

La troisième étape consiste à retirer la capsule glisténoïde, ce qui libère les cellules hépatiques dissociées. La dernière étape est une centrifugation à faible vitesse permettant d'isoler les hépatocytes. Enfin, les hépatocytes peuvent être identifiés par microscopie à contraste de phase ou par coloration de l'albumine à l'aide d'immunocytochimie, la viabilité et le rendement des hépatocytes étant déterminés par un test d'exclusion au bleu de tripan.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de canulation et de digestion sont difficiles à apprendre. En effet, la canulation exige une certaine habileté, et il peut être difficile d'identifier la fin de la digestion. Pour les personnes novices dans cette technique, la procédure sera démontrée par Natalie Lun, technicienne de mon laboratoire.

Dans cette démonstration, nous utiliserons un morceau de foie de mouton à la place d’un prélèvement humain. Préparez le matériel nécessaire à la perfusion du fragment hépatique comme suit : réglez le bain-marie à une température appropriée afin que les solutions atteignent 37 degrés Celsius au niveau du foie. Une température de 41 degrés Celsius convient pour les solutions une, deux et trois ; toutefois, pour la solution quatre destinée au condenseur en verre à double enveloppe, la température doit être de 37 degrés Celsius afin de réduire la perte d’activité de la collagénase. Peu de temps avant la perfusion, mettez en marche le régulateur de gaz pour l’appareil d’oxygénation. À partir d’un prélèvement effectué par un médecin légiste, obtenez un fragment de foie qui, de préférence, possède une capsule de Glisson majoritairement ou entièrement intacte et une seule surface tranchée.

Ce morceau de foie placé sur l'entonnoir de Buchner, qui contient un disque filtrant perforé, doit maintenant être amorcé avec la solution n°1 à l'aide d'une canule d'irrigation courbe insérée à débit faible, équipée d'extrémités en olive, dans les vaisseaux sanguins les plus gros de la surface coupée du morceau de foie. Au fur et à mesure que le sang est expulsé du foie, le tissu devient plus clair dans les zones correctement perfusées. Le nombre de canules utilisées varie selon la taille des foies.

En général, quatre à huit canules doivent être utilisées pour des foies dont la masse varie de moins de 20 grammes à plus de 80 grammes. Choisissez le calibre de la canule afin d'obtenir un ajustement étroit et sécurisé. Laissez les plus petits vaisseaux sanguins ouverts pour permettre au tampon de s'écouler du tissu.

Maintenant, augmentez le débit de la pompe péristaltique entre 110 et 460 millilitres par minute. Une bonne perfusion se traduit par une coloration plus claire du fragment de foie tout au long du débit utilisé. Cela dépend de la taille du foie, des débits de perfusion plus élevés étant utilisés pour les foies plus volumineux.

En général, une vitesse moyenne de perfusion de 44 millilitres par minute et par canule est idéale pour une gamme de poids hépatiques différents. Le débit choisi doit entraîner un léger gonflement du fragment hépatique. Maintenez le fragment hépatique humide pendant la perfusion en le recouvrant d’un morceau de gaze imbibé de sérum physiologique.

Après avoir perfusé le tissu avec un litre de solution, afin d'éliminer tout sang résiduel dans le fragment de foie, changer le liquide de perfusion pour la solution deux et perfuser pendant 10 minutes. Ensuite, passer au liquide de perfusion numéro trois et perfuser avec un demi-litre.

Changer maintenant le liquide de perfusion par la solution quatre, qui contient de la collagénase. Effectuer cette perfusion de manière circulante pendant neuf à douze minutes ou jusqu'à ce que le foie soit suffisamment digéré. Le tissu hépatique doit sembler se fragmenter légèrement sous la capsule brillante.

Le foie doit également sembler ramolli lorsqu'il est sondé avec la face émoussée d'un scalpel. Il est important de digérer le morceau de foie pendant la durée appropriée, car une sur-digestion peut entraîner une faible viabilité des hépatocytes, tandis qu'une sous-digestion peut conduire à un faible rendement en hépatocytes. Commencez par arrêter la pompe péristaltique et retirer la canule du morceau de foie.

Ensuite, placer le tissu dans un cristallisoir contenant de 100 à 200 millilitres de solution cinq. Retirer soigneusement la capsule brillante et secouer doucement pour en extraire les cellules. S'il existe des régions mal perfusées, un scalpel peut être utilisé pour inciser ces régions et libérer les cellules qu'elles contiennent.

Ajoutez davantage de solution cinq selon les besoins au cours du processus, puis portez finalement le volume de la solution cinq à 500 millilitres. Filtrez maintenant la suspension cellulaire deux fois. Commencez par filtrer les cellules à travers un tamis en nylon de 210 microns dans un flacon conique d’un litre.

Ensuite, filtrer les cellules à travers un tamis en nylon de 70 microns dans un flacon conique d'un litre. Verser deux volumes égaux de la suspension cellulaire dans des tubes de centrifugation de 200 millilitres. Puis centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 72 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le surnageant et redisperser délicatement le culot cellulaire dans environ 200 millilitres de solution F. Répétez la centrifugation et la redispersion trois fois ; après la dernière centrifugation, redisperser les cellules dans la solution de conservation froide pour obtenir une concentration finale de deux à 5 millions d'hépatocytes par millilitre. Un dosage au bleu de tripan peut être utilisé pour mesurer précisément le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ici sont montrés des hépatocytes colorés au bleu de trypan issu de 648 isolations. La viabilité moyenne des hépatocytes humains isolés était de 77 ± 10 %. Le rendement moyen d'hépatocytes était de 13 ± 11 millions d'hépatocytes par gramme de foie, déterminé par immunofluorescence. Les hépatocytes isolés qui se coloraient positivement à l'albumine en vert présentaient une pureté de 94 ± 1 %, permettant ainsi de déterminer la pureté des hépatocytes.

La coloration immunofluorescente a été réalisée quatre fois avec cinq réplicats par essai. La microscopie en contraste de phase montre les caractéristiques morphologiques des hépatocytes, telles que leur grande taille cellulaire et leur forme polygonale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les hépatocytes humains à l'aide d'une procédure de perfusion au collagénase en deux étapes.